作為一類(lèi)新型抗微生物劑的四分枝肽和類(lèi)似物及其制備
【專(zhuān)利說(shuō)明】作為一類(lèi)新型抗微生物劑的四分枝肽和類(lèi)似物及其制備 發(fā)明領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及具有抗微生物特性（特別是抗真菌特性）的四聚體形式的肽。本發(fā)明 還涉及制造這些四聚肽的方法。本發(fā)明還涉及這些多聚體用于抑制微生物（特別是真菌） 生長(zhǎng)的用途。本發(fā)明進(jìn)一步涉及包含這些四聚肽的組合物。
[0002] 發(fā)明背景
[0003] 抗真菌劑用于抑制真菌生長(zhǎng)和/或殺死真菌（殺真菌劑）。例如，抗真菌藥物是用 于在患者（尤其是免疫系統(tǒng)遭到削弱的患者）中治療由真菌引起的感染和預(yù)防真菌感染發(fā) 生的藥物。在美國(guó)，致病性真菌感染是感染相關(guān)性死亡中第七常見(jiàn)的原因。實(shí)際上，近期的 調(diào)查提示真菌疾病正對(duì)全球生物區(qū)構(gòu)成日益增長(zhǎng)的威脅。
[0004] 與抗細(xì)菌藥物相比，可用的抗真菌劑的數(shù)目有限，因?yàn)檎婢械某Ｓ盟幬锇袠?biāo)與 人體中的相似分子類(lèi)型同源，后者可能也受到抑制?？拐婢鷦┑睦影ǘ嘞?、唑、烯丙胺、 氟胞喃啶（fluocytosine)和棘球白素（echniocandin)(圖9)。此外，近期的報(bào)告表明真菌 對(duì)現(xiàn)有抗真菌劑的抗性的發(fā)生率日益增加。
[0005] 眼的真菌感染（例如真菌性角膜炎或角膜霉菌病）在熱帶氣候中常見(jiàn)。在發(fā)達(dá)國(guó) 家，隱形眼鏡或眼鏡護(hù)理液的使用是真菌性角膜炎的主要風(fēng)險(xiǎn)因素。自從第一次報(bào)道隱形 眼鏡相關(guān)真菌性角膜炎，一些國(guó)家記錄了眼部真菌病原體感染的發(fā)?。▓D10)。對(duì)于真菌性 角膜炎，那他霉素是僅有的美國(guó)FDA批準(zhǔn)的眼科抗真菌劑
[0006] 真菌中抗藥性的出現(xiàn)連同免疫受損患者數(shù)目的增加已限制臨床醫(yī)師的治療選項(xiàng)， 并凸顯了對(duì)新類(lèi)型的抗真菌劑的需要。
[0007] 因此，需要開(kāi)發(fā)特別適合作為抗真菌劑的抗微生物劑，所述抗真菌劑具有廣譜，適 于多種用途，尤其是眼部感染的治療，優(yōu)選對(duì)真菌形成抗性能復(fù)原。
[0008] 發(fā)明概沐
[0009] 根據(jù)第一方面，本發(fā)明涉及一種包含式[(RGRKVVRR)2K]2KKi的分離的肽四聚體 或一種具有初始肽單體（RGRKVVRR)的肽四聚體[(RGRKVVRR)2K]2KKi的分離的肽四聚體 衍生物；包含至少1處氨基酸替代、至少1處氨基酸刪除、至少1個(gè)肽單體與初始肽單 體相比的重排和/或至少一個(gè)肽單體中與初始肽單體相比的至少一處非蛋白質(zhì)發(fā)生性 (non-proteogenic)氨基酸修飾；其中i= 0或1〇
[0010] 本發(fā)明還涉及此處描述的分離的肽四聚體衍生物或分離的肽四聚體的用途。
[0011] 本發(fā)明還包括制備此處描述的分離的肽衍生物或分離的肽四聚體的方法。
[0012] 附圖簡(jiǎn)沐
[0013] 圖1 :單體、線性反向二聚體（retrodimer)、肽二聚體B2088、肽四聚體B4010、亂序 B4010 (scrambled B4010)和那他霉素的結(jié)構(gòu)。
[0014] 圖2 :B4010介導(dǎo)的對(duì)白色假絲酵母（C. albicans) (A)ATCC 10231和⑶臨床隔離 群DF2672R的殺傷的動(dòng)力學(xué)。將2xl06個(gè)細(xì)胞與指定濃度的B4010、兩性霉素B和那他霉素 一起溫育。在指定時(shí)間點(diǎn)將樣品的小樣鋪在SDA上，并測(cè)定細(xì)胞存活力。
[0015] 圖3 :B4010在金屬離子和復(fù)雜生物學(xué)流體存在下的抗真菌特性。（A)在單價(jià)和二 價(jià)金屬離子存在下測(cè)定的MIC值。條上方的數(shù)字指示測(cè)定的MIC值。（B)B4010在金屬離子 存在下的殺假絲酵母特性。B4010的濃度為5. 5 yM。（C)在胰蛋白酶存在下的抗真菌活性 (胰蛋白酶：B4010 = 1:100)。（D)B4010在50%家兔淚液存在下的殺假絲酵母活性。
[0016] 圖4 :B4010的毒性和角膜上皮重形成速率。（A)B4010和多烯抗真菌劑（那他霉 素和兩性霉素B)對(duì)4%家兔紅血細(xì)胞的溶血毒性。（B)B4010和多烯抗真菌劑對(duì)人角膜上 皮（HCE)細(xì)胞的細(xì)胞毒性。（C)B4010對(duì)新西蘭白色家兔角膜上皮重形成的影響，通過(guò)熒光 染色測(cè)量。肽濃度為22 y M。
[0017] 圖5 :B4010對(duì)白色假絲酵母細(xì)胞質(zhì)膜電位、膜通透性和形態(tài)的影響。（A) SDS-PAGE，顯示B4010對(duì)真菌細(xì)胞壁多糖、幾丁質(zhì)缺乏親和力。（B)由不同濃度的B4010 誘導(dǎo)的白色假絲酵母SYT0X綠攝取。（C)B4010介導(dǎo)的膜去極化，通過(guò)diSC35測(cè)定法監(jiān)測(cè)。 (D)B4010誘導(dǎo)的白色假絲酵母細(xì)胞外ATP釋放。插圖顯示ATP釋放的動(dòng)力學(xué)。B4010濃度 為5. 5yM。（E)未處理的白色假絲酵母的SEM。比例尺為2ym(插圖比例尺= 200nm)。（F) 用5. 5yM B4010處理的白色假絲酵母的SEM圖像。比例尺為lym(插圖比例尺=100nm)。
[0018] 圖6:多種添加劑對(duì)B4010的殺假絲酵母和膜通透特性的影響。（A)CCCP和似隊(duì)對(duì) 膜電位的影響。（B)多種添加劑對(duì)（B)存活力和（C)ATP釋放的影響。（D)離子通道抑制劑 對(duì)膜電位的影響。箭指示添加劑的添加時(shí)間。
[0019] 圖7 :B4010與哺乳動(dòng)物和真菌模型膜的相互作用。（A)添加B4010和亂序B4010 之后，鈣黃綠素從PC:PE:PS:麥角固醇的SUV釋放的時(shí)間過(guò)程。（B)鈣黃綠素從PC:膽固醇 SUV釋放的時(shí)間過(guò)程。肽：脂比在圖中指出。
[0020] 圖 8 :PBS(pH = 7. 0)中 B4010 和亂序 B4010 的 CD 光譜。
[0021] 圖9:目前抗真菌劑的例子。
[0022] 圖10 :2007-2012年眼部真菌病原體調(diào)查。
[0023] 宙義
[0024] 非蛋白質(zhì)發(fā)生性氨基酸指在天然發(fā)生的蛋白質(zhì)中正常情況下在它們的序列中找 不到的氨基酸，天然發(fā)生的蛋白質(zhì)典型地由20種標(biāo)準(zhǔn)氨基酸的不同成員和組合構(gòu)成。
[0025] 受保護(hù)的氨基酸意指有保護(hù)基團(tuán)連接到羧基或胺基團(tuán)任一，保護(hù)該基團(tuán)從而允許 只以羧基或氨基形成肽鍵但不允許以二者形成肽鍵的氨基酸。若胺基團(tuán)受保護(hù)，則僅有羧 基可供與另一個(gè)胺基團(tuán)形成肽鍵。若羧基受保護(hù)，則僅有胺基團(tuán)可供與另一個(gè)羧基形成肽 鍵。多肽的末端胺基團(tuán)或末端羧基可以類(lèi)似地受保護(hù)，從而僅能從羧末端或胺末端形成肽 鍵。
[0026] 發(fā)明詳沐
[0027] 本發(fā)明涉及一種包含式[(RGRKVVRR)2K]2KKi的分離的肽四聚體或一種具有初始 肽單體（RGRKVVRR)的肽四聚體[(RGRKVVRR)2K]2KKi的分離的肽四聚體衍生物；包含至少 1處氨基酸替代、至少1處氨基酸刪除、至少1個(gè)肽單體與初始肽單體相比的重排和/或 至少一個(gè)肽單體中與初始肽單體相比的至少一處非蛋白質(zhì)發(fā)生性氨基酸修飾；其中i= 〇 或1。而且，任何2個(gè)、3個(gè)或全部肽單體可用至少1處氨基酸替代、至少1處氨基酸刪除、 肽單體的重排和/或至少1處非蛋白質(zhì)發(fā)生性氨基酸修飾來(lái)修飾。初始肽單體的序列是 RGRKVVRR(SEQIDN0:l)〇
[0028] 若i = 0,則分離的肽四聚體是[(RGRKWRR)2K]2K。
[0029] 若i=1，則分離的肽四聚體是[(rgrkwrr)2k]2kk。
[0030] 分離的肽四聚體可以衍生自（RGRKVVRR) 2K] 2K或者是[(RGRKVVRR) 2K] 2KK。
[0031] 分離的肽四聚體衍生物具有式[(肽）2K]2KK。
[0032] 具體而言，分離的肽四聚體衍生物是以如下結(jié)構(gòu)分枝的：
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種包含式[RGRKVVRR) 2K]2KKi的分離的肽四聚體或一種具有初始肽單體 (RGRKVVRR)的肽四聚體[(RGRKVVRR) 2IC2KKi的分離的肽四聚體衍生物；包含至少1處氨基 酸替代、至少1處氨基酸刪除、至少1個(gè)肽單體與初始肽單體相比的重排和/或至少一個(gè)肽 單體中與初始肽單體相比的至少一處非蛋白質(zhì)發(fā)生性（non-prot