專(zhuān)利名稱(chēng)：延伸的胰高血糖素樣肽－1類(lèi)似物的制作方法
大量的臨床前期和臨床研究數(shù)據(jù)表明，胰高血糖素-樣肽-1(GLP-1)展現(xiàn)出用于治療非胰島素依賴(lài)型糖尿病(NIDDM)特別是在口服制劑不能奏效時(shí)使用的巨大前景。GLP-1能誘導(dǎo)多種生物學(xué)效應(yīng)，如刺激胰島素分泌，抑制胰高血糖素分泌，抑制胃腸排空，增強(qiáng)葡萄糖利用，并且誘導(dǎo)體重下降。另外，臨床前研究表明，GLP-1還能起著預(yù)防胰腺β細(xì)胞損傷的作用，這種損傷是隨著疾病的發(fā)展而出現(xiàn)的。也許GLP-1的最突出的特征，是它的刺激胰島素分泌而又沒(méi)有相關(guān)的低血糖癥危險(xiǎn)的能力，低血糖癥是在使用胰島素治療或通過(guò)增強(qiáng)胰島素表達(dá)而起作用的某些類(lèi)型口服治療的情況下出現(xiàn)的。隨著NIDDM的發(fā)展，獲得接近正常的血糖控制，并因此減少與長(zhǎng)期高血糖癥相關(guān)的并發(fā)癥就變得極其重要。GLP-1將成為選擇的藥物。不過(guò)，涉及GLP-1肽的治療用途一直受到以下事實(shí)的限制GLP-1(1-37)的活性較差，并且，兩種天然存在的截短的肽GLP-1(7-37)OH和GLP-1(7-36)NH2在體內(nèi)會(huì)被迅速清除，并且在體內(nèi)具有極短的半衰期。
另外，目前開(kāi)發(fā)的GLP-1肽不能口服使用，并且像胰島素那樣，必須注射。因此，盡管存在與涉及GLP-1治療相關(guān)的明顯的醫(yī)學(xué)優(yōu)點(diǎn)，它的短的半衰期，導(dǎo)致了每天必須一次或多次注射藥物，這妨礙了商業(yè)化開(kāi)發(fā)的努力。
已知的是，內(nèi)源產(chǎn)生的二肽基-肽酶IV(DPP-IV)通過(guò)除去N-末端組氨酸和丙氨酸殘基，使循環(huán)的GLP-1肽失活，并且是它具有短的體內(nèi)半衰期的主要原因。因此，最近的努力一直集中在開(kāi)發(fā)能抗DPP-IV降解的GLP-1肽。某些這樣的抗性肽在N-末端具有修飾(參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,705,483)，并且某些是衍生化的GLP-1肽，其中，將能阻止DPP-IV接近所述肽的N-末端的大的?；B接在各種氨基酸上(參見(jiàn)WO 98/08871)。
不過(guò)，本發(fā)明提供了開(kāi)發(fā)能在血清中長(zhǎng)時(shí)間存在的，具有生物學(xué)活性的GLP-1肽的不同的方法。本發(fā)明的GLP-1肽是GLP-1(7-37)的類(lèi)似物，其中，將各種氨基酸添加在所述類(lèi)似物的C-末端。所述延伸的GLP-1肽不僅具有比天然分子長(zhǎng)得多的血清半衰期，而且特別適合口服和通過(guò)肺施用，因?yàn)樗鼈兡芸勾嬖谟谖浮⒛c道和肺中的各種蛋白水解酶。另外，很多這樣的延伸的GLP-1肽，比天然分子更有效。這樣，提高了與對(duì)各種蛋白酶的抗性相關(guān)的效力，有利于與有限的生物利用度相關(guān)的送遞技術(shù)的應(yīng)用。因此，本發(fā)明使得非注射治療成為可能。這種治療涉及送遞節(jié)省成本的量的生物活性GLP-1肽，以便獲得治療性血清含量。
業(yè)已發(fā)現(xiàn)，在與延伸的C-末端偶聯(lián)的各種位置上具有修飾的多種GLP-1肽，與諸如Val8-GLP-1(7-37)OH的某些DPP-IV抗性GLP-1分子相比具有提高了的穩(wěn)定性。很多這樣的延伸的Val8-GLP-1(7-37)OH肽同樣更有效。
本發(fā)明的一種實(shí)施方案是包括式1的氨基酸序列(SEQ ID NO1)的GLP-1肽Xaa7-Xaa8-Glu-Gly-Thr-Xaa12-Thr-Ser-Asp-Xaa16-Ser-Xaa18-Xaa19-Xaa20-Glu-Xaa22-Gln-Ala-Xaa25-Lys-Xaa27-Phe-Ile-Xaa30-Trp-Leu-Xaa33-Xaa34-Gly-Xaa36-Xaa37-Xaa38-Xaa39-Xaa40-Xaa41-Xaa42-Xaa43-Xaa44-Xaa45-Xaa46-Xaa47-Xaa48-Xaa49-Xaa50式1(SEQ ID NO1)其中Xaa7是L-組氨酸，D-組氨酸，脫氨基-組氨酸，2-氨基-組氨酸，β-羥基-組氨酸，高組氨酸，α-氟甲基-組氨酸，或α-甲基-組氨酸；Xaa8是Ala，Gly，Val，Leu，Ile，Ser，或Thr；Xaa12是Phe，Trp，或Tyr；Xaa16是Val，Trp，Ile，Leu，Phe，或Tyr；Xaa18是Ser，Trp，Tyr，Phe，Lys，Ile，Leu，Val；Xaa19是Tyr，Trp，或Phe；Xaa20是Leu，Phe，Tyr，或Trp；Xaa22是Gly，Glu，Asp，或Lys；Xaa25是Ala，Val，Ile，或Leu；Xaa27是Glu，Ile，或Ala；Xaa30是Ala或Glu
Xaa33是Val或Ile；Xaa34是Lys，Asp，Arg，或Glu；Xaa36是Gly，Pro，或Arg；Xaa37是Gly，Pro，或Ser；Xaa38是Ser，Pro，或His；Xaa39是Ser，Arg，Thr，Trp，或Lys；Xaa40是Ser或Gly；Xaa41是Ala，Asp，Arg，Glu，Lys，或Gly；Xaa42是Pro，Ala，NH2，或不存在；Xaa43是Pro，Ala，NH2，或不存在；Xaa44是Pro，Ala，Arg，Lys，His，NH2，或不存在；Xaa45是Ser，His，Pro，Lys，Arg，Gly，NH2或不存在；Xaa46是His，Ser，Arg，Lys，Pro，Gly，NH2或不存在；且Xaa47是His，Ser，Arg，Lys，NH2或不存在；Xaa48是Gly，His，NH2或不存在；Xaa49是Pro，His，NH2或不存在；以及Xaa50是Ser，His，Ser-NH2，His-NH2或不存在；其前提是，如果Xaa42，Xaa43，Xaa44，Xaa45，Xaa46，Xaa47，Xaa48，或Xaa49不存在，每一個(gè)下游氨基酸也是不存在的，并且其前提還是，如果Xaa36是Arg，并且Xaa37是Gly或Ser，GLP-1肽不具有以下始于Xaa38的C-末端氨基酸延伸Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH2。
本發(fā)明的另一種實(shí)施方案是包括式2的氨基酸序列(SEQ ID NO2)的GLP-1肽Xaa7-Xaa8-Glu-Gly-Thr-Xaa12-Thr-Ser-Asp-Xaa16-Ser-Xaa18-Xaa19-Xaa20-Glu-Xaa22-Gln-Ala-Xaa25-Lys-Xaa27-Phe-Ile-Xaa30-Trp-Leu-Xaa33-Xaa34-Gly-Xaa36-Xaa37-Xaa38-Xaa39-Xaa40-Xaa41-Xaa42-Xaa43-Xaa44-Xaa45-Xaa46-Xaa47式2(SEQ ID NO2)其中Xaa7是L-組氨酸，D-組氨酸，脫氨基-組氨酸，2-氨基-組氨酸，β-羥基-組氨酸，高組氨酸，α-氟甲基-組氨酸，或α-甲基-組氨酸；Xaa8是Ala，Gly，Val，Leu，Ile，Ser，或Thr；Xaa12是Phe，Trp，或Tyr；Xaa16是Val，Trp，Ile，Leu，Phe，或Tyr；Xaa18是Ser，Trp，Tyr，Phe，Lys，Ile，Leu，Val；Xaa19是Tyr，Trp，或Phe；Xaa20是Leu，Phe，Tyr，或Trp；Xaa22是Gly，Glu，Asp，或Lys；Xaa25是Ala，Val，Ile，或Leu；Xaa27是Glu，Ile，或Ala；Xaa30是Ala或GluXaa33是Val或Ile；Xaa34是Lys，Asp，Arg，或Glu；Xaa36是Gly，Pro，或Arg；Xaa37是Gly，Pro，或Ser；Xaa38是Ser，Pro，或His；Xaa39是Ser，Arg，Thr，Trp，或Lys；Xaa40是Ser或Gly；Xaa41是Ala，Asp，Arg，Glu，Lys，或Gly；Xaa42是Pro，Ala，NH2，或不存在；Xaa43是Pro，Ala，NH2，或不存在；Xaa44是Pro，Ala，Arg，Lys，His，NH2，或不存在；Xaa45是Ser，His，Pro，Lys，Arg，NH2或不存在；Xaa46是His，Ser，Arg，Lys，NH2或不存在；以及Xaa47是His，Ser，Arg，Lys，NH2或不存在；其前提是，如果Xaa42，Xaa43，Xaa44，Xaa45，Xaa46，或Xaa47不存在，每一個(gè)下游氨基酸也是不存在的，并且其前提還是，如果Xaa36是Arg，并且Xaa37是Gly或Ser，GLP-1肽不具有以下從Xaa38開(kāi)始延伸的C-末端氨基酸Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH2。
本發(fā)明的另一種實(shí)施方案是包括式3的氨基酸序列(SEQ ID NO3)的延伸的GLP-1肽
Xaa7-Xaa8-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Xaa16-Ser-Ser-Tyr-Lys-Glu-Xaa22-Gln-Ala-Xaa25-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Xaa33-Xaa34-Gly-Xaa36-Xaa37-Xaa38-Xaa39-Xaa40-Xaa41-Xaa42-Xaa43-Xaa44-Xaa45-Xaa46-Xaa47式3(SEQ ID NO3)其中Xaa7是L-組氨酸，D-組氨酸，脫氨基-組氨酸，2-氨基-組氨酸，β-羥基-組氨酸，高組氨酸，α-氟甲基-組氨酸，或α-甲基-組氨酸；Xaa8是Gly，Val，Leu，Ile，Ser，或Thr；Xaa16是Val，Trp，Ile，Leu，Phe，或Tyr；Xaa22是Gly，Glu，Asp，或Lys；Xaa25是Ala，Val，Ile，或Leu；Xaa33是Val或Ile；Xaa34是Lys，Asp，Arg，或Glu；Xaa36是Gly，Pro，或Arg；Xaa37是Gly，Pro，或Ser；Xaa38是Ser，Pro，或His；Xaa39是Ser，Arg，Thr，Trp，或Lys；Xaa40是Ser或Gly；Xaa41是Ala，Asp，Arg，Glu，Lys，或Gly；Xaa42是Pro或Ala；Xaa43是Pro或Ala；Xaa44是Pro，Ala，Arg，Lys，His，NH2，或不存在；Xaa45是Ser，His，Pro，Lys，Arg，NH2或不存在；Xaa46是His，Ser，Arg，Lys，NH2或不存在；以及Xaa47是His，Ser，Arg，Lys，NH2或不存在；其前提是，如果Xaa44，Xaa45，Xaa46，或Xaa47不存在，每一個(gè)下游氨基酸也是不存在的，并且其前提還是，如果Xaa36是Arg，并且Xaa37是Gly或Ser，GLP-1肽不具有以下始于Xaa38的C-末端延伸的氨基酸Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH2。
本發(fā)明的另一種實(shí)施方案是包括式4的氨基酸序列(SEQ ID NO4)的延伸的C-末端氨基酸序列的GLP-1肽Xaa7-Xaa8-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Lys-Glu-Xaa22-Gln-Ala-Xaa25-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Xaa33-Lys-Gly-Gly-Pro-Xaa38-Xaa39-Xaa40-Xaa41-Xaa42-Xaa43-Xaa44-Xaa45-Xaa46-Xaa47式4(SEQ ID NO4)其中Xaa7是L-組氨酸，D-組氨酸，脫氨基-組氨酸，2-氨基-組氨酸，β-羥基-組氨酸，高組氨酸，α-氟甲基-組氨酸，或α-甲基-組氨酸；Xaa8是Gly，Val，Leu，Ile，Ser，或Thr；Xaa22是Gly，Glu，Asp，或Lys；Xaa25是Ala，Val，Ile，或Leu；Xaa33是Val或Ile；Xaa38是Ser，Pro，或His；Xaa39是Ser，Arg，Thr，Trp，或Lys；Xaa40是Ser或Gly；Xaa41是Ala，Asp，Arg，Glu，Lys，或Gly；Xaa42是Pro或Ala；Xaa43是Pro或Ala；Xaa44是Pro，Ala，Arg，Lys，His，NH2，或不存在；Xaa45是Ser，His，Pro，Lys，Arg，NH2或不存在；Xaa46是His，Ser，Arg，Lys，NH2或不存在；以及Xaa47是His，Ser，Arg，Lys，His-NH2，Ser-NH2，Arg-NH2，His-NH2，NH2，或不存在；其前提是，如果Xaa44，Xaa45，Xaa46，或Xaa47不存在，每一個(gè)下游氨基酸也是不存在的。
本發(fā)明的另一種實(shí)施方案是包括式5的氨基酸序列(SEQ IDNO60)的延伸的GLP-1肽
His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Gly-Pro-Xaa38-Xaa39-Xaa40-Xaa41-Xaa42-Xaa43-Xaa44-Xaa45-Xaa46-Xaa47-Xaa48-Xaa49-Xaa50式5(SEQ ID NO60)其中Xaa38是Ser，Pro，或His；Xaa39是Ser，Arg，Thr，Trp，或Lys；Xaa40是Ser或Gly；Xaa41是Ala，Asp，Arg，Glu，Lys，或Gly；Xaa42是Pro，Ala，NH2，或不存在；Xaa43是Pro，Ala，NH2，或不存在；Xaa44是Pro，Ala，Arg，Lys，His，NH2，或不存在；Xaa45是Ser，His，Pro，Lys，Arg，Gly，NH2或不存在；Xaa46是His，Ser，Arg，Lys，Pro，Gly，NH2或不存在；以及Xaa47是His，Ser，Arg，Lys，NH2或不存在；Xaa48是Gly，His，NH2或不存在；Xaa49是Pro，His，NH2或不存在；以及Xaa50是Ser，His，Ser-NH2，His-NH2或不存在；其中，所述GLP-1肽包括1-6個(gè)其他取代，并且其前提是，如果Xaa42，Xaa43，Xaa44，Xaa45，Xaa46，Xaa47，Xaa48，或Xaa49不存在，每一個(gè)下游氨基酸也不存在。
式1，式2，式3，式4，和式5的其他實(shí)施方案，包括在8號(hào)位置上具有纈氨酸或甘氨酸，并且在22號(hào)位置上具有谷氨酸的GLP-1肽。
本發(fā)明還涉及在需要刺激的對(duì)象體內(nèi)刺激GLP-1受體的方法，所述方法包括給所述對(duì)象施用有效量的本文所披露的GLP-1肽的步驟。需要GLP-1受體刺激的對(duì)象，包括患有非胰島素依賴(lài)型糖尿病，應(yīng)激誘導(dǎo)的高血糖癥和肥胖的對(duì)象。
本發(fā)明的GLP-1肽，具有相對(duì)天然GLP-1分子的各種氨基酸改變，并且具有添加在始于37號(hào)位置的C-末端的額外氨基酸。
天然GLP-1(7-37)OH具有SEQ ID NO5的氨基酸
7His-Ala-Glu-10Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-15Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-20Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-25Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-30Ala-Trp-Leu-Val-Lys-35Gly-Arg-37Gly(SEQ ID NO5)所述天然分子也是在體內(nèi)酰胺化的，以便37號(hào)位置上的甘氨酸殘基被酰胺基團(tuán)取代。按照本領(lǐng)域的慣例，GLP-1(7-37)OH的氨基末端被確定的殘基編號(hào)為7，而羧基末端的編號(hào)為37。所述多肽上的其他氨基酸是連續(xù)編號(hào)的，如SEQ ID NO4所示。例如，12號(hào)位置是苯丙氨酸，而22號(hào)位置是甘氨酸。將相同的編號(hào)系統(tǒng)應(yīng)用于本發(fā)明的延伸的GLP-1肽。
本發(fā)明所涉及的GLP-1肽是“延伸的GLP-1肽”。相對(duì)天然GLP-1(7-37)或GLP-1(7-36)分子而言，延伸的GLP-1肽具有各種氨基酸取代，并且具有由C-末端延伸的額外氨基酸。
本發(fā)明的延伸的GLP-1肽具有一種或多種選自以下位置的相對(duì)GLP-1(7-37)的改變7，8，12，16，18，19，20，22，25，27，30，33，34，36，和37。另外，所述GLP-1肽具有添加在37號(hào)氨基酸后面的至少4個(gè)氨基酸(Xaa38至Xaa41)。優(yōu)選在C-末端添加至少6個(gè)氨基酸。最優(yōu)選在C-末端添加6-10個(gè)氨基酸。更優(yōu)選在C-末端添加至少7-9個(gè)氨基酸。
本發(fā)明涉及包括在式1(SEQ ID NO1)，式2(SEQ ID NO2)，式3(SEQ ID NO3)，和式4(SEQ ID NO4)中提供的氨基酸的任意組合的延伸的GLP-1肽，其中，所述延伸的GLP-1肽具有“促胰島素活性”。促胰島素活性表示反應(yīng)于升高的葡萄糖含量刺激胰島素分泌的能力，因此導(dǎo)致細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取，并且降低血漿葡萄糖水平。促胰島素活性可以通過(guò)本領(lǐng)域已知方法評(píng)估，包括使用體內(nèi)實(shí)驗(yàn)和體外分析方法，所述分析方法測(cè)定GLP-1受體結(jié)合活性或受體激活，例如，利用胰島細(xì)胞或胰島瘤細(xì)胞的分析方法，正如分別在授予Gelfand等的EP619,322和美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,120,712中所披露的。促胰島素活性通常是通過(guò)測(cè)定胰島素水平或C-肽水平在人體內(nèi)測(cè)定的。
對(duì)于本發(fā)明來(lái)說(shuō)，利用體外GLP-1受體信號(hào)傳導(dǎo)測(cè)定，分析確定特定的延伸的GLP-1肽是否在體內(nèi)具有促胰島素活性。本發(fā)明所涉及的延伸的GLP-1肽所具有的體外效力，不低于被稱(chēng)為Val8-GLP-1(7-37)OH的抗DPP-IV的GLP-1類(lèi)似物的體外效力的1/10。更優(yōu)選的是，本發(fā)明的延伸的GLP-1肽與Val8-GLP-1(7-37)OH一樣有效或更有效。
本文所說(shuō)的“體外效力”，是指一種肽在基于細(xì)胞的分析中激活GLP-1受體的能力的指標(biāo)。體外效力被表示為“EC50”，它是在單一劑量反應(yīng)實(shí)驗(yàn)中導(dǎo)致50％活性的化合物的有效濃度。對(duì)于本發(fā)明來(lái)說(shuō)，體外效力是使用熒光分析方法確定的，該方法采用能穩(wěn)定表達(dá)人GLP-1受體的HEK-293 Aurora CRE-BLAM細(xì)胞。這些HEK-293細(xì)胞業(yè)已穩(wěn)定地整合了具有驅(qū)動(dòng)β-內(nèi)酰氨酶(BLAM)基因表達(dá)的cAMP反應(yīng)元件(CRE)的DNA載體。GLP-1激動(dòng)劑與所述受體的相互作用，啟動(dòng)了導(dǎo)致cAMP反應(yīng)元件的激活以及隨后的β-內(nèi)酰氨酶表達(dá)的信號(hào)。然后，可以將在受到β-內(nèi)酰氨酶(Aurora Biosciences Corp.)裂解時(shí)發(fā)射熒光的β-內(nèi)酰氨酶CCF2/AM底物添加到業(yè)已接觸了特定量的GLP-1激動(dòng)劑的細(xì)胞，以便提供對(duì)GLP-1激動(dòng)劑效力的衡量指標(biāo)。該測(cè)定方法進(jìn)一步披露于以下文獻(xiàn)中Zlokarnik等(1998)Science 27984-88(還可參見(jiàn)實(shí)施例1)。在實(shí)施例1中所列舉的化合物的EC50值，是通過(guò)上文所披露的BLAM分析方法確定的，包括利用從0.00003nM到30nM范圍內(nèi)的稀釋液制備劑量反應(yīng)曲線(xiàn)。相對(duì)體外效力值，是通過(guò)用Val8-GLP-1(7-37)OH作對(duì)照，并且將所述對(duì)照的參考值設(shè)定為1而建立的。
本發(fā)明的延伸的GLP-1肽，優(yōu)選具有修飾過(guò)的GLP-1(7-37)的氨基酸序列，以便有一個(gè)1個(gè)，2個(gè)，3個(gè)，4個(gè)，5個(gè)，或6個(gè)氨基酸與GLP-1(7-37)的相應(yīng)位置上的氨基酸不同，更優(yōu)選在它的C-末端添加了6-10個(gè)氨基酸。
本發(fā)明的GLP-1肽優(yōu)選包括延伸的GLP-1類(lèi)似物，其中，所述類(lèi)似物或片段的主鏈包括在8號(hào)位置上的、除了丙氨酸以外的氨基酸(8號(hào)位置類(lèi)似物)。所述主鏈還可以包括位于7號(hào)位置上的L-組氨酸，D-組氨酸，或組氨酸的修飾形式，如脫氨基-組氨酸，2-氨基-組氨酸，β-羥基-組氨酸，高組氨酸，α-氟甲基-組氨酸，或-甲基-組氨酸。與天然GLP-1(7-37)的相應(yīng)的氨基酸相比，所述8號(hào)位置類(lèi)似物優(yōu)選包括位于12，16，18，19，20，22，25，27，30，33，34，36，和37號(hào)位置上的一個(gè)或多個(gè)額外改變。更優(yōu)選的是，與天然GLP-1(7-37)的相應(yīng)的氨基酸相比，所述8號(hào)位置類(lèi)似物包括位于16，18，22，25和33位置上的一個(gè)或多個(gè)位置改變。
在一種優(yōu)選實(shí)施方案中，位于延伸的GLP-1肽的12號(hào)位置上的氨基酸選自下組色氨酸或酪氨酸。更優(yōu)選的是，除了12號(hào)位置上的取代之外，8號(hào)位置上的氨基酸被甘氨酸，纈氨酸，亮氨酸，異亮氨酸，絲氨酸，蘇氨酸，或甲硫氨酸取代，更優(yōu)選被纈氨酸或甘氨酸取代。更優(yōu)選的是，除了12和8號(hào)位置的取代之外，22號(hào)位置上的氨基酸被谷氨酸取代。
在另一種優(yōu)選實(shí)施方案中，位于延伸的GLP-1肽的16號(hào)位置上的氨基酸選自下組色氨酸，異亮氨酸，亮氨酸，苯丙氨酸，或酪氨酸。16號(hào)位置上的氨基酸優(yōu)選是色氨酸。更優(yōu)選的是，除了16號(hào)位置上的取代之外，8號(hào)位置上的氨基酸被甘氨酸，纈氨酸，亮氨酸，異亮氨酸，絲氨酸，蘇氨酸，或甲硫氨酸取代，更優(yōu)選被纈氨酸或甘氨酸取代。更優(yōu)選的是，除了16和8號(hào)位置的取代之外，22號(hào)位置上的氨基酸被谷氨酸取代。同樣優(yōu)選的是，除了16和8號(hào)位置的取代之外，33號(hào)位置上的氨基酸被異亮氨酸取代。同樣優(yōu)選的是，除了8，16和22號(hào)位置的取代之外，36號(hào)位置上的氨基酸被甘氨酸取代，并且37號(hào)位置上的氨基酸被脯氨酸取代。
在另一種優(yōu)選實(shí)施方案中，延伸的GLP-1肽的18號(hào)位置上的氨基酸選自下組色氨酸，酪氨酸，苯丙氨酸，賴(lài)氨酸，亮氨酸，或異亮氨酸，優(yōu)選色氨酸，酪氨酸，和異亮氨酸。更優(yōu)選的是，除了18號(hào)位置的取代之外，8號(hào)位置上的氨基酸被甘氨酸，纈氨酸，亮氨酸，異亮氨酸，絲氨酸，蘇氨酸，或甲硫氨酸取代，更優(yōu)選被纈氨酸或甘氨酸取代。更優(yōu)選的是，除了18和8號(hào)位置的取代之外，22號(hào)位置上的氨基酸被谷氨酸取代。同樣優(yōu)選的是，除了18和8號(hào)位置的取代之外，33號(hào)位置上的氨基酸被異亮氨酸取代。同樣優(yōu)選的是，除了8，18和22號(hào)位置的取代之外，36號(hào)位置上的氨基酸被甘氨酸取代，而37號(hào)位置上的氨基酸被脯氨酸取代。
在另一種優(yōu)選實(shí)施方案中，延伸的GLP-1肽的19號(hào)位置上的氨基酸選自下組色氨酸或苯丙氨酸，優(yōu)選色氨酸。更優(yōu)選的是，除了19號(hào)位置的取代之外，8號(hào)位置上的氨基酸被甘氨酸，纈氨酸，亮氨酸，異亮氨酸，絲氨酸，蘇氨酸，或甲硫氨酸取代，更優(yōu)選被纈氨酸或甘氨酸取代。更優(yōu)選的是，除了19和8號(hào)位置的取代之外，22號(hào)位置上的氨基酸被谷氨酸取代。同樣優(yōu)選的是，除了8，19和22號(hào)位置的取代之外，36號(hào)位置上的氨基酸被甘氨酸取代，而37號(hào)位置上的氨基酸被脯氨酸取代。
在另一種優(yōu)選實(shí)施方案中，延伸的GLP-1肽的20號(hào)位置上的氨基酸選自下組苯丙氨酸，酪氨酸，或色氨酸，優(yōu)選色氨酸。更優(yōu)選的是，除了20號(hào)位置的取代之外，8號(hào)位置上的氨基酸被甘氨酸，纈氨酸，亮氨酸，異亮氨酸，絲氨酸，蘇氨酸，或甲硫氨酸取代，更優(yōu)選被纈氨酸或甘氨酸取代。更優(yōu)選的是，除了20和8號(hào)位置的取代之外，22號(hào)位置上的氨基酸被谷氨酸取代。同樣優(yōu)選的是，除了8，20和22號(hào)位置的取代之外，36號(hào)位置上的氨基酸被甘氨酸取代，而37號(hào)位置上的氨基酸被脯氨酸取代。
在另一種優(yōu)選實(shí)施方案中，延伸的GLP-1肽的25號(hào)位置上的氨基酸選自下組纈氨酸，異亮氨酸和亮氨酸，優(yōu)選纈氨酸。更優(yōu)選的是，除了25號(hào)位置的取代之外，8號(hào)位置上的氨基酸被甘氨酸，纈氨酸，亮氨酸，異亮氨酸，絲氨酸，蘇氨酸，或甲硫氨酸取代，更優(yōu)選被纈氨酸或甘氨酸取代。更優(yōu)選的是，除了25和8號(hào)位置的取代之外，22號(hào)位置上的氨基酸被谷氨酸取代。同樣優(yōu)選的是，除了8，22和25號(hào)位置的取代之外，36號(hào)位置上的氨基酸被甘氨酸取代，而37號(hào)位置上的氨基酸被脯氨酸取代。
在另一種優(yōu)選實(shí)施方案中，延伸的GLP-1肽的27號(hào)位置上的氨基酸選自下組異亮氨酸或丙氨酸。更優(yōu)選的是，除了27號(hào)位置的取代之外，8號(hào)位置上的氨基酸被甘氨酸，纈氨酸，亮氨酸，異亮氨酸，絲氨酸，蘇氨酸，或甲硫氨酸取代。更優(yōu)選被纈氨酸或甘氨酸取代。更優(yōu)選的是，除了27和8號(hào)位置的取代之外，22號(hào)位置上的氨基酸被谷氨酸取代。同樣優(yōu)選的是，除了8，22和27號(hào)位置的取代之外，36號(hào)位置上的氨基酸被甘氨酸取代，而37號(hào)位置上的氨基酸被脯氨酸取代。
在另一種優(yōu)選實(shí)施方案中，延伸的GLP-1肽的33號(hào)位置上的氨基酸是異亮氨酸。更優(yōu)選的是，除了33號(hào)位置的取代之外，8號(hào)位置上的氨基酸被甘氨酸，纈氨酸，亮氨酸，異亮氨酸，絲氨酸，蘇氨酸，或甲硫氨酸取代。更優(yōu)選被纈氨酸或甘氨酸取代。更優(yōu)選的是，除了33和8號(hào)位置的取代之外，22號(hào)位置上的氨基酸被谷氨酸取代。同樣優(yōu)選的是，除了8，22和33號(hào)位置的取代之外，36號(hào)位置上的氨基酸被甘氨酸取代，而37號(hào)位置上的氨基酸被脯氨酸取代。
在另一種優(yōu)選實(shí)施方案中，34號(hào)位置上的氨基酸是天冬氨酸。更優(yōu)選的是，除了34號(hào)位置的取代之外，8號(hào)位置上的氨基酸被甘氨酸，纈氨酸，亮氨酸，異亮氨酸，絲氨酸，蘇氨酸，或甲硫氨酸取代，更優(yōu)選被纈氨酸或甘氨酸取代。更優(yōu)選的是，除了34和8號(hào)位置的取代之外，22號(hào)位置上的氨基酸被谷氨酸取代。同樣優(yōu)選的是，除了8，22和34號(hào)位置的取代之外，36號(hào)位置上的氨基酸被甘氨酸取代，而37號(hào)位置上的氨基酸被脯氨酸取代。
上文所討論的與GLP-1類(lèi)似物主鏈融合的C-末端延伸部分的長(zhǎng)度至少為4個(gè)氨基酸，優(yōu)選的長(zhǎng)度為6-10個(gè)氨基酸。所述本發(fā)明的延伸的GLP-1肽優(yōu)選在38號(hào)位置上具有絲氨酸，脯氨酸，或組氨酸。在39號(hào)位置上具有絲氨酸，精氨酸，蘇氨酸，色氨酸，或賴(lài)氨酸；在40號(hào)位置上具有絲氨酸或甘氨酸；在41號(hào)位置上具有丙氨酸，天冬氨酸，精氨酸，谷氨酸，賴(lài)氨酸或甘氨酸；在42號(hào)位置上具有脯氨酸或丙氨酸；并且在43號(hào)位置上具有脯氨酸或丙氨酸。可以添加的其他氨基酸包括位于44號(hào)位置上的脯氨酸，絲氨酸，丙氨酸，精氨酸，賴(lài)氨酸，或組氨酸；位于45號(hào)位置上的絲氨酸，組氨酸，脯氨酸，賴(lài)氨酸或精氨酸；位于46號(hào)位置上的組氨酸，絲氨酸，精氨酸，或賴(lài)氨酸；位于47號(hào)位置上的組氨酸，絲氨酸，精氨酸，或賴(lài)氨酸。組氨酸優(yōu)選是位于42，43，44，45，46，或47號(hào)位置上的C-末端氨基酸?？梢蕴砑拥剿鯟-末端的其他氨基酸還包括如式1所示的氨基酸(SEQ IDNO1)。
優(yōu)選的是，當(dāng)Xaa34是天冬氨酸時(shí)，Xaa41是精氨酸或賴(lài)氨酸。同樣優(yōu)選的是，Xaa39是絲氨酸。同樣優(yōu)選的是，當(dāng)Xaa41是天冬氨酸或精氨酸時(shí)，則Xaa42，Xaa43，和Xaa44都是脯氨酸。所述C-末端氨基酸可以是典型的酸形式或可以是酰胺化的。
延伸的GLP-1肽的優(yōu)選種類(lèi)包括式4的氨基酸序列(SEQ ID NO4)Xaa7-Xaa8-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Lys-Glu-Xaa22-Gln-Ala-Xaa25-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Xaa33-Lys-Gly-Gly-Pro-Xaa38-Xaa39-Xaa40-Xaa41-Xaa42-Xaa43-Yaa44-Xaa45-Xaa46-Xaa47
式4(SEQ ID NO4)其中Xaa7是L-組氨酸，D-組氨酸，脫氨基-組氨酸，2-氨基-組氨酸，β-羥基-組氨酸，高組氨酸，α-氟甲基-組氨酸，或α-甲基-組氨酸；Xaa8是Gly，Val，Leu，Ile，Ser，或Thr；Xaa22是Gly，Glu，Asp，或Lys；Xaa25是Ala，Val，Ile，或Leu；Xaa33是Val或Ile；Xaa38是Ser，Pro，或His；Xaa39是Ser，Arg，Thr，Trp，或Lys；Xaa40是Ser或Gly；Xaa41是Ala，Asp，Arg，Glu，Lys，或Gly；Xaa42是Pro或Ala；Xaa43是Pro或Ala；Xaa44是Pro，Ala，Arg，Lys，His，NH2，或不存在；Xaa45是Ser，His，Pro，Lys，Arg，NH2或不存在；Xaa46是His，Ser，Arg，Lys，NH2或不存在；以及Xaa47是His，Ser，Arg，Lys，NH2或不存在；其前提是，如果Xaa44，Xaa45，Xaa46，或Xaa47不存在，每一個(gè)下游氨基酸也是不存在。
優(yōu)選的延伸GLP-1肽是具有式4(SEQ ID NO4)的肽，其中Xaa7是L-His，Xaa8是Gly或Val，Xaa22是Glu，Xaa25是Val，Xaa33是Ile，Xaa38是Ser，Xaa39是Ser，Xaa40是Gly，Xaa41是Ala，Xaa42是Pro，Xaa43是Pro，Xaa44是Pro，Xaa45是Ser，并且Xaa46和Xaa47不存在，以及它們的酰胺化形式。優(yōu)選的延伸的GLP-1肽還包括具有式4(SEQID NO4)的肽，其中Xaa7是L-His，Xaa8是Val，Xaa22是Glu，Xaa25是Ala，Xaa33是Ile，Xaa38是Ser，Xaa39是Ser，Xaa40是Gly，Xaa41是Ala，Xaa42是Pro，Xaa43是Pro，Xaa44是Pro，Xaa45是Ser，并且Xaa46和Xaa47不存在，以及它們的酰胺化形式。其他的優(yōu)選的延伸的GLP-1包括式4(SEQ ID NO4)的肽，其中Xaa7是L-His，Xaa8是Val，Xaa22是Gly，Xaa25是Ala，Xaa33是Ile，Xaa38是Ser，Xaa39是Ser，Xaa40是Gly，Xaa41是Ala，Xaa42是Pro，Xaa43是Pro，Xaa44是Pro，Xaa45是Ser，并且Xaa46和Xaa47不存在，以及它們的酰胺化形式。
本發(fā)明包括以下發(fā)現(xiàn)即添加在GLP-1肽的C-末端的特定的氨基酸，提供了特殊的結(jié)構(gòu)特征，它能保護(hù)所述肽免受各種蛋白酶的降解，但又不會(huì)對(duì)所述肽的生物學(xué)活性產(chǎn)生負(fù)面影響。另外，本文所披露的很多延伸的肽，比諸如Val8-GLP-1(7-37)OH的抗DPP-IV的GLP-1類(lèi)似物更有效。
實(shí)施例1提供了有關(guān)多種典型的延伸的GLP-1肽的體外效力的數(shù)據(jù)。所檢測(cè)的延伸的GLP-1肽的體外效力，在大致與Val8-GLP-1(7-37)OH相當(dāng)至超過(guò)Val8-GLP-1(7-37)OH效力7倍的范圍內(nèi)。另外，實(shí)施例5表明了延伸的GLP-1肽在體內(nèi)同樣更為有效。
實(shí)施例2提供了對(duì)多種典型的延伸的GLP-1類(lèi)似物的蛋白酶不敏感性的測(cè)定。相對(duì)蛋白水解穩(wěn)定性，是通過(guò)以下方法測(cè)定的讓延伸的GLP-1肽的和Val8-GLP-1(7-37)OH接觸α-胰凝乳蛋白酶，然后按實(shí)施例2所述方法對(duì)酶促反應(yīng)的進(jìn)程進(jìn)行作圖。測(cè)試的延伸的GLP-1肽，在與Val8-GLP-1(7-37)OH同樣穩(wěn)定至比Val8-GLP-1(7-37)OH的穩(wěn)定性高5倍的范圍內(nèi)。
正如在實(shí)施例4中所表明的，本發(fā)明的延伸的GLP-1肽還具有增加了的體內(nèi)半衰期。所述延伸的肽的體內(nèi)半衰期通常比諸如Val8-GLP-1(7-37)OH的DPP-IV保護(hù)的GLP-1類(lèi)似物的半衰期更長(zhǎng)。
本發(fā)明的延伸的GLP-1肽適合口服，鼻腔施用，肺吸入或腸胃外施用。例如，腸胃外施用可以包括例如全身施用，如通過(guò)肌內(nèi)，靜脈內(nèi)，皮下，或腹膜內(nèi)注射。所述GLP-1化合物可以與可以藥用的載體，稀釋劑或賦形劑組合給所述對(duì)象施用，作為本文所披露的用于治療各種疾病或狀況的藥物組合物的一部分。所述藥物組合物可以是溶液或懸浮液。合適的藥用載體可以包括惰性成分，它不會(huì)與所述肽或肽衍生物相互作用?？梢允褂脴?biāo)準(zhǔn)的制藥技術(shù)，如披露于以下文獻(xiàn)中的技術(shù)Remington′s Pharmaceutical Sciences，Mack PublishingCompany，Easton，PA。例如，用于腸胃外施用的合適的藥用載體包括，例如無(wú)菌水，生理鹽水，抑菌鹽水(含有大約0.9％mg/ml苯甲醇的鹽水)，磷酸緩沖的鹽溶液，Hank′s溶液，和Ringer′s-乳酸等。合適的賦形劑的某些例子包括乳糖，葡萄糖，蔗糖，海藻糖，山梨醇和甘露醇。
可以為了施用而配制所述GLP-1化合物，以便長(zhǎng)時(shí)間的將血漿水平保持在有效范圍內(nèi)。例如，其中的生物可吸收的聚合物被用于提供長(zhǎng)時(shí)間持續(xù)釋放的儲(chǔ)存制劑，同樣適用于本發(fā)明。
有效的口服肽藥物送遞的主要障礙是，由于肽被酸和酶降解，通過(guò)上皮細(xì)胞膜的吸收較差，以及肽在暴露于消化道中的酸性pH環(huán)境之后向不溶性形式的轉(zhuǎn)化而導(dǎo)致的較差的生物利用度。這種較低的生物利用度，使得有必要使用具有較高的效力，較高穩(wěn)定性或這兩者的GLP-1化合物。用于諸如本文所涉及的肽的口服送遞系統(tǒng)為本領(lǐng)域所公知。例如，可以用微球體或其他載體對(duì)GLP-1化合物進(jìn)行封裝，然后口服送遞。
本文所披露的延伸的GLP-1肽可用于治療患有多種疾病或狀況的對(duì)象。本發(fā)明所涉及的延伸的GLP-1肽通過(guò)作用于被稱(chēng)為“GLP-1受體”的受體而發(fā)揮它們的生物學(xué)作用(參見(jiàn)Dillon，J.S.等(1993)，Endocrinology，1331907-1910)。因此，可以治療患有對(duì)GLP-1受體刺激或施用延伸的GLP-1肽作出有利反應(yīng)的疾病和/或狀況的對(duì)象。所述對(duì)象被稱(chēng)為“需要用延伸的GLP-1肽治療”或“需要GLP-1受體刺激”。
包括患有非胰島素依賴(lài)型糖尿病，胰島素依賴(lài)型糖尿病，應(yīng)激誘導(dǎo)的高血糖癥，中風(fēng)(參見(jiàn)Efendic的WO 00/16797)，心肌梗塞(參見(jiàn)Efendic的WO 98/08531)，手術(shù)后的分解代謝改變(參見(jiàn)授予Efendic的美國(guó)專(zhuān)利號(hào)6,006,753)，功能性消化不良和腸激惹綜合征(參見(jiàn)Efendic的WO 99/64060)的對(duì)象。還包括用GLP-1肽進(jìn)行預(yù)防性治療的肽，例如，存在發(fā)生非胰島素依賴(lài)型糖尿病危險(xiǎn)的對(duì)象(參見(jiàn)WO 00/07617)。其他對(duì)象包括患有葡萄糖耐量低減或空腹葡萄糖異常的對(duì)象，進(jìn)行了部分胰腺切除手術(shù)的對(duì)象，單親或雙親患有非胰島素依賴(lài)型糖尿病的對(duì)象，患有妊娠糖尿病的對(duì)象以及患有急性或慢性胰腺炎，并且存在發(fā)展成非胰島素依賴(lài)型糖尿病的危險(xiǎn)的對(duì)象。
本發(fā)明的延伸的GLP-1肽還可用于治療體重超常的對(duì)象。特別適合的是對(duì)于對(duì)象的身高和體型來(lái)說(shuō)，其體重高于正常體重大約25％的對(duì)象。因此，所述延伸的GLP-1肽還可用于治療肥胖(參見(jiàn)Efendic的WO 98/19698)。
本發(fā)明的延伸的GLP-1肽可用于使血液葡萄糖水平正常化，抑制胰腺β-細(xì)胞細(xì)胞損傷，誘導(dǎo)β-細(xì)胞增殖，刺激胰島素基因轉(zhuǎn)錄，上調(diào)IDX-1/PDX-1或其他生長(zhǎng)因子，改善β-細(xì)胞細(xì)胞功能，激活休眠的β-細(xì)胞，將細(xì)胞分化成β-細(xì)胞，刺激β-細(xì)胞復(fù)制，抑制β-細(xì)胞程序死亡，調(diào)節(jié)體重，并且誘導(dǎo)體重減輕。
延伸的GLP-1肽的“有效量”，是在給需要GLP-1受體刺激的對(duì)象施用時(shí)能導(dǎo)致需要的治療和/或預(yù)防效果，而又不會(huì)導(dǎo)致不可接受的副作用的量?！靶枰闹委熜Ч卑ㄏ铝幸环N或多種效果1)緩解與疾病或狀況相關(guān)的癥狀；2)推遲與所述疾病或狀況相關(guān)的癥狀的發(fā)作；3)與缺少所述治療相比，延長(zhǎng)壽命；和4)與缺少所述治療相比，具有更高的生活質(zhì)量。例如，用于治療2型糖尿病的延伸的GLP-1肽的“有效量”，是與缺乏所述治療相比能導(dǎo)致對(duì)血糖濃度更大程度控制，因此導(dǎo)致延遲糖尿病并發(fā)癥，如視網(wǎng)膜病，神經(jīng)疾病或腎病的發(fā)作的量。用于預(yù)防糖尿病的延伸的GLP-1肽的“有效量”，是與缺乏治療相比能推遲需要用諸如磺脲類(lèi)，噻唑烷二酮，胰島素和/或雙胍類(lèi)的藥物治療的升高的血液葡萄糖水平的發(fā)作。
本發(fā)明的延伸的GLP-1肽的典型的劑量范圍，為每天大約1μg-大約100mg。所述劑量范圍優(yōu)選為每天大約5μg-大約1mg。更優(yōu)選的是所述劑量為每天大約10μg-大約100μg。
“對(duì)象”是哺乳動(dòng)物，優(yōu)選人類(lèi)，不過(guò)，還可以是動(dòng)物，例如，寵物(例如，狗和貓等)，家畜(例如，牛，羊，豬和馬等)以及實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物(例如，大鼠，小鼠和豚鼠等)。
本發(fā)明的延伸的GLP-1肽可以用重組DNA技術(shù)制備，或者通過(guò)使用固相肽合成技術(shù)的標(biāo)準(zhǔn)方法制備。例如，肽合成儀可以通過(guò)商業(yè)渠道從Foster City CA的Applied Biosystems公司獲得。用于固相合成的試劑是通過(guò)商業(yè)渠道獲得的，例如從Midwest Biotech公司(Fishers，IN)購(gòu)買(mǎi)。固相合成儀可以按照生產(chǎn)商的說(shuō)明使用，用于封閉干擾基團(tuán)，保護(hù)要反應(yīng)的氨基酸，對(duì)不起反應(yīng)的氨基酸進(jìn)行偶聯(lián)，解偶聯(lián)和封端。
通常，α-N-氨甲?；Ｗo(hù)的氨基酸和樹(shù)脂上的生長(zhǎng)的肽鏈上的N-末端氨基酸，是在室溫下，在諸如二甲基甲酰胺，N-甲基吡咯烷酮或二氯甲烷的惰性溶劑中，在存在諸如二環(huán)己基碳二亞胺或1-羥基苯并三唑的偶聯(lián)劑和諸如二異丙基乙胺的堿的條件下偶聯(lián)的。使用諸如三氟乙酸或哌啶的試劑將α-N-氨甲酰保護(hù)基團(tuán)從所得到的肽樹(shù)脂上除去，并且用要添加到所述肽鏈上的下一個(gè)需要的N-保護(hù)的氨基酸重復(fù)所述偶聯(lián)反應(yīng)。合適的酰胺保護(hù)基團(tuán)為本領(lǐng)域所熟知，并且披露于以下文獻(xiàn)中例如，參見(jiàn)Green和Wuts，“Protecting Groups in OrganicSynthesis”，John Wiley and Sons，1991，該文獻(xiàn)的完整內(nèi)容被收作本文參考。其例子包括叔丁氧基羰基(tBoc)和芴基甲氧基羰基(Fmoc)。
在合成結(jié)束之后，用標(biāo)準(zhǔn)的氟化氫或三氟乙酸裂解方法，通過(guò)同時(shí)側(cè)鏈脫保護(hù)，將肽從所述固相支持物上裂解下來(lái)。然后使用反相層析在Vydac C18柱上對(duì)粗制肽作進(jìn)一步純化，采用線(xiàn)性水-乙腈梯度，使所有溶劑都含有0.1％的三氟乙酸(TFA)。為了除去乙腈，從含有0.1％TFA，乙腈和水的溶液中冷凍干燥肽?？梢酝ㄟ^(guò)分析反相層析驗(yàn)證純度。通過(guò)質(zhì)譜分析證實(shí)肽的身份?？梢詫㈦娜芙庠谥行詐H的含水緩沖液中。
實(shí)施例實(shí)施例1體外效力以20,000-40,000細(xì)胞/孔/100μl的密度，將表達(dá)人GLP-1受體的HEK-293Aurora CRE-BLAM細(xì)胞接種到96孔黑色透明底平板上。在接種次日，用無(wú)血漿的培養(yǎng)基更換所述培養(yǎng)基。在接種后的第三天，將20μl含有不同濃度的GLP-1激動(dòng)劑的無(wú)血漿培養(yǎng)基添加到每一個(gè)孔中，以便制備劑量反應(yīng)曲線(xiàn)。一般來(lái)說(shuō)，將含有3nM-30nmGLP-1化合物的14種稀釋液用于制備劑量反應(yīng)曲線(xiàn)，通過(guò)該曲線(xiàn)可以確定EC50值。在與GLP-1化合物一起溫育5小時(shí)之后，添加20μl的β-內(nèi)酰氨酶底物(CCF2-AM-Aurora Biosciences-產(chǎn)品代碼100012)，并且繼續(xù)溫育1小時(shí)，在該時(shí)間點(diǎn)上，在cytofluor上測(cè)定熒光。測(cè)試了以下GLP-1肽，并且具有從大體上與Val8-GLP-1(7-37)OH的活性相同到比它的活性高大約8倍的EC50值
HVEGTFTSDVSSYLEEQAAKEFIAWLVKGRG SEQ ID NO6HVEGTFTSDVSSYLEEQAAKEFIAWLIDGGPSSGRPPPS-NH2 SEQ ID NO7HVEGTFTSDVSSYLEEQAAKEFIAWLVKGRGSSGDPPPS-NH2 SEQ ID NO8HVEGTFTSDVSSYLEEQAAKEFIAWLVKGRPSSGDPPPS-NH2 SEQ ID NO9HVEGTFTSDVSSYLEEQAAKEFIAWLIKGGPSSGDPPPS-NH2 SEQ ID NO10HVEGTFTSDVSSYLEEQAAKEFIAWLVKGRPSSGAPPPS-NH2 SEQ ID NO11HVEGTFTSDVSSYLEEQAAKEFIAWLIKGGPSSGAPPPS-NH2 SEQ ID NO12HVEGTFTSDVSSYLEEQAVKEFIAWLIKGGPSSGAPPPS-NH2 SEQ ID NO13HVEGTFTSDVSSYLEEQAVKEFIAWLVKGGPSSGAPPPS-NH2 SEQ ID NO14HVEGTFTSDVSSYLEEQAVKEFIAWLIKGGPSSGDPPPS-NH2 SEQ ID NO15HVEGTFTSDVSSYLEEQAAKEFIAWLIKGGGSSGDPPPS-NH2 SEQ ID NO16HVEGTFTSDVSSYLEEQAAKEFIAWLIKGPGSSGDPPPS-NH2 SEQ ID NO17HVEGTFTSDVSSYLEEQAAKEFIAWLIKGGSPSGDPPPS-NH2 SEQ ID NO18HVEGTFTSDVSSYLEEQAAKEFIAWLIKGGPSSGDPPS-NH2 SEQ ID NO19HVEGTFTSDVSSYLEEQAAKEFIAWLIKGGPSSGDPPPS SEQ ID NO20HVEGTFTSDVSSYLEEQAAKEFIAWLIKGGPSSGDAPPS-NH2 SEQ ID NO21HVEGTFTSDVSSYLEEQAAKEFIAWLIKGGPSSGDPAPS-NH2 SEQ ID NO22HVEGTFTSDVSSYLEEQAAKEFIAWLIKGGPSSGDPPAS-NH2 SEQ ID NO23HVEGTFTSDVSSYLEEQAAKEFIAWLIKGGPSSGDAAAS-NH2 SEQ ID NO24HVEGTFTSDWSSYLEGQAAKEFIAWLIKGGPSSGAPPPS SEQ ID NO25HVEGTFTSDWSSYLEGQAAKEFIAWLIKGGPSSGAPPPH SEQ ID NO26HVEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLIKGGPSSGAPPPS SEQ ID NO27HVEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLIKGGPSSGDPPPS SEQ ID NO28HVEGTFTSDWSSYLEGQAAKEFIAWLIKGGPSSGAPPPSH SEQ ID NO29HVEGTFTSDWSSYLEGQAAKEFIAWLIKGGPHSSGAPPPS SEQ ID NO30HVEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRGSSGAPPPS SEQ ID NO31HVEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGGPSSGAPPPS SEQ ID NO32HVEGTFTSDVSSYLEEQAAKEFIAWLVKGGPSSGAPPPS SEQ ID NO33HVEGTFTSDVSSYLEEQAAKEFIAWLVKGRGSSGAPPPS SEQ ID NO34HVEGTFTSDVSSYLEEQAVKEFIAWLIKGRGSSGAPPPS SEQ ID NO35HVEGTFTSDWSSYLEEQAAKEFIAWLIKGRGSSGAPPPS SEQ ID NO36HVEGTFTSDVSSYLEEQAAKEFIAWLIKGRGHSSGAPPPS SEQ ID NO37HVEGTFTSDVSSYLEEQAAKEFIAWLVKGRGHSSGAPPPS SEQ ID NO38HVEGTFTSDWSSYLEEQAAKEFIAWLIKGGPHSSGAPPPSH SEQ ID NO39HVEGTFTSDWSSYLEEQAAKEFIAWLIKGGPSSGAPPPSH SEQ ID NO40HVEGTFTSDVSWYLEGQAVKEFIAWLIKGGPHSSGAPPPS SEQ ID NO41HVEGTFTSDVSSYLEEQAVKEFIAWLIKGGPSSGAPPPS SEQ ID NO42HVEGTFTSDVSSYLEEQAVKEFIAWLIKGGPSSGAPPPSH SEQ ID NO43
HVEGTFTSDWSSYLEEQAVKEFIAWLIKGGPSSGAPPPS SEQ ID NO44HVEGTFTSDWSSYLEEQAVKEFIAWLIKGGPSSGAPPPSH SEQ ID NO45HVEGTFTSDWSSYLEEQAVKEFIAWLIKGGPHSSGAPPPS SEQ ID NO46HVEGTFTSDWSKYLEEQAVKEFIAWLIKGGPSSGAPPPSH SEQ ID NO47HVEGTFTSDVSSYLEEQAVKEFIAWLIKGGPSSGAPPPRG SEQ ID NO48HVEGTFTSDVSSYLEEQAVKEFIAWLIKGGPSSGAPPPRG-NH2 SEQ ID NO49HVEGTFTSDVSSYLEEQAAKEFIAWLVKGGPSSGAPPPS-NH2 SEQ ID NO50HVEGTFTSDVSSYLEEQAAKEFIAWLVDGGPSSGRPPPS-NH2 SEQ ID NO51HVEGTFTSDVSSYLEEQAAKEFIAWLVDGGPSSGRPPPS SEQ ID NO52HVEGTFTSDVSSYLEEQAAKEFIAWLVDGGPSSGKPPPS SEQ ID NO53HVEGTFTSDVSSYLEEQAAKEFIAWLVDGGPSSGRG SEQ ID NO54HVEGTFTSDVSSYLEEQAAKEFIAWLIKGGPSSGAPPPS SEQ ID NO55HVEGTFTSDVSSYLEEQAAKEFIAWLVKGGPSWGAPPPS SEQ ID NO56HVEGTFTSDVSSYLEEQAAKEFIAWLIKGGPSSGAPPPGPS SEQ ID NO57HVEGTFTSDVSSYLEEQAAKEFIAWLIKGGPSSGAPPPGPSGPS SHQ ID NO58實(shí)施例2蛋白水解穩(wěn)定性在反應(yīng)混合物中，評(píng)估了與對(duì)照肽Val8-GLP-1(7-37)OH相比，各種延伸的GLP-1肽對(duì)α-胰凝乳蛋白酶的相對(duì)敏感性。制備了含有濃度為100μM的GLP-1肽的pH7.4的10mM磷酸鹽/檸檬酸鹽溶液。然后在4℃下將該溶液的10μl等分樣品在含有10mM氯化鈣的，pH7.4的200ul 10mM磷酸鹽/檸檬酸鹽溶液中溫育。然后以250ng/ml的最終濃度添加α-胰凝乳蛋白酶(SIGMA，C-3142 lot 89F8155)。然后在添加酶之前，以及在添加酶之后20，40，60，80和100分鐘，以1ml/分鐘的流速，將20μl的等分樣品加注到分析Zorbax 300SB-C8(內(nèi)徑4.6mm×50mm)柱上，所述樣品溶于10％乙腈/0.075％TFA中。通過(guò)10-90％乙腈/0.075％TFA的梯度，用15分鐘時(shí)間分離峰。通過(guò)將原始材料隨時(shí)間推進(jìn)出現(xiàn)的峰面積的損失作圖，跟蹤酶促反應(yīng)的進(jìn)程。根據(jù)裂解的起始速度計(jì)算蛋白水解降解的速度(時(shí)間點(diǎn)0和20分鐘)，并且直接與對(duì)照肽Val8-GLP-1(7-37)OH的裂解速度進(jìn)行比較。測(cè)試了以下延伸的GLP-1肽，并且具有從大體上與Val8-GLP-1(7-37)OH相同至比它的穩(wěn)定性高5倍的穩(wěn)定性比例HVEGTFTSDVSSYLEEQAAKEFIAWLIKGGPSSGDPPPS-NH2 SEQ ID NO10HVEGTFTSDVSSYLEEQAAKEFIAWLIDGGPSSGRPPPS-NH2 SEQ ID NO7
HVEGTFTSDVSSYLEEQAAKEFIAWLVKGRGSSGDPPPS-NH2 SEQ ID NO8HVEGTFTSDVSSYLEEQAAKEFIAWLVKGRPSSGDPPPS-NH2 SEQ ID NO9HVEGTFTSDVSSYLEEQAAKEFIAWLIKGGPSSGAPPPS-NH2 SEQ ID NO12HVEGTFTSDVSSYLEEQAVKEFIAWLIKGGPSSGAPPPS-NH2 SEQ ID NO13HVEGTFTSDVSSYLEEQAVKEFIAWLVKGGPSSGAPPPS-NH2 SEQ ID NO14HVEGTFTSDVSSYLEEQAVKEFIAWLIKGGPSSGDPPPS-NH2 SEQ ID NO15HVEGTFTSDVSSYLEEQAAKEFIAWLIKGGGSSGDPPPS-NH2 SEQ ID NO16HVEGTFTSDVSSYLEEQAAKEFIAWLIKGPGSSGDPPPS-NH2 SEQ ID NO17HVEGTFTSDVSSYLEEQAAKEFIAWLIKGGSPSGDPPPS-NH2 SEQ ID NO18HVEGTFTSDVSSYLEEQAAKEFIAWLIKGGPSSGDPPS-NH2 SEQ ID NO19HVEGTFTSDVSSYLEEQAAKEFIAWLIKGGPSSGDPPPS SEQ ID NO20HVEGTFTSDVSSYLEEQAAKEFIAWLIKGGPSSGDAPPS-NH2 SEQ ID NO21HVEGTFTSDVSSYLEEQAAKEFIAWLIKGGPSSGDPAPS-NH2 SEQ ID NO22HVEGTFTSDVSSYLEEQAAKEFIAWLIKGGPSSGDPPAS-NH2 SEQ ID NO23HVEGTFTSDVSSYLEEQAAKEFIAWLIKGGPSSGDAAAS-NH2 SEQ ID NO24HVEGTFTSDWSSYLEGQAAKEFIAWLIKGGPSSGAPPPS SEQ ID NO25HVEGTFTSDWSSYLEGQAAKEFIAWLIKGGPSSGAPPPH SEQ ID NO26HVEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLIKGGPSSGAPPPS SEQ ID NO27HVEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGGPSSGAPPPS SEQ ID NO32HVEGTFTSDVSSYLEEQAAKEFIAWLVKGGPSSGAPPPS SEQ ID NO33HVEGTFTSDVSSYLEEQAAKEFIAWLVKGRGHSSGAPPPS SEQ ID NO38HVEGTFTSDWSSYLEEQAAKEFIAWLIKGGPHSSGAPPPSH SEQ ID NO39HVEGTFTSDVSSYLEEQAVKEFIAWLIKGGPSSGAPPPSH SEQ ID NO43HVEGTFTSDVSSYLEEQAVKEFIAWLIKGGPSSGAPPPRG SEQ ID NO48HVEGTFTSDVSSYLEEQAAKEFIAWLVDGGPSSGRG SEQ ID NO54實(shí)施例3物理穩(wěn)定性分析了延伸的GLP-1肽在溶液中聚集的可能。一般來(lái)說(shuō)，溶液中的肽是在較高溫度下在合適的緩沖液中攪拌的，同時(shí)記錄在350nm波長(zhǎng)下的濁度，作為時(shí)間的函數(shù)。測(cè)定聚集的開(kāi)始時(shí)間，以便對(duì)特定GLP分子在所述脅迫條件下聚集的可能進(jìn)行定量。
首先，在堿性條件下(pH10.5)將GLP-1肽溶解30分鐘，以便溶解所有預(yù)先聚集的材料。然后將該溶液調(diào)整到pH7.4，并且過(guò)濾。具體地講，將4mg冷凍干燥的GLP-1化合物溶解在3ml的10mM磷酸鹽/10mM檸檬酸鹽溶液中。將pH調(diào)整到10.0-10.5，并且保持30分鐘。用氯化氫將該溶液調(diào)整到pH7.4，并且通過(guò)合適的過(guò)濾器過(guò)濾，例如，Millex GV注射過(guò)濾器(Millipore Corporation，Bedford，MA)。然后，將該溶液稀釋成在10mM檸檬酸鹽，10mM磷酸鹽，150mMNaCl的溶液中含有0.3mg/mL蛋白的最終樣品，并且調(diào)整到pH7.4-7.5。在石英樣品杯中，在37℃下溫育所述樣品。每隔5分鐘，用AVIV Model 14DS UV-VIS分光光度計(jì)(Lakewood，NJ)在350nm波長(zhǎng)下測(cè)定該溶液的濁度。在測(cè)定之前30秒至測(cè)定期間，用購(gòu)自Starna Cell，Inc.(Atascadero，CA)的磁力攪拌棒攪拌所述溶液。350nm波長(zhǎng)下OD的增加，表明了GLP-肽的聚集。聚集的時(shí)間接近按照Drake的方法的生長(zhǎng)前和生長(zhǎng)期的線(xiàn)性擬合交叉點(diǎn)(Arvinte T，Cudd A，and Drake AF.(1993)J.Biol.Chem.268，6415-6422)。
在兩次實(shí)驗(yàn)之間用強(qiáng)堿性皂液(例如，Contrad-70)清洗樣品杯。測(cè)試了以下延伸的GLP-1肽，并且在溶液中能穩(wěn)定至少55小時(shí)，與之相比，Val8-GLP-1(7-37)OH能穩(wěn)定大約1小時(shí)HVEGTFTSDVSSYLEEQAAKEFIAWLIKGGPSSGDPPPS-NH2 SEQ ID NO10HVEGTFTSDVSSYLEEQAAKEFIAWLIDGGPSSGRPPPS-NH2 SEQ ID NO7HVEGTFTSDVSSYLEEQAAKEFIAWLVKGRGSSGDPPPS-NH2 SEQ ID NO8HVEGTFTSDVSSYLEEQAVKEFIAWLIKGGPSSGDPPPS-NH2 SEQ ID NO15HVEGTFTSDVSSYLEEQAAKEFIAWLIKGGPSSGDPPPS SEQ ID NO20HVEGTFTSDWSSYLEGQAAKEFIAWLIKGGPSSGAPPPS SEQ ID NO25HVEGTFTSDWSSYLEGQAAKEFIAWLIKGGPSSGAPPPH SEQ ID NO26HVEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLIKGGPSSGAPPPS SEQ ID NO27HVEGTFTSDWSSYLEGQAAKEFIAWLIKGGPHSSGAPPPS SEQ ID NO30HVEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGGPSSGAPPPS SEQ ID NO32HVEGTFTSDVSSYLEEQAAKEFIAWLVKGGPSSGAPPPS SEQ ID NO33HVEGTFTSDVSSYLEEQAVKEFIAWLIKGGPSSGAPPPS SEQ ID NO42HVEGTFTSDWSSYLEEQAAKEFIAWLIKGGPHSSGAPPPSH SEQ ID NO39
HVEGTFTSDWSSYLEEQAVKEFIAWLIKGGPSSGAPPPS SEQ ID NO44HVEGTFTSDVSSYLEEQAAKEFIAWLVDGGPSSGRG SEQ ID NO54HVEGTFTSDVSSYLEEQAAKEFIAWLIKGGPSSGAPPPS SEQ ID NO55HVEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRGSSGAPPPS SEQ ID NO31HVEGTFTSDVSSYLEEQAVKEFIAWLIKGRGSSGAPPPS SEQ ID NO35HVEGTFTSDWSSYLEEQAAKEFIAWLIKGRGSSGAPPPS SEQ ID NO36實(shí)施例4延伸的GLP-1肽的藥代動(dòng)力學(xué)測(cè)定了以下5種不同延伸的GLP-1肽的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)1號(hào)化合物HVEGTFTSDVSSYLEEQAAKEFIAWLIKGGPSSGDPPPS-NH2SEQ ID NO102號(hào)化合物HVEGTFTSDVSSYLEEQAAKEFIAWLIKGGPSSGDPPPSSEQ ID NO203號(hào)化合物HVEGTFTSDVSSYLEEQAAKEFIAWLVKGRGSSGAPPPSSEQ ID NO344號(hào)化合物HVEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRGSSGAPPPSSEQ ID NO315號(hào)化合物HVEGTFTSDWSSYLEEQAAKEFIAWLIKGRGSSGAPPPSSEQ ID NO36在對(duì)四只不同的大鼠一次靜脈內(nèi)注射10μg/kg的劑量之后測(cè)定參數(shù)。數(shù)據(jù)如表1和2所示表1和2
表1在給Sprague Dawley大鼠一次靜脈內(nèi)注射10μg/kg的劑量之后，延伸的GLP-1肽的PK參數(shù)。
表1(續(xù))
縮略語(yǔ)，kg＝千克，μg＝微克，min＝分鐘，ng＝納克，mL＝毫升，Cmax＝最大血漿濃度，AUC＝濃度曲線(xiàn)下面的面積，t1/2＝血漿半衰期，Cl＝清除，V＝基于終末期的分布體積，SD＝標(biāo)準(zhǔn)差。
表2在給Sprague Dawley大鼠一次靜脈內(nèi)注射10μg/kg的劑量之后，延伸的GLP-1肽的血漿濃度(pg/mL)。
表2(續(xù))
NC＝未計(jì)算；μg＝微克；pg＝皮克；mL＝毫升；kg＝千克；min＝分鐘。
a低于定量的下限(為了計(jì)算，使用0值)。
實(shí)施例5延伸的GLP-1肽的體內(nèi)活性測(cè)定了若干種不同的延伸的和非延伸的GLP-1肽在狗體內(nèi)進(jìn)行的高血糖控制研究中的活性。用葡萄糖輸液200分鐘，以便保持穩(wěn)定水平。在前80分鐘，給狗靜脈內(nèi)送遞賦形劑，以便建立基線(xiàn)胰島素濃度。在隨后的60分鐘，以1pmol/kg/分鐘的速度施用GLP-1肽。最后60分鐘將每一種GLP-1化合物的送遞速度提高到3pmol/kg/分鐘。定期采集血液樣品，以便測(cè)定胰島素和GLP-1肽濃度。在對(duì)照期(60-80)分鐘的最后20分鐘的時(shí)間內(nèi)，以時(shí)間點(diǎn)t的值和平均值之間的差的形式計(jì)算胰島素變化值，并且在表3中示出。在每次輸液的最后30分鐘，用梯形規(guī)則計(jì)算胰島素變化曲線(xiàn)下面的面積。在表4中示出了GLP-1肽濃度。所列舉的值是平均值±平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤(SEM)。
表3來(lái)自狗高血糖(150mg/dL)控制研究的藥代動(dòng)力學(xué)
表4在輸注化合物60分鐘之后，來(lái)自狗高血糖(150mg/dL)控制研究的GLP-1肽濃度
序列表<110>ELI LILLY AND COMPANY<120>延伸的胰高血糖素樣肽-1類(lèi)似物<130>X-15133<140>60/346,474<141>2002-01-08<160>60<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>44<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成構(gòu)建體<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(1)..(1)<223>1號(hào)位置上的Xaa是L-組氨酸，D-組氨酸，或修飾過(guò)的殘基<220>
<221>MOD_RES<222>(1)..(1)<223>1號(hào)位置上的修飾過(guò)的殘基是脫氨基-組氨酸，2-氨基-組氨酸，β-羥基-組氨酸，高組氨酸，α-氟甲基-組氨酸，或α-甲基-組氨酸<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(2)..(2)<223>2號(hào)位置上的Xaa是Ala，Gly，Val，Leu，Ile，Ser，或Thr<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(6)..(6)<223>6號(hào)位置上的Xaa是Phe，Trp，或Tyr
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(10)..(10)<223>10號(hào)位置上的Xaa是Val，Trp，Ile，Leu，Phe，或Tyr<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(12)..(12)<223>12號(hào)位置上的Xaa是Ser，Trp，Tyr，Phe，Lys，Ile，Leu，或Val<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(13)..(13)<223>13號(hào)位置上的Xaa是Tyr，Trp，或Phe<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(14)..(14)<223>14號(hào)位置上的Xaa是Leu，Phe，Tyr，或Trp<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(16)..(16)<223>16號(hào)位置上的Xaa是Gly，Glu，Asp，或Lys<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(19)..(19)<223>19號(hào)位置上的Xaa是Ala，Val，Ile，或Leu<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(21)..(21)<223>21號(hào)位置上的Xaa是Glu，Ile，或Ala<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(24)..(24)<223>24號(hào)位置上的Xaa是Ala或Glu
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(27)..(27)<223>27號(hào)位置上的Xaa是Val或Ile<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(28)..(28)<223>28號(hào)位置上的Xaa是Lys，Asp，Arg，或Glu<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(30)..(30)<223>30號(hào)位置上的Xaa是Gly，Pro，或Arg<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(31)..(31)<223>31號(hào)位置上的Xaa是Gly，Pro，或Ser<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(32)..(32)<223>32號(hào)位置上的Xaa是Ser，Pro，或His<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(33)..(33)<223>33號(hào)位置上的Xaa是Ser，Arg，Thr，Trp，或Lys<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(34)..(34)<223>34號(hào)位置上的Xaa是Ser或Gly<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(35)..(35)<223>35號(hào)位置上的Xaa是Ala，Asp，Arg，Glu，Lys，Gly，或修飾過(guò)的殘基
<220>
<221>MOD_RES<222>(35)..(35)<223>酰胺化<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(36)..(36)<223>36號(hào)位置上的Xaa是Pro，Ala，不存在或修飾過(guò)的殘基<220>
<221>MOD_RES<222>(36)..(36)<223>酰胺化<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(37)..(37)<223>Xaa是Pro，Ala，不存在，或修飾過(guò)的殘基<220>
<221>MOD_RES<222>(37)..(37)<223>酰胺化<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(38)..(38)<223>Xaa是Pro，Ala，Arg，Lys，His，不存在或修飾過(guò)的殘基<220>
<221>MOD_RES<222>(38)..(38)<223>酰胺化<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(39)..(39)<223>Xaa是Ser，His，Pro，Lys，Arg，Gly，不存在或修飾過(guò)的殘基
<220>
<221>MOD_RES<222>(39)..(39)<223>酰胺化<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(40)..(40)<223>Xaa是His，Ser，Arg，Lys，Pro，Gly，不存在或修飾過(guò)的殘基<220>
<221>MOD_RES<222>(40)..(40)<223>酰胺化<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(41)..(41)<223>Xaa是His，Ser，Arg，Lys，不存在或修飾過(guò)的殘基<220>
<221>MOD_RES<222>(41)..(41)<223>酰胺化<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(42)..(42)<223>Xaa是Gly，His，不存在或修飾過(guò)的殘基<220>
<221>MOD_RES<222>(42)..(42)<223>酰胺化<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(43)..(43)<223>Xaa是Pro，His，不存在或修飾過(guò)的殘基
<220>
<221>MOD_RES<222>(43)..(43)<223>酰胺化<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(44)..(44)<223>Xaa是Ser，His，不存在或修飾過(guò)的殘基<220>
<221>MOD_RES<222>(44)..(44)<223>酰胺化<400>1Xaa Xaa Glu Gly Thr Xaa Thr Ser Asp Xaa Ser Xaa Xaa Xaa Glu Xaa1 5 10 15Gln Ala Xaa Lys Xaa Phe Ile Xaa Trp Leu Xaa Xaa Gly Xaa Xaa Xaa20 25 30Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa35 40<210>2<211>41<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成構(gòu)建體<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(1)..(1)<223>1號(hào)位置上的Xaa是L-組氨酸，D-組氨酸，或修飾過(guò)的殘基<220>
<221>MOD_RES<222>(1)..(1)<223>1號(hào)位置上的修飾過(guò)的殘基是脫氨基-組氨酸，2-氨基-組氨酸，β-羥基-組氨酸，高組氨酸，α-氟甲基-組氨酸，或α甲基-組氨酸<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(2)..(2)<223>Xaa是Ala，Gly，Val，Leu，Ile，Ser，或Thr<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(6)..(6)<223>Xaa是Phe，Trp，或Tyr<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(10)..(10)<223>Xaa是Val，Trp，Ile，Leu，Phe，或Tyr<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(12)..(12)<223>Xaa是Ser，Trp，Tyr，Phe，Lys，Ile，Leu，或Val<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(13)..(13)<223>Xaa是Tyr，Trp，或Phe<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(14)..(14)<223>Xaa是Leu，Phe，Tyr，或Trp<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(16)..(16)<223>Xaa是Gly，Glu，Asp，或Lys
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(19)..(19)<223>Xaa是Ala，Val，Ile，或Leu<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(21)..(21)<223>Xaa是Glu，Ile，或Ala<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(24)..(24)<223>Xaa是Ala或Glu<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(27)..(27)<223>Xaa是Val或Ile<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(28)..(28)<223>Xaa是Lys，Asp，Arg，或Glu<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(30)..(30)<223>Xaa是Gly，Pro，或Arg<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(31)..(31)<223>Xaa是Gly，Pro，或Ser<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(32)..(32)<223>Xaa是Ser，Pro，或His
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(33)..(33)<223>Xaa是Ser，Arg，Thr，Trp，或Lys<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(34)..(34)<223>Xaa是Ser或Gly<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(35)..(35)<223>Xaa是Ala，Asp，Arg，Glu，Lys，Gly，或修飾過(guò)的殘基<220>
<221>MOD_RES<222>(35)..(35)<223>酰胺化<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(36)..(36)<223>Xaa是Pro，Ala，不存在，或修飾過(guò)的殘基<220>
<221>MOD_RES<222>(36)..(36)<223>酰胺化<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(37)..(37)<223>Xaa是Pro，Ala，不存在或修飾過(guò)的殘基<220>
<221>MOD_RES<222>(37)..(37)<223>酰胺化
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(38)..(38)<223>Xaa是Pro，Ala，Arg，Lys，His，不存在或修飾過(guò)的殘基<220>
<221>MOD_RES<222>(38)..(38)<223>酰胺化<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(39)..(39)<223>Xaa是Ser，His，Pro，Lys，Arg，不存在或修飾過(guò)的殘基<220>
<221>MOD_RES<222>(39)..(39)<223>酰胺化<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(40)..(40)<223>Xaa是His，Ser，Arg，Lys，不存在或修飾過(guò)的殘基<220>
<221>MOD_RES<222>(40)..(40)<223>酰胺化<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(41)..(41)<223>Xaa是His，Ser，Arg，Lys，不存在或修飾過(guò)的殘基<220>
<221>MOD_RES<222>(41)..(41)<223>酰胺化
<400>2Xaa Xaa Glu Gly Thr Xaa Thr Ser Asp Xaa Ser Xaa Xaa Xaa Glu Xaa1 5 10 15Gln Ala Xaa Lys Xaa Phe Ile Xaa Trp Leu Xaa Xaa Gly Xaa Xaa Xaa20 25 30Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa35 40<210>3<211>41<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成構(gòu)建體<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(1)..(1)<223>1號(hào)位置上的Xaa是L-組氨酸，D-組氨酸，或修飾過(guò)的殘基<220>
<221>MOD_RES<222>(1)..(1)<223>1號(hào)位置上的修飾過(guò)的殘基是脫氨基-組氨酸，2-氨基-組氨酸β-羥基-組氨酸，高組氨酸，α-氟甲基-組氨酸，或α-甲基-組氨酸<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(2)..(2)<223>Xaa是Gly，Val，Leu，Ile，Ser，或Thr<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(10)..(10)<223>Xaa是Val，Trp，Ile，Leu，Phe，或Tyr
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(16)..(16)<223>Xaa是Gly，Glu，Asp，或Lys<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(19)..(19)<223>Xaa是Ala，Val，Ile，或Leu<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(27)..(27)<223>Xaa是Val或Ile<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(28)..(28)<223>Xaa是Lys，Asp，Arg，或Glu<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(30)..(30)<223>Xaa是Gly，Pro，或Arg<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(31)..(31)<223>Xaa是Gly，Pro，或Ser<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(32)..(32)<223>Xaa是Ser，Pro，或His<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(33)..(33)<223>Xaa是Ser，Arg，Thr，Trp，或Lys
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(34)..(34)<223>Xaa是Ser或Gly<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(35)..(35)<223>Xaa是Ala，Asp，Arg，Glu，Lys，或Gly<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(36)..(36)<223>Xaa是Pro或Ala<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(37)..(37)<223>Xaa是Pro，Ala，或修飾過(guò)的殘基<220>
<221>MOD_RES<222>(37)..(37)<223>酰胺化<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(38)..(38)<223>Xaa是Pro，Ala，Arg，Lys，His，不存在或修飾過(guò)的殘基<220>
<221>MOD_RES<222>(38)..(38)<223>酰胺化<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(39)..(39)<223>Xaa是Ser，His，Pro，Lys，Arg，不存在或修飾過(guò)的殘基
<220>
<221>MOD_RES<222>(39)..(39)<223>酰胺化<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(40)..(40)<223>Xaa是His，Ser，Arg，Lys，不存在或修飾過(guò)的殘基<220>
<221>MOD_RES<222>(40)..(40)<223>酰胺化<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(41)..(41)<223>Xaa是His，Ser，Arg，Lys，不存在或修飾過(guò)的殘基<220>
<221>MOD_RES<222>(41)..(41)<223>酰胺化<400>3Xaa Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Xaa Ser Ser Tyr Lys Glu Xaa1 5 10 15Gln Ala Xaa Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Xaa Xaa Gly Xaa Xaa Xaa20 25 30Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa35 40<210>4<211>41
<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成構(gòu)建體<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(1)..(1)<223>1號(hào)位置上的Xaa是L-組氨酸，D-組氨酸，或修飾過(guò)的殘基<220>
<221>MOD_RES<222>(1)..(1)<223>1號(hào)位置上的修飾過(guò)的殘基是脫氨基-組氨酸，2-氨基-組氨酸β-羥基-組氨酸，高組氨酸，α-氟甲基-組氨酸，或α-甲基-組氨酸<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(2)..(2)<223>Xaa是Gly，Val，Leu，Ile，Ser，或Thr<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(16)..(16)<223>Xaa是Gly，Glu，Asp，或Lys<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(19)..(19)<223>Xaa是Ala，Val，Ile，或Leu<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(27)..(27)<223>Xaa是Val或Ile<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(32)..(32)
<223>Xaa是Ser，Pro，或His<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(33)..(33)<223>Xaa是Ser，Arg，Thr，Trp，或Lys<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(34)..(34)<223>Xaa是Ser或Gly<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(35)..(35)<223>Xaa是Ala，Asp，Arg，Glu，Lys，或Gly<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(36)..(36)<223>Xaa是Pro或Ala<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(37)..(37)<223>Xaa是Pro，Ala，或修飾過(guò)的殘基<220>
<221>MOD_RES<222>(37)..(37)<223>酰胺化<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(38)..(38)<223>Xaa是Pro，Ala，Arg，Lys，His，不存在或修飾過(guò)的殘基<220>
<221>MOD_RES<222>(38)..(38)
<223>酰胺化<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(39)..(39)<223>Xaa是Ser，His，Pro，Lys，Arg，不存在或修飾過(guò)的殘基<220>
<221>MOD_RES<222>(39)..(39)<223>酰胺化<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(40)..(40)<223>Xaa是His，Ser，Arg，Lys，不存在或修飾過(guò)的殘基<220>
<221>MOD_RES<222>(40)..(40)<223>酰胺化<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(41)..(41)<223>Xaa是His，Ser，Arg，Lys，不存在或修飾過(guò)的殘基<220>
<221>MOD_RES<222>(41)..(41)<223>酰胺化<400>4Xaa Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Lys Glu Xaa1 5 10 15Gln Ala Xaa Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Xaa Lys Gly Gly Pro Xaa20 25 30
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa35 40<210>5<211>31<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>5His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly1 5 10 15Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly20 25 30<210>6<211>31<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成構(gòu)建體<400>6His Val Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu1 5 10 15Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly20 25 30<210>7<211>39<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成構(gòu)建體<220>
<221>MOD_RES
<222>(39)..(39)<223>39號(hào)位置上的Ser是酰胺化的<400>7His Val Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu1 5 10 15Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Ile Asp Gly Gly Pro Ser20 25 30Ser Gly Arg Pro Pro Pro Ser35<210>8<211>39<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成構(gòu)建體<220>
<221>MOD_RES<222>(39)..(39)<223>39號(hào)位置上的Ser是酰胺化的<400>8His Val Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu1 5 10 15Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly Ser20 25 30Ser Gly Asp Pro Pro Pro Ser35<210>9<211>39
<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成構(gòu)建體<220>
<221>MOD_RES<222>(39)..(39)<223>39號(hào)位置上的Ser是酰胺化的<400>9His Val Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu1 5 10 15Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Pro Ser20 25 30Ser Gly Asp Pro Pro Pro Ser35<210>10<211>39<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成構(gòu)建體<220>
<221>MOD_RES<222>(39)..(39)<223>39號(hào)位置上的Ser是酰胺化的<400>10His Val Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu1 5 10 15Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Ile Lys Gly Gly Pro Ser20 25 30
Ser Gly Asp Pro Pro Pro Ser35<210>11<211>39<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成構(gòu)建體<220>
<221>MOD_RES<222>(39)..(39)<223>39號(hào)位置上的Ser是酰胺化的<400>11His Val Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu1 5 10 15Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Pro Ser20 25 30Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser35<210>12<211>39<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成構(gòu)建體<220>
<221>MOD_RES<222>(39)..(39)<223>39號(hào)位置上的Ser是酰胺化的
<400>12His Val Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu1 5 10 15Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Ile Lys Gly Gly Pro Ser20 25 30Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser35<210>13<211>39<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成構(gòu)建體<220>
<221>MOD_RES<222>(39)..(39)<223>39號(hào)位置上的Ser是酰胺化的<400>13His Val Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu1 5 10 15Gln Ala Val Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Ile Lys Gly Gly Pro Ser20 25 30Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser35<210>14<211>39<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成構(gòu)建體<220>
<221>MOD_RES<222>(39)..(39)<223>39號(hào)位置上的Ser是酰胺化的<400>14His Val Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu1 5 10 15Gln Ala Val Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Gly Pro Ser20 25 30Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser35<210>15<211>39<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成構(gòu)建體<220>
<221>MOD_RES<222>(39)..(39)<223>39號(hào)位置上的Ser是酰胺化的<400>15His Val Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu1 5 10 15Gln Ala Val Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Ile Lys Gly Gly Pro Ser20 25 30Ser Gly Asp Pro Pro Pro Ser35
<210>16<211>39<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成構(gòu)建體<220>
<221>MOD_RES<222>(39)..(39)<223>39號(hào)位置上的Ser是酰胺化的<400>16His Val Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu1 5 10 15Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Ile Lys Gly Gly Gly Ser20 25 30Ser Gly Asp Pro Pro Pro Ser35<210>17<211>39<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成構(gòu)建體<220>
<221>MOD_RES<222>(39)..(39)<223>39號(hào)位置上的Ser是酰胺化的<400>17His Val Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu1 5 10 15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Ile Lys Gly Pro Gly Ser20 25 30Ser Gly Asp Pro Pro Pro Ser35<210>18<211>39<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成構(gòu)建體<220>
<221>MOD_RES<222>(39)..(39)<223>39號(hào)位置上的Ser是酰胺化的<400>18His Val Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu1 5 10 15Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Ile Lys Gly Gly Ser Pro20 25 30Ser Gly Asp Pro Pro Pro Ser35<210>19<211>38<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成構(gòu)建體<220>
<221>MOD_RES
<222>(38)..(38)<223>38號(hào)位置上的Ser是酰胺化的<400>19His Val Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu1 5 10 15Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Ile Lys Gly Gly Pro Ser20 25 30Ser Gly Asp Pro Pro Ser35<210>20<211>39<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成構(gòu)建體<400>20His Val Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu1 5 10 15Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Ile Lys Gly Gly Pro Ser20 25 30Ser Gly Asp Pro Pro Pro Ser35<210>21<211>39<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成構(gòu)建體
<220>
<221>MOD_RES<222>(39)..(39)<223>39號(hào)位置上的Ser是酰胺化的<400>21His Val Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu1 5 10 15Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Ile Lys Gly Gly Pro Ser20 25 30Ser Gly Asp Ala Pro Pro Ser35<210>22<211>39<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成構(gòu)建體<220>
<221>MOD_RES<222>(39)..(39)<223>39號(hào)位置上的Ser是酰胺化的<400>22His Val Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu1 5 10 15Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Ile Lys Gly Gly Pro Ser20 25 30Ser Gly Asp Pro Ala Pro Ser35
<210>23<211>39<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成構(gòu)建體<220>
<221>MOD_RES<222>(39)..(39)<223>39號(hào)位置上的Ser是酰胺化的<400>23His Val Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu1 5 10 15Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Ile Lys Gly Gly Pro Ser20 25 30Ser Gly Asp Pro Pro Ala Ser35<210>24<211>39<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成構(gòu)建體<220>
<221>MOD_RES<222>(39)..(39)<223>39號(hào)位置上的Ser是酰胺化的<400>24His Val Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu1 5 10 15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Ile Lys Gly Gly Pro Ser20 25 30Ser Gly Asp Ala Ala Ala Ser35<210>25<211>39<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成構(gòu)建體<400>25His Val Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Trp Ser Ser Tyr Leu Glu Gly1 5 10 15Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Ile Lys Gly Gly Pro Ser20 25 30Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser35<210>26<211>39<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成構(gòu)建體<400>26His Val Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Trp Ser Ser Tyr Leu Glu Gly1 5 10 15Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Ile Lys Gly Gly Pro Ser20 25 30
Ser Gly Ala Pro Pro Pro His35<210>27<211>39<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成構(gòu)建體<400>27His Val Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly1 5 10 15Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Ile Lys Gly Gly Pro Ser20 25 30Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser35<210>28<211>39<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成構(gòu)建體<400>28His Val Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly1 5 10 15Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Ile Lys Gly Gly Pro Ser20 25 30Ser Gly Asp Pro Pro Pro Ser35
<210>29<211>40<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成構(gòu)建體<400>29His Val Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Trp Ser Ser Tyr Leu Glu Gly1 5 10 15Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Ile Lys Gly Gly Pro Ser20 25 30Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser His35 40<210>30<211>40<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成構(gòu)建體<400>30His Val Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Trp Ser Ser Tyr Leu Glu Gly1 5 10 15Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Ile Lys Gly Gly Pro His20 25 30Ser Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser35 40<210>31<211>39<212>PRT<213>人工的
<220>
<223>合成構(gòu)建體<400>31His Val Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly1 5 10 15Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly Ser20 25 30Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser35<210>32<211>39<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成構(gòu)建體<400>32His Val Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly1 5 10 15Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Gly Pro Ser20 25 30Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser35<210>33<211>39<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成構(gòu)建體
<400>33His Val Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu1 5 10 15Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Gly Pro Ser20 25 30Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser35<210>34<211>39<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成構(gòu)建體<400>34His Val Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu1 5 10 15Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly Ser20 25 30Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser35<210>35<211>39<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成構(gòu)建體<400>35His Val Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu1 5 10 15
Gln Ala Val Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Ile Lys Gly Arg Gly Ser20 25 30Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser35<210>36<211>39<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成構(gòu)建體<400>36His Val Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Trp Ser Ser Tyr Leu Glu Glu1 5 10 15Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Ile Lys Gly Arg Gly Ser20 25 30Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser35<210>37<211>40<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成構(gòu)建體<400>37His Val Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu1 5 10 15Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Ile Lys Gly Arg Gly His20 25 30
Ser Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser35 40<210>38<211>40<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成構(gòu)建體<400>38His Val Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu1 5 10 15Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly His20 25 30Ser Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser35 40<210>39<211>41<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成構(gòu)建體<400>39His Val Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Trp Ser Ser Tyr Leu Glu Glu1 5 10 15Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Ile Lys Gly Gly Pro His20 25 30Ser Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser His35 40
<210>40<211>40<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成構(gòu)建體<400>40His Val Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Trp Ser Ser Tyr Leu Glu Glu1 5 10 15Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Ile Lys Gly Gly Pro Ser20 25 30Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser His35 40<210>41<211>40<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成構(gòu)建體<400>41His Val Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Trp Tyr Leu Glu Gly1 5 10 15Gln Ala Val Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Ile Lys Gly Gly Pro His20 25 30Ser Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser35 40<210>42<211>39
<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成構(gòu)建體<400>42His Val Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu1 5 10 15Gln Ala Val Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Ile Lys Gly Gly Pro Ser20 25 30Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser35<210>43<211>40<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成構(gòu)建體<400>43His Val Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu1 5 10 15Gln Ala Val Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Ile Lys Gly Gly Pro Ser20 25 30Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser His35 40<210>44<211>39<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成構(gòu)建體<400>44His Val Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Trp Ser Ser Tyr Leu Glu Glu1 5 10 15Gln Ala Val Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Ile Lys Gly Gly Pro Ser20 25 30Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser35<210>45<211>40<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成構(gòu)建體<400>45His Val Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Trp Ser Ser Tyr Leu Glu Glu1 5 10 15Gln Ala Val Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Ile Lys Gly Gly Pro Ser20 25 30Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser His35 40<210>46<211>40<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成構(gòu)建體<400>46
His Val Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Trp Ser Ser Tyr Leu Glu Glu1 5 10 15Gln Ala Val Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Ile Lys Gly Gly Pro His20 25 30Ser Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser35 40<210>47<211>40<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成構(gòu)建體<400>47His Val Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Trp Ser Lys Tyr Leu Glu Glu1 5 10 15Gln Ala Val Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Ile Lys Gly Gly Pro Ser20 25 30Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser His35 40<210>48<211>40<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成構(gòu)建體<400>48His Val Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu1 5 10 15
Gln Ala Val Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Ile Lys Gly Gly Pro Ser20 25 30Ser Gly Ala Pro Pro Pro Arg Gly35 40<210>49<211>40<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成構(gòu)建體<220>
<221>MOD_RES<222>(40)..(40)<223>40號(hào)位置上的Gly是酰胺化的<400>49His Val Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu1 5 10 15Gln Ala Val Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Ile Lys Gly Gly Pro Ser20 25 30Ser Gly Ala Pro Pro Pro Arg Gly35 40<210>50<211>39<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成構(gòu)建體<220>
<221>MOD_RES<222>(39)..(39)<223>39號(hào)位置上的Ser是酰胺化的
<400>50His Val Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu1 5 10 15Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Gly Pro Ser20 25 30Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser35<210>51<211>39<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成構(gòu)建體<220>
<221>MOD_RES<222>(39)..(39)<223>39號(hào)位置上的Ser是酰胺化的<400>51His Val Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu1 5 10 15Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Asp Gly Gly Pro Ser20 25 30Ser Gly Arg Pro Pro Pro Ser35<210>52<211>39<212>PRT<213>人工的
<220>
<223>合成構(gòu)建體<400>52His Val Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu1 5 10 15Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Asp Gly Gly Pro Ser20 25 30Ser Gly Arg Pro Pro Pro Ser35<210>53<211>39<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成構(gòu)建體<400>53His Val Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu1 5 10 15Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Asp Gly Gly Pro Ser20 25 30Ser Gly Lys Pro Pro Pro Ser35<210>54<211>36<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成構(gòu)建體
<400>54His Val Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu1 5 10 15Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Asp Gly Gly Pro Ser20 25 30Ser Gly Arg Gly35<210>55<211>39<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成構(gòu)建體<400>55His Val Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu1 5 10 15Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Ile Lys Gly Gly Pro Ser20 25 30Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser35<210>56<211>39<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成構(gòu)建體<400>56His Val Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu1 5 10 15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Gly Pro Ser20 25 30Trp Gly Ala Pro Pro Pro Ser35<210>57<211>41<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成構(gòu)建體<400>57His Val Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu1 5 10 15Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Ile Lys Gly Gly Pro Ser20 25 30Ser Gly Ala Pro Pro Pro Gly Pro Ser35 40<210>58<211>44<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成構(gòu)建體<400>58His Val Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu1 5 10 15Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Ile Lys Gly Gly Pro Ser20 25 30
Ser Gly Ala Pro Pro Pro Gly Pro Ser Gly Pro Ser35 40<210>59<211>31<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成構(gòu)建體<400>59His Val Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly1 5 10 15Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly20 25 30<210>60<211>44<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成構(gòu)建體<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(32)..(32)<223>Xaa是Ser，Pro，或His<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(33)..(33)<223>Xaa是Ser，Arg，Thr，Trp，或Lys<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(34)..(34)<223>Xaa是Ser或Gly
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(35)..(35)<223>Xaa是Ala，Asp，Arg，Glu，Lys，Gly或修飾過(guò)的殘基<220>
<221>MOD_RES<222>(35)..(35)<223>酰胺化<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(36)..(36)<223>Xaa是Pro，AIa，不存在或修飾過(guò)的殘基<220>
<221>MOD_RES<222>(36)..(36)<223>酰胺化<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(37)..(37)<223>Xaa是Pro，Ala，不存在或修飾過(guò)的殘基<220>
<221>MOD_RES<222>(37)..(37)<223>酰胺化<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(38)..(38)<223>Xaa是Pro，Ala，Arg，Lys，His，不存在或修飾過(guò)的殘基<220>
<221>MOD_RES<222>(38)..(38)<223>酰胺化
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(39)..(39)<223>Xaa是Ser，His，Pro，Lys，Arg，Gly，不存在或修飾過(guò)的殘基<220>
<221>MOD_RES<222>(39)..(39)<223>酰胺化<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(40)..(40)<223>Xaa是His，Ser，Arg，Lys，Pro，Gly，不存在或修飾過(guò)的殘基<220>
<221>MOD_RES<222>(40)..(40)<223>酰胺化<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(41)..(41)<223>Xaa是His，Ser，Arg，Lys，不存在或修飾過(guò)的殘基<220>
<221>MOD_RES<222>(41)..(41)<223>酰胺化<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(42)..(42)<223>Xaa是Gly，His，不存在或修飾過(guò)的殘基<220>
<221>MOD_RES<222>(42)..(42)<223>酰胺化
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(43)..(43)<223>Xaa是Pro，His，不存在或修飾過(guò)的殘基<220>
<221>MOD_RES<222>(43)..(43)<223>酰胺化<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(44)..(44)<223>Xaa是Ser，His，不存在或修飾過(guò)的殘基<220>
<221>MOD_RES<222>(44)..(44)<223>酰胺化<400>60His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly1 5 10 15Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Gly Pro Xaa20 25 30Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa35 40<210>61<211>44<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成構(gòu)建體
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(1)..(1)<223>1號(hào)位置上的Xaa是L-組氨酸，D-組氨酸，或修飾過(guò)的殘基<220>
<221>MOD_RES<222>(1)..(1)<223>1號(hào)位置上的修飾過(guò)的殘基是脫氨基-組氨酸，2-氨基-組氨酸，β-羥基組氨酸，高組氨酸，α-氟甲基-組氨酸，或α-甲基-組氨酸<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(2)..(2)<223>2號(hào)位置上的Xaa是Ala，Gly，Val，Leu，Ile，Ser，或Thr<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(6)..(6)<223>6號(hào)位置上的Xaa是Phe，Trp，或Tyr<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(10)..(10)<223>10號(hào)位置上的Xaa是Val，Trp，Ile，Leu，Phe，或Tyr<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(12)..(12)<223>12號(hào)位置上的Xaa是Ser，Trp，Tyr，Phe，Lys，Ile，Leu，或Val<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(13)..(13)<223>13號(hào)位置上的Xaa是Tyr，Trp，或Phe<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(14)..(14)
<223>14號(hào)位置上的Xaa是Leu，Phe，Tyr，或Trp<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(16)..(16)<223>16號(hào)位置上的Xaa是Gly，Glu，Asp，或Lys<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(19)..(19)<223>19號(hào)位置上的Xaa是Ala，Val，Ile，或Leu<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(21)..(21)<223>21號(hào)位置上的Xaa是Glu，Ile，或Ala<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(24)..(24)<223>24號(hào)位置上的Xaa是Ala或Glu<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(27)..(27)<223>27號(hào)位置上的Xaa是Val或Ile<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(28)..(28)<223>28號(hào)位置上的Xaa是Lys，Asp，Arg，或Glu<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(30)..(30)<223>30號(hào)位置上的Xaa是Gly，Pro，或Arg<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(31)..(31)
<223>31號(hào)位置上的Xaa是Gly，Pro，或Ser<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(32)..(32)<223>32號(hào)位置上的Xaa是Ser，Pro，或His<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(33)..(33)<223>33號(hào)位置上的Xaa是Ser，Arg，Thr，Trp，或Lys<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(34)..(34)<223>34號(hào)位置上的Xaa是Ser或Gly<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(35)..(35)<223>35號(hào)位置上的Xaa是Ala，Asp，Arg，Glu，Lys，Gly，或修飾過(guò)的殘基<220>
<221>MOD_RES<222>(35)..(35)<223>酰胺化<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(36)..(36)<223>36號(hào)位置上的Xaa是Pro，Ala，不存在或修飾過(guò)的殘基.
<220>
<221>MOD_RES<222>(36)..(36)<223>酰胺化<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(37)..(37)
<223>Xaa是Pro，Ala，不存在，或修飾過(guò)的殘基<220>
<221>MOD_RES<222>(37)..(37)<223>酰胺化<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(38)..(38)<223>Xaa是Pro，Ala，Arg，Lys，His，不存在或修飾過(guò)的殘基<220>
<221>MOD_RES<222>(38)..(38)<223>酰胺化<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(39)..(39)<223>Xaa是Ser，His，Pro，Lys，Arg，Gly，不存在或修飾過(guò)的殘基<220>
<221>MOD_RES<222>(39)..(39)<223>酰胺化<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(40)..(40)<223>Xaa是His，Ser，Arg，Lys，Pro，Gly，不存在或修飾過(guò)的殘基<220>
<221>MOD_RES<222>(40)..(40)<223>酰胺化<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(41)..(41)
<223>Xaa是His，Ser，Arg，Lys，不存在或修飾過(guò)的殘基<220>
<221>MOD_RES<222>(41)..(41)<223>酰胺化<400>61Xaa Xaa Glu Gly Thr Xaa Thr Ser Asp Xaa Ser Xaa Xaa Xaa Glu Xaa1 5 10 15Gln Ala Xaa Lys Xaa Phe Ile Xaa Trp Leu Xaa Xaa Gly Xaa Xaa Xaa20 25 30Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa35 40
權(quán)利要求
1.一種延伸的GLP-1肽，它包括具有下式的氨基酸序列Xaa7-Xaa8-Glu-Gly-Thr-Xaa12-Thr-Ser-Asp-Xaa16-Ser-Xaa18-Xaa19-Xaa20-Glu-Xaa22-Gln-Ala-Xaa25-Lys-Xaa27-Phe-Ile-Xaa30-Trp-Leu-Xaa33-Xaa34-Gly-Xaa36-Xaa37-Xaa38-Xaa39-Xaa40-Xaa41-Xaa42-Xaa43-Xaa44-Xaa45-Xaa46-Xaa47式1(SEQ ID NO1)其中Xaa7是L-組氨酸，D-組氨酸，脫氨基-組氨酸，2-氨基-組氨酸，β-羥基-組氨酸，高組氨酸，α-氟甲基-組氨酸，或α-甲基-組氨酸；Xaa8是Ala，Gly，Val，Leu，Ile，Ser，或Thr；Xaa12是Phe，Trp，或Tyr；Xaa16是Val，Trp，Ile，Leu，Phe，或Tyr；Xaa18是Ser，Trp，Tyr，Phe，Lys，Ile，Leu，Val；Xaa19是Tyr，Trp，或Phe；Xaa20是Leu，Phe，Tyr，或Trp；Xaa22是Gly，Glu，Asp，或Lys；Xaa25是Ala，Val，Ile，或Leu；Xaa27是Glu，Ile，或Ala；Xaa30是Ala或GluXaa33是Val或Ile；Xaa34是Lys，Asp，Arg，或Glu；Xaa36是Gly，Pro，或Arg；Xaa37是Gly，Pro，或Ser；Xaa38是Ser，Pro，或His；Xaa39是Ser，Arg，Thr，Trp，或Lys；Xaa40是Ser或Gly；Xaa41是Ala，Asp，Arg，Glu，Lys，或Gly；Xaa42是Pro，Ala，NH2，或不存在；Xaa43是Pro，Ala，NH2，或不存在；Xaa44是Pro，Ala，Arg，Lys，His，NH2，或不存在；Xaa45是Ser，His，Pro，Lys，Arg，NH2或不存在；Xaa46是His，Ser，Arg，Lys，NH2或不存在；以及Xaa47是His，Ser，Arg，Lys，NH2或不存在；其前提是，如果Xaa42，Xaa43，Xaa44，Xaa45，Xaa46，或Xaa47不存在，每一個(gè)下游氨基酸也是不存在的，并且其前提還是，如果Xaa36是Arg并且Xaa37是Gly或Ser，GLP-1肽不具有以下始于Xaa38的C-末端氨基酸延伸Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH2。
2.如權(quán)利要求1的GLP-1肽，其中，所述肽的前31個(gè)氨基酸與GLP-1(7-37)的差異不超過(guò)6個(gè)氨基酸。
3.如權(quán)利要求2的GLP-1肽，其中，所述肽的前31個(gè)氨基酸與GLP-1(7-37)的差異不超過(guò)5個(gè)氨基酸。
4.如權(quán)利要求3的GLP-1肽，其中，所述肽的前31個(gè)氨基酸與GLP-1(7-37)的差異不超過(guò)4個(gè)氨基酸。
5.如權(quán)利要求4的GLP-1肽，其中，所述肽的前31個(gè)氨基酸與GLP-1(7-37)的差異不超過(guò)3個(gè)氨基酸。
6.如權(quán)利要求1-5中任意一項(xiàng)的GLP-1肽，其中，Xaa7是L-組氨酸，Xaa8是Val或Gly，并且Xaa22是Glu。
7.如權(quán)利要求1-5中任意一項(xiàng)的GLP-1肽，其中，Xaa7是L-組氨酸，Xaa8是Val或Gly，并且Xaa16是Trp。
8.如權(quán)利要求7的GLP-1肽，其中，Xaa22是Glu。
9.如權(quán)利要求1-5中任意一項(xiàng)的GLP-1肽，其中，Xaa7是L-組氨酸，Xaa8是Val或Gly，并且Xaa25是Val。
10.如權(quán)利要求9的GLP-1肽，其中，Xaa22是Glu。
11.如權(quán)利要求1-5中任意一項(xiàng)的GLP-1肽，其中，Xaa7是L-組氨酸，Xaa8是Val或Gly，并且Xaa33是Ile。
12.如權(quán)利要求11的GLP-1肽，其中，Xaa22是Glu。
13.如權(quán)利要求1-5中任意一項(xiàng)的GLP-1肽，其中，Xaa7是L-組氨酸，Xaa8是Val或Gly，并且Xaa34是Asp。
14.如權(quán)利要求13的GLP-1肽，其中，Xaa22是Glu。
15.如權(quán)利要求13的GLP-1肽，其中，Xaa41是Arg。
16.如權(quán)利要求1-5中任意一項(xiàng)的GLP-1肽，其中，Xaa7是L-組氨酸，Xaa8是Val或Gly，Xaa36是Gly，并且Xaa37是Pro。
17.如權(quán)利要求1-5中任意一項(xiàng)的GLP-1肽，其中，Xaa7是L-組氨酸，Xaa8是Val或Gly，并且Xaa18是Trp。
18.如權(quán)利要求1-5中任意一項(xiàng)的GLP-1肽，其中，Xaa7是L-組氨酸，Xaa8是Val或Gly，并且Xaa20是Trp。
19.如權(quán)利要求1-18中任意一項(xiàng)的GLP-1肽，其中，C-末端氨基酸是酰胺化的。
20.如權(quán)利要求1-5中任意一項(xiàng)的GLP-1肽，其中，C-末端氨基酸是His。
21.一種延伸的GLP-1肽，它包括具有下式的氨基酸序列Xaa7-Xaa8-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Xaa16-Ser-Ser-Tyr-Lys-Glu-Xaa22-Gln-Ala-Xaa25-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Xaa33-Xaa34-Gly-Xaa36-Xaa37-Xaa38-Xaa39-Xaa40-Xaa41-Xaa42-Xaa43-Xaa44-Xaa45-Xaa46-Xaa47式3(SEQ ID NO3)其中Xaa7是L-組氨酸，D-組氨酸，脫氨基-組氨酸，2-氨基-組氨酸，β-羥基-組氨酸，高組氨酸，α-氟甲基-組氨酸，或α-甲基-組氨酸；Xaa8是Gly，Val，Leu，Ile，Ser，或Thr；Xaa16是Val，Trp，Ile，Leu，Phe，或Tyr；Xaa22是Gly，Glu，Asp，或Lys；Xaa25是Ala，Val，Ile，或Leu；Xaa33是Val或Ile；Xaa34是Lys，Asp，Arg，或Glu；Xaa36是Gly，Pro，或Arg；Xaa37是Gly，Pro，或Ser；Xaa38是Ser，Pro，或His；Xaa39是Ser，Arg，Thr，Trp，或Lys；Xaa40是Ser或Gly；Xaa41是Ala，Asp，Arg，Glu，Lys，或Gly；Xaa42是Pro，Ala，NH2或不存在；Xaa43是Pro，Ala，NH2或不存在；Xaa44是Pro，Ala，Arg，Lys，His，NH2，或不存在；Xaa45是Ser，His，Pro，Lys，Arg，NH2或不存在；Xaa46是His，Ser，Arg，Lys，NH2或不存在；以及Xaa47是His，Ser，Arg，Lys，NH2或不存在；其前提是，如果Xaa42，Xaa43，Xaa44，Xaa45，Xaa46，或Xaa47不存在，每一個(gè)下游氨基酸也是不存在的，并且其前提還是，如果Xaa36是Arg并且Xaa37是Gly或Ser，所述GLP-1肽不具有以下始于Xaa38的C-末端氨基酸延伸Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH2。
22.如權(quán)利要求21的GLP-1肽，其中Xaa7是L-組氨酸；Xaa8是Gly或Val；Xaa16是Phe，Trp，Tyr，Ile，或Leu；Xaa22是Glu；以及Xaa25是Ala；Xaa33是Ile；Xaa36是Gly；以及Xaa37是Pro。
23.如權(quán)利要求22的GLP-1化合物，其中Xaa16是Trp。
24.如權(quán)利要求22的GLP-1化合物，其中Xaa16是Phe。
25.如權(quán)利要求22的GLP-1化合物，其中Xaa16是Tyr。
26.如權(quán)利要求22的GLP-1化合物，其中Xaa7是L-組氨酸；Xaa8是Gly或Val；Xaa16是Val；Xaa22是Glu；以及Xaa33是Ile。
27.一種延伸的GLP-1肽，它包括具有下式的氨基酸序列Xaa7-Xaa8-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Lys-Glu-Xaa22-Gln-Ala-Xaa25-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Xaa33-Lys-Gly-Gly-Pro-Xaa38-Xaa39-Xaa40-Xaa41-Xaa42-Xaa43-Xaa44-Xaa45-Xaa46-Xaa47式4(SEQ ID NO4)其中Xaa7是L-組氨酸，D-組氨酸，脫氨基-組氨酸，2-氨基-組氨酸，β-羥基-組氨酸，高組氨酸，α-氟甲基-組氨酸，或α-甲基-組氨酸；Xaa8是Gly，Val，Leu，Ile，Ser，或Thr；Xaa22是Gly，Glu，Asp，或Lys；Xaa25是Ala，Val，Ile，或Leu；Xaa33是Val或Ile；Xaa38是Ser，Pro，或His；Xaa39是Ser，Arg，Thr，Trp，或Lys；Xaa40是Ser或Gly；Xaa41是Ala，Asp，Arg，Glu，Lys，或Gly；Xaa42是Pro或Ala；Xaa43是Pro或Ala；Xaa44是Pro，Ala，Arg，Lys，His，NH2，或不存在；Xaa45是Ser，His，Pro，Lys，Arg，NH2或不存在；Xaa46是His，Ser，Arg，Lys，NH2或不存在；以及Xaa47是His，Ser，Arg，Lys，NH2或不存在；其前提是，如果Xaa44，Xaa45，Xaa46，或Xaa47不存在，每一個(gè)下游氨基酸也是不存在的。
28.如權(quán)利要求27的GLP-1肽，其中，Xaa7是L-組氨酸，Xaa8是Val或Gly，且Xaa22是Glu。
29.如權(quán)利要求27的GLP-1肽，其中，Xaa7是L-組氨酸，Xaa8是Val或Gly，Xaa22是Glu，且Xaa33是Ile。
30.如權(quán)利要求27的GLP-1肽，其中，Xaa7是L-組氨酸，Xaa8是Val或Gly，Xaa22是Glu，Xaa25是Val，且Xaa33是Ile。
31.如權(quán)利要求27的GLP-1肽，其中，Xaa7是L-組氨酸，Xaa8是Val或Gly，Xaa22是Glu，Xaa33是Ile，Xaa38是Ser，Xaa39是Ser，Xaa40是Gly，Xaa41是Ala，Xaa42是Pro，Xaa43是Pro，Xaa44是Pro，Xaa45是Ser，而Xaa46不存在。
32.如權(quán)利要求31的GLP-1肽，其中，Xaa8是Val。
33.一種延伸的GLP-1肽，它包括具有下式的氨基酸序列His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Gly-Pro-Xaa38-Xaa39-Xaa40-Xaa41-Xaa42-Xaa43-Xaa44-Xaa45-Xaa46-Xaa47-Xaa48-Xaa49-Xaa50式5(SEQ ID NO60)其中Xaa38是Ser，Pro，或His；Xaa39是Ser，Arg，Thr，Trp，或Lys；Xaa40是Ser或Gly；Xaa41是Ala，Asp，Arg，Glu，Lys，或Gly；Xaa42是Pro，Ala，NH2，或不存在；Xaa43是Pro，Ala，NH2，或不存在；Xaa44是Pro，Ala，Arg，Lys，His，NH2，或不存在；Xaa45是Ser，His，Pro，Lys，Arg，Gly，NH2或不存在；Xaa46是His，Ser，Arg，Lys，Pro，Gly，NH2或不存在；以及Xaa47是His，Ser，Arg，Lys，NH2或不存在；Xaa48是Gly，His，NH2或不存在；Xaa49是Pro，His，NH2或不存在；以及Xaa50是Ser，His，Ser-NH2，His-NH2或不存在；其中，所述GLP-1肽包括1-6個(gè)其他取代，并且，其前提是，如果Xaa42，Xaa43，Xaa44，Xaa45，Xaa46，Xaa47，Xaa48，或Xaa49不存在，每一個(gè)下游氨基酸也是不存在的。
34.如權(quán)利要求33的GLP-1肽，其中，所述其他取代選自下組取代中的至少一個(gè)a)7號(hào)位置上的His被D-組氨酸，脫氨基-組氨酸，2-氨基-組氨酸，β-羥基-組氨酸，高組氨酸，α-氟甲基-組氨酸，或α-甲基-組氨酸取代；b)8號(hào)位置上的Ala被Gly，Val，Leu，Ile，Ser，或Thr取代；c)12號(hào)位置上的Phe被Trp，或Tyr取代；d)16號(hào)位置上的Val被Trp，Ile，Leu，Phe，或Tyr取代；e)18號(hào)位置上的Ser被Trp，Tyr，Phe，Lys，Ile，Leu，或Val取代；f)19號(hào)位置上的Tyr被Trp或Phe取代；g)20號(hào)位置上的Leu被Phe，Tyr，或Trp取代；h)22號(hào)位置上的Gly被Glu，Asp，或Lys取代；i)25號(hào)位置上的Ala被Val，Ile，或Leu取代；j)27號(hào)位置上的Glu被Ile或Ala取代；k)30號(hào)位置上的Ala被Glu取代；l)33號(hào)位置上的Val被Ile取代；和m)34號(hào)位置上的Lys被Asp，Arg或Glu取代。
35.如權(quán)利要求34的GLP-1肽，其中，所述其他取代選自下組a)8號(hào)位置上的Ala被Val或Gly取代；b)22號(hào)位置上的Gly被Glu取代；和c)33號(hào)位置上的Val被Ile取代。
36.一種在需要血液葡萄糖正?；膶?duì)象體內(nèi)刺激GLP-1受體的方法，所述方法包括給所述對(duì)象施用有效量的權(quán)利要求1-35中任意一項(xiàng)的GLP-1肽的步驟。
37.如權(quán)利要求36的方法，其中，所述對(duì)象正在進(jìn)行非胰島素依賴(lài)型糖尿病的治療。
38.一種預(yù)防性治療對(duì)象的非胰島素依賴(lài)型糖尿病的方法，包括給所述對(duì)象施用有效量的權(quán)利要求1-35中任意一項(xiàng)的GLP-1肽的步驟。
39.一種減輕或保持有需要的對(duì)象的體重的方法，包括給所述對(duì)象施用有效量的權(quán)利要求1-35中任意一項(xiàng)的GLP-1化合物。
40.一種治療有需要的患者的肥胖的方法，包括給所述對(duì)象施用有效量的權(quán)利要求1-35中任意一項(xiàng)的GLP-1化合物。
41.一種治療有需要的患者的中風(fēng)，心肌梗塞，應(yīng)激誘導(dǎo)的高血糖癥，或腸激惹綜合征的方法，包括給所述對(duì)象施用有效量的權(quán)利要求1-35中任意一項(xiàng)的GLP-1化合物。
42.權(quán)利要求1-35中任意一項(xiàng)的GLP-1化合物在制備用于治療非胰島素依賴(lài)型糖尿病，肥胖，中風(fēng)，心肌梗塞，應(yīng)激誘導(dǎo)的高血糖癥，或腸激惹綜合征的藥物中的用途。
43.如權(quán)利要求42的用途，其中，所述藥物用于治療非胰島素依賴(lài)型糖尿病。
44.如權(quán)利要求42的用途，其中，所述藥物用于治療肥胖。
45.一種制備藥物制劑的方法，包括將權(quán)利要求1-35中任意一項(xiàng)的GLP-1肽與藥用載體混合。
46.一種藥物制劑，包括權(quán)利要求1-35中任意一項(xiàng)的GLP-1化合物和藥用載體。
全文摘要
本發(fā)明涉及在與延伸的C－末端偶聯(lián)的多個(gè)位點(diǎn)上具有修飾的GLP－1肽，所述修飾提供了增強(qiáng)的穩(wěn)定性。
文檔編號(hào)C07K5/00GK101048173SQ03802038
公開(kāi)日2007年10月3日 申請(qǐng)日期2003年1月3日 優(yōu)先權(quán)日2002年1月8日
發(fā)明者W·格萊斯納, W·D·科恩, R·L·小米利坎, L·張 申請(qǐng)人:伊萊利利公司