一種植物組成型過(guò)量表達(dá)載體、分枝且高產(chǎn)油菜的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種植物組成型過(guò)量表達(dá)載體、分枝且高產(chǎn) 油菜的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 油菜（BrassicanapusL.)不但是世界上僅次于大豆的第二大食用油脂植物而 且同時(shí)也是植物油和植物蛋白的主要來(lái)源之一，占我國(guó)油料作物總產(chǎn)量的40%~45%。 油菜不是一個(gè)單一的物種，它包括蕓薹屬中許多種，根據(jù)我國(guó)栽培的油菜植物形態(tài)特征， 遺傳親緣關(guān)系，結(jié)合農(nóng)藝性狀，栽培利用特點(diǎn)等可分為三大類型：即白菜型油菜（Brassica campestris)、芥菜型油菜（Brassicajuncea)和甘藍(lán)型油菜（BrassicanapusL.)。甘 藍(lán)型油菜（BrassicanapusL.，AACC2n= 38)是由蕓薹（AA2n= 20)和甘藍(lán)（Brassica 01ercea，CC2n= 18)通過(guò)自然種間雜交后自然加倍進(jìn)化而來(lái)的一個(gè)復(fù)合種。
[0003] DHHC(Asp-His-His-Cys)型鋅指結(jié)構(gòu)域是一種富含半胱氨酸高度保守的鋅指結(jié)構(gòu) 域，常出現(xiàn)在DNA結(jié)合蛋白中的一種結(jié)構(gòu)基元。屬于類C2H2型鋅指，其序列特征為：C-X2-C-x9-hc-x 2-c-x4-dhhc-x5-c-x4-n-x3-f(c代表半胱氨酸；H代表組氨酸；X代表任意氨基酸）。
[0004] 目前，對(duì)DHHC型鋅指結(jié)構(gòu)域的研宄主要集中在酵母和哺乳動(dòng)物，植物中的DHHC型 鋅指蛋白研宄相對(duì)較少。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種植物組成型過(guò)量表達(dá)載體、轉(zhuǎn)基因油菜的制備方法， 旨在通過(guò)所獲得的植物組成型過(guò)量表達(dá)載體構(gòu)建一種分支數(shù)和產(chǎn)量都增加的油菜新品種。
[0006] 本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的，一種植物組成型過(guò)量表達(dá)載體，該表達(dá)載體由35S啟動(dòng)子 驅(qū)動(dòng)OsDHHCl基因和⑶S基因形成的融合基因，即35S::0sDHHCl-GUS;其中，所述OsDHHCl 基因是水稻中編碼DHHC型鋅指蛋白的0s02g0819100基因的另外一種剪接方式，其堿基序 列如SEQIDN0 :1所示。
[0007] 本發(fā)明進(jìn)一步提供了上述植物組成型過(guò)量表達(dá)載體的構(gòu)建方法，包括以下步驟：
[0008] (1)以水稻CDNA為模板，通過(guò)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增；其中，所述引物為：
[0009]OsDHHCl基因引物-F :
[0010]5 ' -CATGCATGCCATGGTGCTGGCACATATATCTCTTATGTC-3 '，
[0011]OsDHHCl基因引物-R:
[0012] 5' -GGAAGATCTGGAAGATCTGTTGTTTGTGATCTGGAACTCAGTG-3' ；
[0013] (2)將步驟（1)中的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物克隆到pUCm-T載體中，經(jīng)測(cè)序鑒定后，用Ncol 和Bglll雙酶切pUCm-T載體和pCAMBIA1301載體，分別回收小片段和大片段，然后進(jìn)行連 接；
[0014] (3)將步驟⑵得到的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，經(jīng)抗生素篩選獲得陽(yáng)性克 隆；提取陽(yáng)性克隆的質(zhì)粒，得到植物組成型過(guò)量表達(dá)載體。
[0015]優(yōu)選地，在步驟（3)中，所述轉(zhuǎn)化的方法是農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法。
[0016] 優(yōu)選地，在步驟（3)中，所述轉(zhuǎn)化的方法為將所述植物組成型過(guò)量表達(dá)載體電擊 轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101，經(jīng)100yg/ml利福平和50yg/ml卡那霉素篩選獲得陽(yáng)性克隆，再進(jìn)行 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化。
[0017] 本發(fā)明進(jìn)一步提供了一種分枝且高產(chǎn)油菜的制備方法，包括以下步驟：
[0018] (1)通過(guò)上述植物組成型過(guò)量表達(dá)載體轉(zhuǎn)化甘藍(lán)型油菜植株；
[0019] (2)通過(guò)抗性篩選和RT-PCR鑒定得到獲得分枝且高產(chǎn)油菜。
[0020] 優(yōu)選地，在步驟（1)中，所述轉(zhuǎn)化采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因方法。
[0021] 優(yōu)選地，所述步驟（2)具體包括：
[0022] 對(duì)T1代幼苗進(jìn)行潮霉素抗性篩選，獲得的抗性幼苗實(shí)行單株收種；
[0023] 對(duì)T2代幼苗繼續(xù)進(jìn)行潮霉素抗性篩選，獲得純合子轉(zhuǎn)基因株系；
[0024] 采用RT-PCR方法對(duì)獲得的純合子轉(zhuǎn)基因株系進(jìn)行鑒定，獲得目的基因OsDHHCl表 達(dá)量明顯增加的轉(zhuǎn)基因純合子株系。
[0025] 為克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)和不足，本發(fā)明提供了一種植物組成型過(guò)量表達(dá)載體、分 枝且高產(chǎn)油菜的制備方法，利用水稻的DHHC型鋅指蛋白基因OsDHHCl，構(gòu)建該基因的植物 組成型表達(dá)載體，并將其轉(zhuǎn)化甘藍(lán)型油菜，通過(guò)抗性篩選，RT-PCR鑒定等獲得分支數(shù)增加的 轉(zhuǎn)基因植株。分析發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因植株的產(chǎn)量比野生型明顯增加，即本發(fā)明通過(guò)遺傳轉(zhuǎn)化培育 出了一個(gè)多分枝且高產(chǎn)的油菜新品種。
【附圖說(shuō)明】
[0026] 圖1是本發(fā)明Ti類質(zhì)粒pCAMBIA1301載體的T-DNA表達(dá)框的結(jié)構(gòu)示意圖；
[0027] 圖2是本發(fā)明含OsDHHCl基因的Ti類質(zhì)粒pCAMBIA1301載體的T-DNA表達(dá)框的 結(jié)構(gòu)示意圖；其中，35S:CaMV35S啟動(dòng)子；OsDHHCl:水稻中編碼DHHC型鋅指蛋白的基因； hygR:潮霉素抗性標(biāo)記基因；⑶S: 0 -葡萄糖苷酸酶基因；LB和RB:分別為T(mén)-DNA的左邊界 和右邊界；MCS:多克隆位點(diǎn)；Ncol和Bglll:將OsDHHCl基因構(gòu)建在pCAMBIA1301載體上所 用的酶切位點(diǎn)；
[0028] 圖3是本發(fā)明中分枝且高產(chǎn)油菜與野生型油菜的形態(tài)對(duì)比圖；A其中，WT為野生 型，335S::0sDHHCl-GUS-l、35S::0sDHHCl-GUS-2 和 35S::0sDHHCl-GUS-3 為轉(zhuǎn)基因油菜 的三個(gè)不同株系；
[0029] 圖4是本發(fā)明中分枝且高產(chǎn)油菜和野生型的分支數(shù)比較圖；其中，WT為野生型， 335S: :0sDHHCl-GUS-l、35S: :0sDHHCl-GUS-2 和 35S: :0sDHHCl-GUS-3 為轉(zhuǎn)基因油菜； PCAMBIA1301為pCAMBIA1301空載的轉(zhuǎn)基因植株；
[0030] 圖5是本發(fā)明中分枝且高產(chǎn)油菜與野生型油菜的⑶S組織化學(xué)定位檢測(cè)結(jié)果圖； 其中，WT為野生型；335S::0sDHHCl-GUS為分枝且高產(chǎn)油菜；
[0031] 圖6是本發(fā)明中分枝且高產(chǎn)油菜中Hyg基因的檢測(cè)結(jié)果圖；Hyg基因是潮霉素篩 選標(biāo)記基因；
[0032] 圖7是本發(fā)明中分枝且高產(chǎn)油菜的半定量RT-PCR鑒定結(jié)果圖；
[0033] 圖8是本發(fā)明中分枝且高產(chǎn)油菜的OsDHHCl-GUS基因的檢測(cè)；
[0034] 圖9是本發(fā)明分枝且高產(chǎn)油菜和野生型的產(chǎn)量比較圖；其中，WT為野生型， 35S::0sDHHCl-GUS-l、35S: ::0sDHHCl-GUS-2 和 35S::0sDHHCl-GUS-3 為轉(zhuǎn)基因油菜； PCAMBIA1301為pCAMBIA1301空載的轉(zhuǎn)基因植株。
【具體實(shí)施方式】
[0035] 為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合附圖及實(shí)施例，對(duì) 本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并 不用于限定本發(fā)明。
[0036] 實(shí)施例1分枝且高產(chǎn)油菜的制備
[0037] 1、OsDHHCl基因克隆和35S::0sDHHCl-GUS表達(dá)載體的構(gòu)建
[0038] 水稻DHHC型鋅指蛋白基因OsDHHCl為發(fā)明人新克隆的基因，是NCBI中 0s02g819100的另外一種剪接方式，其堿基序列如SEQIDN0:1所示。采用primer5軟件 設(shè)計(jì)PCR引物，引物如下所示：
[0039]OsDHHCl基因引物-F:
[0040]5' -CATGCATGCCATGGTGCTGGCACATATATCTCTTATGTC-3 '，
[0041]OsDHHCl基因引物-R :
[0042] 5' -GGAAGATCTGGAAGATCTGTTGTTTGTGATCTGGAACTCAGTG-3?,
[0043] 上述兩個(gè)引物劃線部分為引入的Ncol和Bglll酶切位點(diǎn)。以油菜的cDNA為模板， 利用上述引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。得到的PCR產(chǎn)物首先克隆到pUCm-T載體（購(gòu)于上海生共生 物工程有限公司）中，經(jīng)測(cè)序鑒定后，用Ncol和Bglll雙酶切pUCm-T載體和pCAMBIA1301 載體（圖1)，分別回收小片段和大片段，然后進(jìn)行連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a， 經(jīng)抗生素（50yg/ml卡那霉素）篩選獲得陽(yáng)性克隆。提取陽(yáng)性克隆的質(zhì)粒，得到35S:: OsDHHCl-GUS表達(dá)載體（圖2)。
[0044] 2、油菜的轉(zhuǎn)化
[0045] 根據(jù)BI0-RAD電擊轉(zhuǎn)化儀說(shuō)明書(shū)將35S::0sDHHCl-GUS表達(dá)載體電擊轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌 GV3101，經(jīng)抗生素（100yg/ml利福平和50yg/ml卡那霉素）篩選獲得陽(yáng)性克隆。挑取陽(yáng)性 的單克隆置20mlLB液體培養(yǎng)基中（含100yg/ml利福平和50yg/ml卡那霉素），28°C震 蕩培養(yǎng)24小時(shí)。將菌液按1 : 100的比例稀釋，取200y1稀釋菌液涂布新鮮的含抗生素 的YEB固體平板，28°C培養(yǎng)2~3天，用150mL的轉(zhuǎn)化液（含5%蔗糖、0. 05%Silwet-77、 0. 4%乙酰丁香酮、0. 002%。6-BA的1/2MS液體培養(yǎng)基，PH5. 8)將培養(yǎng)皿中的農(nóng)桿菌洗脫下 來(lái)，配置成0D600 ~ 0. 8的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化菌液。將轉(zhuǎn)化菌液裝入塑料袋中，然后將去掉果莢 和已開(kāi)放花朵的油菜花序抓成一束，輕輕伸入塑料袋，讓轉(zhuǎn)化菌液充分浸泡花序，時(shí)間為30 秒。浸泡后的花序立即用羊皮紙袋包扎。2~3天后按上述方法重復(fù)轉(zhuǎn)化一次，同一花序共 浸泡轉(zhuǎn)化3次。在完成最后一次轉(zhuǎn)化的7天后，摘除花序上的羊皮紙袋。待種子成熟后，收 獲曬干，得到T0代轉(zhuǎn)基因種子。
[0046] 3、分枝且高產(chǎn)油菜植株的篩選
[0047] 將分枝且高產(chǎn)油菜種子播種在土壤中，在幼苗期按1 : 200(V/V)噴施潮霉素，每 隔2~3天噴施一次，連續(xù)噴4~5次。當(dāng)抗潮霉素的油菜的主枝和部分側(cè)枝現(xiàn)蕾并有幾 朵小花開(kāi)放時(shí)，用羊皮紙袋包扎，以避免雜交。種子成熟后，對(duì)其進(jìn)行單株收種，得到T1代 種子，曬干后保存于_20°C備用。對(duì)T2代幼苗繼續(xù)用潮霉素篩選，不再發(fā)生抗性分離的株系 為純合子轉(zhuǎn)基因株系。將本發(fā)明實(shí)施例得到的轉(zhuǎn)基因油菜與野生型油菜的形態(tài)對(duì)比，如圖3 所示。選取三個(gè)不同分枝且高產(chǎn)油菜株系335S: :0sDHHCl-GUS-l、35S: :0sDHHCl-GUS-2 和35S: :0sDHHCl-GUS-3,將以上三個(gè)不同