擬南芥甲酸脫氫酶fdh基因的植物表達(dá)載體及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于植物基因工程領(lǐng)域，具體涉及擬南芥甲酸脫氫酶基因/??植物表達(dá)載體在制備吸收甲醛能力增強(qiáng)的轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]甲醛(HCHO)被廣泛的用于化工合成、工業(yè)制造、醫(yī)藥合成等所涉及的化學(xué)領(lǐng)域及其他工業(yè)領(lǐng)域，尤其是在化學(xué)農(nóng)藥及其中間體合成領(lǐng)域甲醛有著舉足輕重的作用。現(xiàn)代化學(xué)農(nóng)藥的生產(chǎn)過程中不能避免的要產(chǎn)生大量含甲醛的農(nóng)藥生產(chǎn)廢水，這些農(nóng)藥生產(chǎn)廢水中普遍含有大量的甲醛以及醇、苯、酚、三聚甲醛、甲縮醛等物質(zhì)，由于廢水中甲醛的存在使得其處理變得十分困難。而且按照國家標(biāo)準(zhǔn)《污水綜合排放標(biāo)準(zhǔn)(GB8978-1996)》規(guī)定:二級(jí)排放標(biāo)準(zhǔn)的甲醛含量不得高于2mg/L，所以含甲醛的農(nóng)藥生產(chǎn)廢水要直接排放不僅不符合環(huán)保要求，并且對(duì)動(dòng)植物都具有嚴(yán)重的危害性。由于甲醛在工業(yè)生產(chǎn)中的用途很廣，完全的限制是不現(xiàn)實(shí)的，所以必須對(duì)工業(yè)生產(chǎn)中甲醛廢水進(jìn)行無害化處理。另一方面隨著生活質(zhì)量的不斷提高裝修已成為現(xiàn)代生活的一部分，而裝修所用的材料膠合板、細(xì)木工板、中密度纖維板和刨花板等含有大量HCH0，這是因?yàn)槟壳吧a(chǎn)人造板材使用的多種膠粘劑比如脲醛樹脂、三聚氰甲醛、胺基甲醛樹酯、酚醛樹脂等多以HCHO為主要成分，所以HCHO氣體成為裝修房間中空氣污染的主要化學(xué)物質(zhì)之一。
[0003]HCHO是一種廣泛存在的有毒化學(xué)物質(zhì)，它可以溶于水中以液態(tài)存在，也可以揮發(fā)成為氣體以氣態(tài)形式存在。HCHO可以被還原為甲醇也可以被氧化為甲酸，而這三種物質(zhì)對(duì)生物都具有一定的毒性。其中HCHO由于含有羰基基團(tuán)因此具有較強(qiáng)的親電特征，其具有十分活潑的化學(xué)性質(zhì)能與各種脂類、核酸和蛋白質(zhì)發(fā)生非特異性反應(yīng)，并能導(dǎo)致生物體內(nèi)各種相關(guān)物質(zhì)失去生物活性。HCHO對(duì)人和動(dòng)物具有較強(qiáng)毒性，它能導(dǎo)致皮膚敏感并能引起皮膚炎癥；HCH0也能進(jìn)入呼吸系統(tǒng)并引起該系統(tǒng)出現(xiàn)變態(tài)反應(yīng)，通過血液循環(huán)被運(yùn)輸?shù)饺硪鸱尾坎∽?、肝臟器官損傷、免疫調(diào)節(jié)能力下降等。如果我們長期使用含有HCHO的水，會(huì)引發(fā)胃部不適、免疫障礙、貧血以及引起神經(jīng)性病變，會(huì)對(duì)生物體產(chǎn)生急性或慢性的危害。如果人們暫時(shí)留在含有低劑量HCHO氣體的室內(nèi)時(shí)會(huì)使人產(chǎn)生不舒服的感覺，而長時(shí)間呼吸微量的HCHO會(huì)導(dǎo)致慢性呼吸道疾病，鼻咽癌、結(jié)腸癌、腦癌、月經(jīng)紊亂、妊娠綜合癥、新生兒染色體異常、細(xì)胞核的基因突變，DNA單鏈內(nèi)交連和DNA與蛋白質(zhì)交連、白血病、青少年記憶力和智力下降等。當(dāng)房間內(nèi)HCHO氣體濃度升高時(shí)，可刺激人眼使人流眼淚并引起咽喉不適或疼痛。而人體接觸更高濃度HCHO氣體可引起咳嗽、惡心或肺水腫等不良反應(yīng)，如果HCHO氣體濃度達(dá)到30mg/m3時(shí)可致人死亡。相對(duì)于油漆中的苯、甲苯、二甲苯、TD1、VOC等有害物質(zhì)來說，甲醛具有潛伏周期長(3-15年)、隱藏深、分布廣、易揮發(fā)、治理難、危害大等特性。
[0004]在擬南芥甲醛代謝過程中甲酸脫氫酶(/??能將甲醛代謝產(chǎn)生的甲酸氧化為C02，然后進(jìn)入卡爾文循環(huán)用于葡萄糖的合成。然而，在煙草甲醛代謝過程中來自甲醛的碳代謝流沒有進(jìn)入卡爾文循環(huán)用于葡萄糖的合成。/??在擬南芥中具有葉綠體和線粒體雙重定位，而在煙草中僅有線粒體定位。本研宄嘗試?yán)霉庹T導(dǎo)型啟動(dòng)子(PrbcS)和葉綠體信號(hào)肽(T)在野生型煙草(WT)葉片的葉綠體中過量表達(dá)擬南芥FDH,以期將甲醛的碳代謝流引入卡爾文循環(huán)用于葡萄糖的合成，增強(qiáng)/??轉(zhuǎn)基因煙草的甲醛抗性和吸收能力。利用13C-NMR分析轉(zhuǎn)基因煙草對(duì)2mM和6mM液體甲醛的代謝譜，結(jié)果表明/??在轉(zhuǎn)基因煙草葉綠體中的過量表達(dá)并沒有將甲醛的碳代謝流引入葡萄糖的合成，但增強(qiáng)了轉(zhuǎn)基因煙草葉片中甲醛代謝產(chǎn)生[4-13C]Asn、[3-13C]Gln、[U-13CjOA和H13COOH的量。進(jìn)一步的研宄表明過量表達(dá)FDH也提高轉(zhuǎn)基因煙草對(duì)液體甲醛的抗性和吸收能力。這些結(jié)果說明在轉(zhuǎn)基因煙草葉綠體中過量表達(dá)/??通過增強(qiáng)煙草對(duì)甲醛的抗性和原有甲醛代謝途徑的作用來增強(qiáng)煙草對(duì)甲醛的吸收能力。
[0005]
【發(fā)明內(nèi)容】
:
本發(fā)明的目的在于提供一種含有擬南芥甲酸脫氫酶基因(即/??基因)的植物表達(dá)載體pH2-PrbcS-T*-/?%同時(shí)提供該載體的構(gòu)建方法，以及利用該載體制備快速吸收和耐受甲醛的轉(zhuǎn)基因植物。
[0006]本發(fā)明所述載體含有擬南芥/??基因的cDNA、潮霉素篩選標(biāo)記基因(H2)、光誘導(dǎo)型表達(dá)啟動(dòng)子(PrbcS)和葉綠體信號(hào)肽(T*)，/??基因cDNA來源于擬南芥(Arabidopsisthaliana), GenBank登錄號(hào)為6625952 ;甲酸脫氫酶基因FDH的cDNA的上游為CaMV 35S的光誘導(dǎo)型表達(dá)啟動(dòng)子。
[0007]上述載體中，用于構(gòu)建所屬植物表達(dá)載體的起始載體為PH2GW7 (購自FlandersInteruniversity Institute for B1technology, VIB)。
[0008]本發(fā)明的上述目的是通過下述的技術(shù)方案得以實(shí)現(xiàn)的:
1、植物表達(dá)載體的構(gòu)建
(1)從GenBank中查找擬南芥/??基因的cDNA序列，并設(shè)計(jì)序列如下的一對(duì)引物:
上游引物 5，GCATGCATGGCGATGAGACAAGCCGCTAAGG 3，(含有 5^1 位點(diǎn))；
下游引物 5’ CTCGAGTTACCGGTACTGAGGAGCAAGTTCA 3’ (含有通ol 位點(diǎn))
上游引物5’端加GCATGC特征序列，并由此形成Sphl酶切位點(diǎn)；下游引物3’末端加Xhol酶切位點(diǎn)，以擬南芥第一鏈cDNA為模板擴(kuò)增，通過PCR擴(kuò)增得到/??基因的全長cDNA(1155bp)；
(2)回收并純化/??全長基因cDNA片段，并將其連接到PMD-19T載體上，采用堿裂解法提取質(zhì)粒DNA，通過PCR檢測和酶切檢測獲得重組質(zhì)粒pMD19-/?7;
(3)構(gòu)建入門載體pENTR-PrbcS-T*-/?^ 用 Sphl 和 ZAoI 酶切 pMD19-/^_PpENTR-PrbcS-T*-GFP，回收FDI^ cDNA片段和載體DNA片段pENTR，進(jìn)行連接、轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，得到入門載體pENTR-PrbcS-T*-/?^;
(4)構(gòu)建植物表達(dá)載體pH2-PrbcS-T*-/?%通過Gateway技術(shù)的LR反應(yīng)把/??亞克隆到植物表達(dá)載體PH2GW7中，獲得FD龜因的植物表達(dá)載體pH 2-PrbcS-T*-/m
[0009]本發(fā)明的植物表達(dá)載體對(duì)那些能實(shí)施轉(zhuǎn)基因操作的植物都適用，如煙草、擬南芥、矮牽牛、非洲菊等。在本發(fā)明的實(shí)施中以煙草為例說明該表達(dá)載體的應(yīng)用過程。
[0010]1、煙草的轉(zhuǎn)化
采用電轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化質(zhì)粒pH2-PrbcS-T*-/^%進(jìn)入農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞，涂布在Spe平板上生長兩天后，用菌落PCR檢測質(zhì)粒是否轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌中。PCR擴(kuò)增用/??的上下游引物，擴(kuò)增片段理論長度為1.2kb，PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測顯示與理論值相符，表明質(zhì)粒已轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌中。制備煙草、Nicotiana tabacum cv.Xanthi)的無菌苗，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)，用葉盤法轉(zhuǎn)化煙草，然后通過組織培養(yǎng)獲得小苗，篩選具有潮霉素(Hyg)抗性植株，將其轉(zhuǎn)移到MS培養(yǎng)基(含有3 %蔗糖)上繼續(xù)培養(yǎng)，從而獲得無菌的轉(zhuǎn)基因煙草植株。
[0011]2、/??基因插入情況的檢測
為了檢測目的基因/??是否插入有潮霉素抗性植株煙草的基因組，以抗性苗的基因組為模板，利用上下游引物做PCR檢測，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物片段理論長度為1.2kb，PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測顯示與理論值相符，說明目的基因已插入到煙草基因組中。
[0012]3、/??基因轉(zhuǎn)錄水平的檢測
為了檢測目的基因/??在轉(zhuǎn)基因煙草中是否轉(zhuǎn)錄，提取抗性苗RNA，利用/?//上下游引物進(jìn)行RT-PCR檢測，RT-PCR擴(kuò)增片段理論長度為1.2kb，RT-PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測顯示與理論值相符，說明目的基因/?//已在轉(zhuǎn)基因煙草中正常轉(zhuǎn)錄。
[0013]4、/??基因表達(dá)水平的檢測
為了檢測目的基因/??編碼的蛋白在煙草中是否表達(dá)，選取經(jīng)RT-PCR檢測正確的轉(zhuǎn)基因株系的嫩葉，提取總蛋白進(jìn)行Western分析，一抗為/??的鼠抗體。根據(jù)/??基因的核酸序列推測表達(dá)的蛋白大小約為42.1kDa, Western分析結(jié)果檢測到的蛋白質(zhì)條帶大小與理論預(yù)測值相符，說明/mm的蛋白在煙草中已成功表達(dá)。
[0014]5、轉(zhuǎn)基因煙草甲醛吸收能力檢測
根據(jù)蛋白表達(dá)水平，選擇高表達(dá)的轉(zhuǎn)基因株系進(jìn)行甲醛吸收能力檢測，分別用2mM、4mM、6mM HCHO溶液處理野生型煙草(WT)植株和轉(zhuǎn)基因煙草(FDH)植株0、6、12、18、24、30、36和48h，檢測處理液中剩余HCHO的含量；結(jié)果說明，2mM處理時(shí)，野生型煙草和轉(zhuǎn)基因煙草HCHO吸收能力較為相似，但在36h內(nèi)，轉(zhuǎn)基因煙草吸收甲醛速度顯著快于野生型，而在36-48h內(nèi)兩者基本都能將HCHO吸收完畢；4mM處理48h后，轉(zhuǎn)基因煙草已將溶液中HCHO吸收完畢，而野生型煙草所在溶液HCHO還殘留7.9% ;6mM處理48h后，轉(zhuǎn)基因煙草所在溶液中僅殘余6.75%的HCH0，但野生型煙草所在溶液中HCHO還殘余19.2% ;這些結(jié)果表明/??因在煙草中的過量表達(dá)可提高其甲醛的吸收速率。
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