一種新的新金色分枝桿菌表達體系及其在轉(zhuǎn)化植物甾醇合成add中的應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種新型新金色分枝桿菌表達體系及其在轉(zhuǎn)化植物留醇合成ADD中 的應用，屬于微生物基因工程領域。 技術背景
[0002] 留體類藥物是僅次于抗生素的一大類藥物，廣泛應用于抗腫瘤、消炎、抗菌、抗病 毒、抗真菌、抗雌激素、抗驚厥等領域。全球每年對留體類藥物的需求量超過100萬噸，總價 值超100億美元。留體藥物中間體的合成一般采用微生物轉(zhuǎn)化法。植物留醇作為合成甾體 激素類藥物中間體的原料，具有廉價易得，微生物易于降解其側(cè)鏈等特點。微生物代謝植物 甾醇的主要中間產(chǎn)物有雄甾-4-烯-3, 17-二酮（AD)、雄甾-1，4-二烯-3, 17-二酮（ADD)、 睪酮、寶丹酮、90H-AD等，其中AD和ADD市場需求量最高，因此利用廉價的底物植物甾醇高 效合成AD和ADD具有巨大的商業(yè)價值。
[0003] 3-甾酮-A L脫氫酶（KSDD，EC 1. 3. 99. 4)在甾體化合物代謝中具有重要的作用， 它催化AD脫去2個氫生成ADD，同時也可催化90H-AD合成90H-ADD，90H-ADD隨后自發(fā)打開 母核進而被進一步降解成〇) 2和H20?；蚯贸龑嶒炓呀?jīng)驗證KSDD是留醇代謝過程中關鍵 酶，敲除KSDD的編碼基因?qū)⒉荒塬@得ADD。目前，由于沒有合適的工具一表達載體，利用分 子生物學方法對分枝桿菌進行改造生產(chǎn)ADD比較困難。雖然已有對KSDD同源加強表達的 研宄，但并未給出具體的酶活數(shù)據(jù)及蛋白表達情況。
[0004] Mycobacterium neoaurum能夠降解植物留醇合成激素類藥物中間體。M. neoaurum JC-12是本研宄室從土壤中篩選到的菌株，具有降解植物留醇合成AD和ADD的能力。實驗 室前期克隆表達出M. neoaurumJC-12的ksdd基因，并對KSDD的轉(zhuǎn)化能力進行了研宄。在 分支桿菌中加強表達KSDD是促進ADD高效生產(chǎn)的一個重要途徑，然而，分枝桿菌表達系統(tǒng) 還不完善，缺乏高效表達載體，這已成為目前分枝桿菌降解植物留醇合成藥物中間體研宄 中的瓶頸。tac啟動子是trp啟動子和lacUV5的拼接雜合啟動子，在大腸桿菌中具有很高 的轉(zhuǎn)錄水平，用于鈍齒棒桿菌、黃色短桿菌和谷氨酸棒桿菌等陽性菌表達基因也有較高的 表達效率。啟動子的結構分析表明啟動子包含一個保守的-10區(qū)tgngnta(c/t)aatgg和一 個保守性相對較差的-35區(qū)，而且在陽性桿菌中啟動子-10區(qū)對啟動子和RNA聚合酶的互 相作用起主要作用，因此本發(fā)明設計對tac啟動子的-10區(qū)序列進行優(yōu)化。
[0005] 所以，本研宄構建了具有tac啟動子的分枝桿菌表達載體，并通過表達綠色熒光 蛋白GFP驗證其在M. neoaurum JC-12中的高效表達，為后續(xù)在分枝桿菌中高效表達KSDD 奠定基礎。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于提供：通過啟動子替換和啟動子-10區(qū)序列的優(yōu)化構建得到一 種新型分枝桿菌表達載體，通過在新金色分枝桿菌過量表達3-留酮-△ ^脫氫酶，高效降 解植物留醇合成藥物中間體雄留-1，4-二烯-3, 17-二酮。
[0007] 本發(fā)明的技術方案：利用基因工程手段將載體pMF41的啟動子pACE替換成tac啟 動子構建載體pMTac。通過GFP亮度驗證載體pMTac的在新金色分枝桿菌中的表達效果。 對載體pMTac的tac啟動子的-10區(qū)序列進行優(yōu)化得到相應的六個新載體，并且通過過量 表達KSDD比較這幾個載體在新金色分枝桿菌中的作用。利用新載體過量表達KSDD重組分 枝桿菌的KSDD酶活測定及發(fā)酵產(chǎn)物產(chǎn)量也進一步驗證了其表達效果。本發(fā)明成功構建了 一種金色分枝桿菌表達載體，并構建了一株加強表達3-留酮-A L脫氫酶高效降解植物甾 醇合成藥物中間體ADD的分枝桿菌工程菌株，其3-留酮-△ L脫氫酶活力及ADD產(chǎn)量較原 始菌有$父大的提尚。
[0008] 主要試劑：植物留醇（大豆留醇彡95%)購自禮來生物技術（湖州）有限公司； 雄甾-4-烯-3, 17-二酮及雄甾-1，4-二烯-3, 17-二酮標準樣品購于Sigma公司。
[0009] 1.表達載體pMTac的構建及功能驗證方法：
[0010] (1)表達載體pMTac的構建
[0011] 根據(jù)tac啟動子的序列設計引物tac-F和tac-R，以pETac載體為模板，通過PCR 擴增出tac啟動子的序列。
[0012] PCR 反應體系：10XExTaq Buffer 5yL，dNTP 4yL，模板 DNA 1 yL，上下游引物 各0. 5 y L，ExTaq酶1 y L，ddH20補齊至總體積50 y L。PCR反應條件：95°C變性3min ;95°C 變性3〇8,60°0復性3〇8,72°0延伸3〇8,30個循環(huán)；721：保溫5111111。
[0013] PCR產(chǎn)物和質(zhì)粒pMF41進行Xba I和BamH I雙酶切，T4DNA連接酶與16°C連接 純化后的產(chǎn)物，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109,陽性轉(zhuǎn)化子經(jīng)酶切電泳驗證。新載體命名為 pMTac。（2)綠色熒光蛋白表達菌株的構建
[0014] 根據(jù)GenBank中登記的綠色焚光蛋白基因gfp設計引物gfp-Fl、gfp-R和gfp-F2， 以PCAMBIA1302為模板，分別以gfp-Fl和gfp-R，gfp-F2和gfp-R為上下游引物，PCR擴增 片段經(jīng)雙酶切后分別連接到同樣經(jīng)雙酶切的PMF41和pMTac上，得重組載體pMF41-gfp和 pMTac-gfp。采用電擊轉(zhuǎn)化法將空載體及重組載體電轉(zhuǎn)到M. neoaurum JC-12中，用終濃度 為30 y g/mL的固體培養(yǎng)篩選陽性轉(zhuǎn)化子，并提質(zhì)粒酶切驗證。
[0015] (3)重組菌的GFP熒光檢測
[0016] 重組菌M. neoaurum JC-12/pMF41-gfp培養(yǎng)至0D6QQ為0?8左右時，加入終濃度為 0.02%乙酰胺誘導，繼續(xù)培養(yǎng)24h。重組菌M.neoaurumJC-12/pMTac-gfp不需誘導。取重 組菌發(fā)酵液，離心收集細胞，50mM Tris-HCl (pH 7. 0)緩沖液洗滌3次，重懸，稀釋至適當 濃度取少許于載玻片上，蓋上蓋玻片，在Nikon ECLIPSE 50熒光顯微鏡下觀察。以原始菌 M. neoaurumJC-12 作為對照。
[0017] 2. 3-留酮-AL脫氫酶加強表達菌株的構建方法：
[0018] (1) 3-甾酉同-AL脫氫酶序列的克隆
[0019] 根據(jù)分枝桿菌JC-12的3-留酮-A1-脫氫酶編碼基因ksdd設計引物ksdd-Fl、 ksdd-F2和ksdd-R，以分枝桿菌JC-12基因組DNA為模板，進行PCR獲得ksdd片段。PCR反 應條件：95°C變性3min ;95°C變性30s，65°C復性90s，72°C延伸3〇8,30個循環(huán)；72°0保溫 5min。（2)重組質(zhì)粒 pMF41_ksdd 和 pMTac-ksdd 的構建
[0020] 上述所得ksdd片段經(jīng)BamH I和EcoR I雙酶切，分別連接到同樣雙酶切pMF41 和pMTac上，得重組載體pMF41_ksdd和pMTac-ksdd。采用電擊轉(zhuǎn)化法將重組載體電轉(zhuǎn)到 M. neoaurumJC-12中，用終濃度為30 y g/mL的固體培養(yǎng)篩選陽性轉(zhuǎn)化子，并提質(zhì)粒酶切驗 證。
[0021] (3)3-甾酮-A L脫氫酶的表達及酶活測定
[0022] 重組菌pMF41-ksdd培養(yǎng)至0D6QQ為0. 8左右時，加入終濃度為0. 02%乙酰胺誘 導，繼續(xù)培養(yǎng)24h。重組菌pMTac-ksdd不需誘導。取重組菌發(fā)酵液，離心收集細胞，50mM Tris-HCl (pH 7. 0)緩沖液洗滌3次，重懸，超聲波碎細胞，破碎液8000r/min離心30min后 得破碎細胞上清液。12% SDS-PAGE分析蛋白表達情況。
[0023] 采用PMS-DCPIP法測定KSDD酶活。KSDD脫去底物AD的兩個氫生成ADD，蛋白自身 的FAD接受脫去的2H+和2e _成FADH 2，然后FADH^f DCPIP還原，DCPIP在600nm處有吸收 峰。3mL 反應混合物由 100 y L粗酶液、50mmol/L 的 Tris-HCl (pH 7. 0)、40 y mol/L 的 DCPIP、 1. 5mmol/L的PMS、500 y mol/L AD (溶于2%的甲醇）所組成，檢測600nm處的吸光值變化。 酶活單位定義：將在1分鐘內(nèi)還原1 U mol DCPIP所需的酶量定義為一個酶活單位（U)。
[0024] 3. pMTac啟動子序列的優(yōu)化
[0025] (1)幾種啟動子的-10區(qū)序列
[0026] 選擇六種不同來源的啟動子，通過啟動子在線分析（http://www. fruitfly. org) 得到-10區(qū)序列。以這六個啟動子的-10區(qū)序列替換tac啟動子的-10區(qū)序列設計出六個 啟動子分別為tac-1、tac-2、tac-3、tac-4、tac-5以及tac-6,他們與tac啟動子的區(qū)別僅 在于-10 區(qū)序列。啟動子 tac、tac_l、tac_2、tac_3、tac_4、tac_5 以及 tac_6 的-10 區(qū)序 列及來源如表1。
[0027] 表1幾種啟動子的-10區(qū)序列及來源
[0028] Table lThe-lOregion sequence and resource of promoters
[0029]
【主權項】
1. 一種分枝桿菌表達載體pMTac，其特征是：利用基因工程技術將PMF41的PACE啟動 子替換成tac啟動子，構建得分枝桿菌表達載體pMTac，其核酸序列如SEQ ID NO: 1所示。
2. -種分枝桿菌表達載體pMTac-2,其特征是：對權利要求1中載體pMTac的tac 啟動子的-10區(qū)序列gctcgtataatgt替換為aaagttctaatct，利用基因工程技術構建得 pMTac-2,其核酸序列如SEQ ID N0:2所示。 3. 3-甾酮-Λ L脫氫酶加強表達的重組分枝桿菌，其特征是：通過PCR技術獲得3-甾 酮-Λ L脫氫酶編碼基因 ksdd，并分別連接到權利要求1中構建的載體pMTac和權利要求 2中構建的載體pMTac-2上，獲得重組載體pMTac-ksdd和pMTac-2-ksdd ;將重組載體分別 電轉(zhuǎn)化至M. neoaurum JC-12中，獲得KSDD加強表達的重組分枝桿菌M. neoaurum JC-12/ pMTac-ksdd 和 M. neoaurum JC-12/pMTac-2_ksdd〇
4. 利用權利要求3中構建的重組分枝桿菌發(fā)酵植物留醇合成AD和ADD，其特征是：菌 株活化48h左右后以接種到含30g/L植物甾醇的發(fā)酵罐中，10 %接種量，30°C，400r/min， Ivvm通氣量，pH為維持在7. 0-7. 5 ;發(fā)酵72h開始流加葡萄糖，維持葡萄糖濃度在4-5g/L。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種新金色分枝桿菌表達載體及其構建方法和應用，屬于基因工程技術領域。本發(fā)明的新金色分枝桿菌表達載體pMTac-2，可用于在新金色分枝桿菌高效表達蛋白，適用于分枝桿菌代謝產(chǎn)物的研究和生產(chǎn)。利用pMTac-2在新金色分枝桿菌中過量表達KSDD，使重組菌M.neoaurum JC-12/pMTac-2-ksdd胞內(nèi)的KSDD活性比原始菌提高15.12倍。以30g/L植物甾醇為底物，5L發(fā)酵罐中重組菌M.neoaurum JC-12/pMTac-2-ksdd的ADD產(chǎn)量達到15g/L以上，為目前報道的發(fā)酵法利用新金色分枝桿菌降解植物甾醇合成ADD的最高水平。因此，該表達體系能夠有效利用于新金色分枝桿菌的遺傳改造。
【IPC分類】C12N1-21, C12N15-53, C12R1-32, C12P33-02, C12N15-74, C12P33-16
【公開號】CN104830888
【申請?zhí)枴緾N201510143997
【發(fā)明人】饒志明, 許正宏, 張樂樂, 張顯, 徐美娟, 楊套偉
【申請人】江南大學
【公開日】2015年8月12日
【申請日】2015年3月30日