專利名稱：用于具有改善的保護功效的疫苗的分枝桿菌屬突變體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及疫苗領(lǐng)域，最尤其是基于活減毒分枝桿菌屬(Mycobacterium)的疫苗。本文中所公開的是基因，當(dāng)在用于免疫動物，尤其是哺乳動物的分枝桿菌中突變時，其作為針對分枝桿菌屬感染的疫苗賦予改善的保護功效，同時不干擾諸如牛分枝桿菌(Mycobacterium bovis) BCG的已知接種菌株的有益特性。這類疫苗對結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)感染尤其適宜。
背景技術(shù)：
三分之一的世界人口受TB病原體結(jié)核分枝桿菌(M.tb)感染。世界衛(wèi)生組織估計，全世界每年發(fā)生約八百萬至一千萬新的TB病例，TB發(fā)病率目前正不斷增加。連同瘧疾和HIV-AIDS，TB是死于單一感染因子的前三個原因之一，每年約有兩百萬例死亡可歸因于TB (WHO Report, 2008)。目前唯一獲批的疫苗是牛分枝桿菌的減毒株牛分枝桿菌卡介苗 (牛分枝桿菌BCG)，從首次使用它的1921年起，至今已對超過四十億人施用。在出生時施用時，牛分枝桿菌BCG在10歲以前針對播散性疾病賦予一致而可靠的保護(Rodrigues等，1993)。但是,在青少年和成人中針對肺病賦予的保護更可變(Colditz等，1994)。目前研發(fā)改善的預(yù)防性TB疫苗的主要途徑是以牛分枝桿菌BCG作為初始疫苗(priming vaccine),用修飾的牛分枝桿菌BCG或結(jié)核分枝桿菌來改善，然后可能在隨后某時間用選擇的免疫顯性抗原作為蛋白質(zhì)或病毒載體疫苗來強化(Barker等，2009 ；STOP-TBPartnership, 2009)。在結(jié)核的情況下，塵細胞成功吞噬結(jié)核分枝桿菌，是感染的主要部位。但是，分枝桿菌干擾吞噬體(phagosomal)成熟，從而使分枝桿菌能夠部分逃逸否則可以清除它們的許多免疫機制(50)。結(jié)核分枝桿菌胞內(nèi)生長和存活必需的細菌基因和途徑是有吸引力的藥物靶點，已提出了這類細菌毒力機制中的幾種(13，14)。但是，疑似涉及結(jié)核分枝桿菌-宿主相互作用的細菌成分的功能驗證需要產(chǎn)生突變體。結(jié)核分枝桿菌的緩慢生長和低同源重組效率(39)及在昂貴的高生物安全性實驗室中工作的需要阻礙了這些關(guān)鍵實驗。這些特征的組合使突變體產(chǎn)生成為非常漫長、麻煩和昂貴的過程。因此，許多研究人員借助不致病的生長快速的分枝桿菌物種來產(chǎn)生突變體，得到并非必然外推至它們生長緩慢的親戚的結(jié)果(24)。就結(jié)核分枝桿菌-宿主相互作用的許多方面而言,減毒疫苗株牛分枝桿菌BCG是更可靠，也更安全的模式生物(8，17)。它也生長緩慢，且基因組與結(jié)核分枝桿菌極其相似(> 99%)，只是缺乏少數(shù)基因組區(qū)域，其中RDl基因座主要導(dǎo)致其減毒作用(2，33)。各BCG菌株具有多個缺失，其中只有RDl基因座是所有菌株共有的缺失。應(yīng)指出，分枝桿菌不尋常的細胞壁是使分枝桿菌能夠成功定居它們的宿主的因素之一。細胞壁由與巨噬細胞相互作用的脂質(zhì)、糖脂和蛋白質(zhì)的復(fù)合體組成(5)。這種胞外被膜的一種成分是脂阿拉伯甘露聚糖(LAM)，其連同它的前體脂甘露聚糖(LM)和磷脂酰肌醇甘露糖苷(PM) —起非共價錨著至質(zhì)膜。LAM包含甘露糖基磷脂酰肌醇錨(MPI)、甘露聚糖核心和長的取代阿拉伯聚糖(arabinan)分枝。甘露聚糖主鏈由具有單殘基a-l，2_Manp取代的a _1，6連接的甘露糖單元組成。阿拉伯聚糖聚合物由a-I，5連接的Araf單元組成，且被分枝六聚阿拉伯呋喃糖苷和線性四聚阿拉伯呋喃糖苷取代。這些阿拉伯聚糖側(cè)鏈的非還原端以帽基序終止。在生長緩慢的致病菌株中，這些基序由I個、2個或3個a-1，2連接的Manp殘基組成，二甘露糖苷豐度最高。相反，在不致病的菌株中，通常存在肌醇磷酸帽(恥垢分枝桿菌(M. smegmatis)中的PILAM)或完全無帽(龜分枝桿菌(M. chelonae)中的AraLAM) (7)。已報道了 ManLAM(甘露糖基化脂阿拉伯甘露聚糖)在破壞宿主細胞信號傳導(dǎo)途徑(18)和阻斷宿主巨噬細胞中的吞噬體成熟(15)中發(fā)揮作用。LAM由磷脂酰肌醇酯(PI)構(gòu)成，PI的合成需要二?；视图っ窶b2276的活性(45)。PI 經(jīng)歷由 PimA(Mb2642c)、PimB(Mb0572)、PimC(Mbl785c)和 PimF(Mbl538)催化的一系列連續(xù)的a-甘露糖基化(25，26，38，57)。從PI合成ManLAM中的所有甘露糖基化的糖基供體底物是多萜醇磷酸甘露糖，該多萜醇磷酸甘露糖是通過多萜醇磷酸甘露糖合酶ppml (Mb2077c)從GDP甘露糖合成的(19)。此過程中的⑶P甘露糖合成涉及磷酸甘露糖變位酶pmmB(Mb3336) (55)。通過加入21-34個殘基的線性a-1，6-甘露糖聚合物來在PM4前體上合成LM。此修飾需要甘露糖基轉(zhuǎn)移酶(mannosyltransferase)Mb2196 (23)。之前的研究顯示，Rv2181(Mb2203)是負責(zé)將單個a _1，2_Manp殘基加至LM/LAM的甘露聚糖核心的甘露糖基轉(zhuǎn)移酶(20)。在后一研究中，在恥垢分枝桿菌中失活對應(yīng)的同源物導(dǎo)致截短LAM 的產(chǎn)生和LM的缺乏。但是，更近的數(shù)據(jù)顯示，結(jié)核分枝桿菌中類似的失活導(dǎo)致產(chǎn)生更低分子量LAM，但不影響LM的合成，揭示了此甘露糖基轉(zhuǎn)移酶在LAM的末端帽化中的作用(24)。LAM通過聚a-l，5_araf鏈的加入衍生自LM,該鏈的合成需要embC(4,65)。絲氨酸蘇氨酸激酶PknH通過磷酸化轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)物EmbR來調(diào)節(jié)embC的轉(zhuǎn)錄(59)。線性阿拉伯聚糖分枝進一步被六聚和四聚阿拉伯呋喃糖苷結(jié)構(gòu)取代。LAM的這些非還原阿拉伯聚糖末端在結(jié)核分枝桿菌和牛分枝桿菌BCG中帽化至不同的程度，具有I至3個(a-l，2)-Manp殘基。涉及此a -I，2-甘露糖帽化的第一個甘露糖基轉(zhuǎn)移酶由Rvl635c及其在牛分枝桿菌BCG中的同源物Mbl661c編碼(11)。雖然基因Mbl661c可能負責(zé)加入帽的第一個甘露糖殘基,但認為甘露糖基轉(zhuǎn)移酶Mb2203加入另外一個或兩個甘露糖殘基來產(chǎn)生二 -Manp和三-Manp帽化的LAM(24)。影響結(jié)核分枝桿菌毒力的其他因子包含脂蛋白信號肽酶LspA(Mbl566) (53)、脂質(zhì)磷酸酶 SapM(Mb3338) (42)和 Zn 金屬蛋白酶 Zmpl (Mb0204c) (35)。結(jié)核疫苗領(lǐng)域的大多數(shù)工作受這樣的理念指導(dǎo)BCG“缺失結(jié)核分枝桿菌的某物”，必須將其加回BCG來改善疫苗誘導(dǎo)的保護，或者相反，應(yīng)將結(jié)核分枝桿菌減毒至BCG的低毒力，同時保留其免疫顯性抗原。前者的實例是過量表達免疫顯性結(jié)核分枝桿菌抗原的重組 BCG 菌株(Castanon-Arreola 等，2005 ；Horwitz&Harth, 2003 ;Pym 等，2003),后者的實例是結(jié)核分枝桿菌的毒力因子突變體(Copenhaver等,2004)、營養(yǎng)突變體(Sambandamurthy等,2005 ;Sambandamurthy等,2002)或信號轉(zhuǎn)導(dǎo)突變體(Martin等,2006)。此外，尋求巨曬細胞中吞曬體成熟和凋亡的改善誘導(dǎo)(Grode等,2005 ;Hinchey等,2007 ；Sadagopal等，2009 ；Sun等，2009 ；VeImurugan等，2007)來增加交叉呈遞和隨之提高疫苗效力。但是，與BCG疫苗直接比較，所有的改造活疫苗中只有5種已在實驗動物中顯示足夠有希望，可進入I期臨床試驗(ST0P-TBPartnership，2009):過量表達抗原85b的BCG (rBCG30，豚鼠中延長的存活)(Horwitz&Harth, 2003);缺乏脲酶C的分泌利斯特菌溶胞素的重組BCG (Grode等，2005 ;Tchilian等，2009) (AureC hly+rBCG，小鼠肺中減少的CFU計數(shù))；缺乏脲酶C的分泌產(chǎn)氣莢膜梭菌細胞溶素(perfringiolysin)的重組BCG (Sun等，2009)(在SCID小鼠研究中比BCG安全)；結(jié)核分枝桿菌的phoP突變體(Martin等,2006 ;Verreck等,2009)(高劑量攻擊下豚鼠中延長的存活，同時針對低劑量攻擊的等同保護，在小鼠中等同的保護；獼猴肺中減少的CFU計數(shù))；結(jié)核分枝桿菌的secA2突變體(Hinchey等,2007 ;Sadagopal等，2009)(小鼠中延長的存活)。由于牛分枝桿菌BCG是活疫苗，對與TB保護相關(guān)的大規(guī)模執(zhí)行的轉(zhuǎn)基因菌株存在法規(guī)和安全性擔(dān)憂(例如轉(zhuǎn)基因穩(wěn)定性；轉(zhuǎn)基因在疫苗和結(jié)核分枝桿菌本身間的水平基因轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(Krzywinska等，2004);世界范圍內(nèi)不同的謹慎環(huán)境釋放GMO法規(guī))(Kamath等，2005 ；ffalker等，2010)。以減毒結(jié)核分枝桿菌作為疫苗也存在潛在的安全性問題，必須特別謹慎(如雙突變，每個單突變導(dǎo)致充分減毒)(Kamath等，2005 ；Walker等，2010)。如果可以找到比獲批的BCG菌株本身具有更好的保護能力的牛分枝桿菌BCG菌株，其中通過靶向失活內(nèi)源基因而不是通過表達異源轉(zhuǎn)基因來產(chǎn)生改善的保護，則可以減少這些擔(dān)憂，臨床執(zhí)行和公眾接受也可以更容易。發(fā)明概述據(jù)推測，報道為涉及吞噬體成熟抑制的分枝桿菌成分的突變可以產(chǎn)生更好的疫苗，因為這類突變應(yīng)導(dǎo)致更好的疫苗抗原加工和展示。為此，產(chǎn)生了有序牛分枝桿菌BCG 轉(zhuǎn)座子插入突變體文庫，并鑒定了 15個基因中的突變體，其中包含細胞壁ManLAM的a-1，2-寡聚甘露糖基帽化必需的2個基因(Fratti等，2003 ；Hmama等，2004 ；Kang等，2005)和P13P磷酸酶基因SapM[21]。直到最近都認為a-1，2-寡聚甘露糖基結(jié)構(gòu)帽化LAM主要由Rvl635c (Mb166Ic)編碼的a -I, 2_甘露糖基轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)(Dinadayala等,2006)。但是,Kaur和同事及我們實驗室中最近的發(fā)現(xiàn)表明，另一甘露糖基轉(zhuǎn)移酶(Rv2181或Mb2203)實際上更有選擇性地影響a-1，2-寡聚甘露糖基帽結(jié)構(gòu)合成，使細胞壁中的LAM水平完整(Kaur等，2006 ;Kaur等，2008)。因此，此突變體比Mbl661c突變體更適合用于確定a-1,2-寡聚甘露糖基帽化的具體作用(Appelmelk等，2008)，Mbl661c突變體可以具有補償LAM缺乏的改變的細胞壁組成。已報道了 ManLAM(甘露糖基化脂阿拉伯甘露聚糖)在破壞宿主細胞信號傳導(dǎo)途徑(18)和阻斷宿主巨噬細胞中的吞噬體成熟(15)中發(fā)揮作用，諸如牛分枝桿菌BCG的生長緩慢的分枝桿菌中的ManLAM合成突變體是有利的。ManLAM帽化和SapM 二者在吞噬體成熟抑制中都被指定了重要功能，但這已通過突變體研究就ManLAM帽化產(chǎn)生了爭論[22]，且尚未通過SapM的突變體研究進行驗證。此夕卜，現(xiàn)已首次在生物化學(xué)上表征了迄今未在生長緩慢的分枝桿菌中研究過的所提出的LM0-1，6-甘露糖基轉(zhuǎn)移酶肺2196。在嚴格模型中作為TB疫苗評價了牛分枝桿菌BCG的這些轉(zhuǎn)座子插入突變體，可以顯示，它們?nèi)剂钊梭@奇地具有改善的疫苗功效，SapM: :T突變體接種者顯示最長的存活。突變體BCG菌株在體外顯示未改變的巨噬細胞和樹突細胞攝入及在巨噬細胞中的溶酶體共定位。此外，它們在小鼠中的復(fù)制和肉芽腫形成與牛分枝桿菌BCG野生型相當(dāng)，表明這些疫苗與BCG等同的安全性。接種SapM基因座突變體顯著增加了⑶llC+CD40+MHC-IIWmed⑶8 a —DC向引流淋巴結(jié)的募集和它們的激活，解釋了改善的免疫應(yīng)答。引起突變體改善的疫苗功效的機制的進一步探查顯示，與野生型BCG相比，突變體在感染巨噬細胞后誘導(dǎo)相似的氧化劑活性和自噬。因此，根據(jù)第一方面，提供分枝桿菌，其在選自SapM、對應(yīng)于牛分枝桿菌中Mbl661c的內(nèi)源ManLAM a-1，2-甘露糖基轉(zhuǎn)移酶、對應(yīng)于牛分枝桿菌中Mb2203的內(nèi)源ManLAM a-I，2_甘露糖基轉(zhuǎn)移酶和對應(yīng)于牛分枝桿菌中Mb2196的內(nèi)源LM a-I，6_甘露糖基轉(zhuǎn)移酶的至少一個內(nèi)源基因中包含基因工程突變。這些ManLAM a-1，2_甘露糖基轉(zhuǎn)移酶還分別等同于結(jié)核分枝桿菌H37Rv菌株中的Rvl635c和Rv2181。根據(jù)具體實施方案，該基因工程突變(即通過遺傳工程方法獲得的突變)是非天然存在的突變。根據(jù)具體實施方案，突變所述基因的組合和/或內(nèi)源基因包含一個以上突變。根據(jù)具體實施方案，該基因工程突變編碼具有減少的功能性(敲減)或缺乏功能性(敲除)的基因產(chǎn)物。這可以是因為不存在基因產(chǎn)物或存在比對應(yīng)的野生型菌株中少的基因產(chǎn)物，和/或因為基因產(chǎn)物無功能或僅具有部分功能。根據(jù)具體實施方案，通過插入誘變來產(chǎn)生該基因工程突變。根據(jù)具體實施方案，該分枝桿菌還可以具有其他突變。根據(jù)甚至更具體的實施方案，該分枝桿菌還包含至少一個降低毒力的突變。根據(jù)備選但不排他的實施方案，該分枝桿菌還在內(nèi)源抗氧化劑基因中包含至少一個突變。根據(jù)其他實施方案，該內(nèi)源抗氧化劑基因選自 secA2、sigH 和 SodA (Sadagopal 等，2009)。根據(jù)具體實施方案，內(nèi)源SapM基因、對應(yīng)于Mbl661c基因的ManLAM a_l，2_甘露糖基轉(zhuǎn)移酶、對應(yīng)于Mb2203基因的ManLAM a -1,2-甘露糖基轉(zhuǎn)移酶和對應(yīng)于Mb2196基因 的LM a-I，6-甘露糖基轉(zhuǎn)移酶分別包含SEQ ID NO :1、3、5或7，其連續(xù)部分，或與之至少至少95%、至少98%或至少99%同一的序列；或分別包含編碼SEQ ID NO :2、4、6或8，其連續(xù)部分的序列，或與之至少95%、至少98%或至少99%同一的編碼序列。根據(jù)具體實施方案，本文中所述的分枝桿菌選自結(jié)核分枝桿菌、牛分枝桿菌或牛分枝桿菌卡介苗(BCG)。根據(jù)非常具體的實施方案，該分枝桿菌選自保藏菌株LMG P-25310.LMG P-25309、LMG P-25308 和 LMG P-25441。在另一方面，提供本文中所述的分枝桿菌或其部分在制備重組疫苗，尤其是針對結(jié)核的疫苗中的用途。根據(jù)具體實施方案，該疫苗是基于牛分枝桿菌、牛分枝桿菌卡介苗(BCG)或結(jié)核分枝桿菌的疫苗。根據(jù)備選(但不排他)的具體實施方案，該疫苗包含活減毒疫苗。因此，還提供制備疫苗(或疫苗組合物)的方法，其包括例如通過在可藥用載體中提供活減毒分枝桿菌菌株來產(chǎn)生疫苗的步驟。還根據(jù)另一方面，提供疫苗，其在可藥用載體或賦形劑中包含本文中所述的分枝桿菌，因此在選自SapM、對應(yīng)于牛分枝桿菌中Mbl661c的內(nèi)源ManLAM a-1,2-甘露糖基轉(zhuǎn)移酶、對應(yīng)于牛分枝桿菌中Mb2203的內(nèi)源ManLAM a -1,2-甘露糖基轉(zhuǎn)移酶和對應(yīng)于牛分枝桿菌中Mb2196的內(nèi)源LM a-1，6-甘露糖基轉(zhuǎn)移酶的至少一個內(nèi)源基因中具有基因工程突變。根據(jù)備選實施方案，該疫苗包含所述分枝桿菌的部分。該疫苗可以用于治療幾種疾病，因為已知基于重組分枝桿菌的疫苗是優(yōu)良的載體疫苗(Bastos等，2009，尤其是其中的表格)。根據(jù)最具體的實施方案，該疫苗是針對結(jié)核的疫苗。換言之，該疫苗適合用于保護動物，最尤其是哺乳動物免受選自牛分枝桿菌或結(jié)核分枝桿菌的毒性分枝桿菌攻擊。哺乳動物可以例如選自人類(尤其是人類兒童)或牛，尤其是母牛。根據(jù)具體實施方案，該疫苗是活減毒疫苗。因此，根據(jù)具體方面，提供本文中所述的分枝桿菌用于治療結(jié)核。根據(jù)其他實施方案，提供本文中所述的疫苗用于治療結(jié)核。因此，提供保護哺乳動物免受毒性分枝桿菌屬感染，尤其是免受結(jié)核分枝桿菌或牛分枝桿菌感染的方法，其包括用本文中所述的疫苗(或者可能用本文中所述的活減毒分枝桿菌)處理哺乳動物。備選地，提供在哺乳動物中誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的方法，該方法包括用本文中所述的分枝桿菌或本文中所述的疫苗接種該哺乳動物。附圖
簡述圖I.有序轉(zhuǎn)座子插入突變體文庫的產(chǎn)生和所選擇的4個突變體的示意圖A.用供體噬菌粒OMycomarH產(chǎn)生了轉(zhuǎn)座子插入突變體文庫。此噬菌粒包含編碼卡那霉素抗性基因的轉(zhuǎn)座子、如此取向以促進轉(zhuǎn)錄進入鄰近染色體DNA中的17啟動子和末端29bp反向重復(fù)。此構(gòu)建體理論上在每個“TA”后整合入分枝桿菌基因組中。B.在96孔板中培養(yǎng)個體突變體至中對數(shù)期(21天)，將來自96孔板各行的整分試樣混合入二級庫平板的單孔中。將來自二級PCR庫平板的列中各孔的整分試樣混合入三級PCR庫平板的單孔中。將這些庫凍存于_20°C，并用于分離基因組DNA進行PCR篩選。C.我們用雜交至轉(zhuǎn)座子任一端的反向重復(fù)的引物(Himar引物)和靶基因ORF上游或下游(有時在其中)的基 因特異性引物針對有序文庫中的具體突變體進行了 PCR篩選。D.此圖中按其作用部位顯示了本文在生物化學(xué)上表征的三種甘露糖基轉(zhuǎn)移酶和脂質(zhì)磷酸酶。問號表示基因在所示生物合成步驟中的功能目前尚不清楚(Mbl661c在甘露聚糖主鏈上加入單個a-1，2-甘露糖殘基中的功能)或尚未在結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群(M.tb complex)的菌株中確認?；疑畛涞膱A表示單個a-1，2連接的甘露糖殘基。圖2.突變體的Southern印跡分析、缺損基因(disrupted gene)的定量PCR相對表達分析和磷酸酶測定A.用BamHl和Pstl消化所有突變體的基因組DNA (數(shù)據(jù)未顯示)，并用32P dCTP標(biāo)記的轉(zhuǎn)座子探測。條帶的數(shù)目對應(yīng)于轉(zhuǎn)座子在突變體中的插入的數(shù)目。除三個突變體(即Mb2203(i)、Mbl547(i)和Mb2196(i)中的突變體)外，所有其他突變體都顯示轉(zhuǎn)座子的單整合。所使用的標(biāo)記是通過用IU PstI酶(Fermentas,加拿大)37°C消化I ii g入DNA 2小時自制的入Pstl標(biāo)記。B.野生型(WT)和Mbl661c、Mb2203、SapM、Mb2196(M)基因的突變體中Mbl661c、Mb2203、SapM(Mb3338)和Mb2196轉(zhuǎn)錄物的定量。通過用提取自野生型和突變體的對數(shù)期培養(yǎng)物的RNA制備的cDNA上的實時PCR來測量轉(zhuǎn)錄物水平。下表中給出了引物組。針對編碼16S rRNA的持家基因的表達水平歸一化所有值。將野生型與突變體的轉(zhuǎn)錄物比值隨意設(shè)為I。數(shù)據(jù)代表平均值土SD(n = 3)。在用各轉(zhuǎn)錄物的第二引物組進行的獨立的定量PCR中獲得了相似的結(jié)果(數(shù)據(jù)未顯示)。C.通過在A415測量pNPP的水解來測定牛分枝桿菌BCG野生型(黑條)對牛分枝桿菌BCG SapM突變體(灰條)的培養(yǎng)物上清中的磷酸酶活性。用培養(yǎng)基作為對照(白條)。
引物名稱引物序列
~1661c FP5, GACGTGGGCCGGAATCGAAGCA 3'~(SEQ ID NO 9)
~1661c RP5' GATCCACCCGACCTGCCAAACCTG 3'~(SEQ ID NO 10)
權(quán)利要求
1.分枝桿菌，其在選自SapM、對應(yīng)于牛分枝桿菌中Mbl661c的內(nèi)源ManLAMa-l，2_甘露糖基轉(zhuǎn)移酶、對應(yīng)于牛分枝桿菌中Mb2203的內(nèi)源ManLAM a -1,2-甘露糖基轉(zhuǎn)移酶和對應(yīng)于牛分枝桿菌中Mb2196的內(nèi)源LM a-1，6_甘露糖基轉(zhuǎn)移酶的至少ー個內(nèi)源基因中包含基因工程突變。
2.權(quán)利要求I的分枝桿菌，其中所述內(nèi)源SapM基因、對應(yīng)于Mbl661c基因的ManLAMa -1，2_甘露糖基轉(zhuǎn)移酶、對應(yīng)于Mb2203基因的ManLAM a -I，2_甘露糖基轉(zhuǎn)移酶或?qū)?yīng)于Mb2196基因的內(nèi)源LM a-I，6-甘露糖基轉(zhuǎn)移酶分別包含SEQ ID NO :1、3、5或7，其連續(xù)部分，或與之至少95%、至少98%或至少99%同一的序列；或者分別包含編碼NO :2、4、6或8，其連續(xù)部分，或與之至少95%、至少98%或至少99%同一的序列的序列。
3.權(quán)利要求I或2的分枝桿菌，其是結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的成員。
4.權(quán)利要求I至3中任一項的分枝桿菌，其是結(jié)核分枝桿菌、牛分枝桿菌或牛分枝桿菌卡介苗(BCG)。
5.權(quán)利要求I至4中任一項的分枝桿菌，其中通過插入誘變來產(chǎn)生所述基因工程突變。
6.權(quán)利要求I至5中任一項的分枝桿菌，其選自保藏菌株LMGP-25310、LMG P-25309、LMG P-25308 和 LMG P-25441。
7.權(quán)利要求I至6中任一項的分枝桿菌,其進ー步在選自secA2、sigH和SodA的至少一個內(nèi)源基因中包含基因工程突變。
8.權(quán)利要求I至7中任一項的分枝桿菌或其部分的用途，用于制備重組疫苗。
9.權(quán)利要求8的用途，其中所述疫苗是針對結(jié)核的疫苗。
10.權(quán)利要求8或9的用途，其中所述疫苗是基于牛分枝桿菌、牛分枝桿菌卡介苗(BCG)或結(jié)核分枝桿菌的疫苗。
11.權(quán)利要求8至10中任ー項的用途，其中所述疫苗包含活減毒疫苗。
12.疫苗，其在可藥用載體或賦形劑中包含分枝桿菌或該分枝桿菌的部分，所述分枝桿菌在選自SapM、對應(yīng)于牛分枝桿菌中Mbl661c的內(nèi)源ManLAM a -1,2-甘露糖基轉(zhuǎn)移酶、對應(yīng)于牛分枝桿菌中Mb2203的內(nèi)源ManLAM a -I，2-甘露糖基轉(zhuǎn)移酶和對應(yīng)于牛分枝桿菌中Mb2196的內(nèi)源LM a-1，6_甘露糖基轉(zhuǎn)移酶的至少ー個內(nèi)源基因中包含基因工程突變。
13.權(quán)利要求12的針對結(jié)核的疫苗，其中所述疫苗適合用于保護哺乳動物免受選自牛分枝桿菌或結(jié)核分枝桿菌的毒性分枝桿菌攻擊。
14.權(quán)利要求12或13的疫苗，其中所述疫苗包含活減毒疫苗。
15.權(quán)利要求I至7中任一項的分枝桿菌或權(quán)利要求12至14中任一項的疫苗用于治療結(jié)核。
全文摘要
結(jié)核(TB)是重要的健康問題，目前唯一獲批的TB疫苗是牛分枝桿菌卡介苗(牛分枝桿菌BCG)。在本發(fā)明中，針對疫苗目的評價了報道為涉及吞噬體成熟抑制的分枝桿菌成分的突變，因為這類突變應(yīng)導(dǎo)致更好的疫苗抗原加工和呈遞。因此，在嚴格的小鼠模型中作為TB疫苗評價了編碼ManLAM帽化α-1，2-甘露糖基轉(zhuǎn)移酶和PI3P磷酸酶SapM的基因中的BCG突變型。與未接種的小鼠相比，接種ManLAM帽化突變體和SapM突變體都導(dǎo)致顯著更長的存活，而接種親本BCG則不然。此外，接種SapM突變體的小鼠存活顯著長于接種親本BCG的小鼠。突變體BCG菌株在巨噬細胞中顯示未改變的吞噬、復(fù)制、溶酶體共定位和氧化劑活性，且在后者中相似地誘導(dǎo)自噬。此外，在小鼠中的復(fù)制和肉芽腫形成未受影響，表明這些疫苗等同于BCG的安全性。
文檔編號C12N9/16GK102781456SQ201080043070
公開日2012年11月14日 申請日期2010年7月28日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月28日
發(fā)明者A·巴特尼, C·許根, N·卡勒維爾特, N·菲斯詹斯 申請人:公共衛(wèi)生科學(xué)研究所, 國立比利時根特大學(xué), 非營利性組織佛蘭芒綜合大學(xué)生物技術(shù)研究所