一種重組豬干擾素β1-Fc融合蛋白及其編碼基因和表達(dá)方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種重組豬IFNβ1-Fc融合蛋白及其編碼基因、表達(dá)、純化和包涵體復(fù)性方法，屬于生物基因工程領(lǐng)域。IFNβ可增強(qiáng)豬的免疫力，在獸藥產(chǎn)業(yè)中具有良好的應(yīng)用前景。但是，天然的豬IFNβ1表達(dá)量甚微，不足以研發(fā)應(yīng)用，并且存在血漿清除率快的缺陷。本發(fā)明提供了一種適于大腸桿菌原核表達(dá)體系的重組豬IFNβ1-Fc融合蛋白。其中，豬IFNβ1部分為豬IFNβ1胞外區(qū)的全部序列，F(xiàn)c片段部分包括抗體的鉸鏈區(qū)、CH2區(qū)和CH3區(qū)，二者之間為直接融合。本發(fā)明的融合蛋白，不僅在很大程度上保持了原蛋白IFNβ1的生物活性，而且極大的延長了其半衰期，為其產(chǎn)業(yè)化發(fā)展提供了機(jī)遇。
【專利說明】—種重組豬干擾素β 1-Fc融合蛋白及其編碼基因和表達(dá)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物工程基因領(lǐng)域，涉及一種重組豬干擾素β 1-Fc融合蛋白及其編碼基因，以及其表達(dá)、純化和包涵體復(fù)性方法。
【背景技術(shù)】
[0002]干擾素(Interferon，IFN)是一組具有多種功能的活性蛋白質(zhì)(主要是糖蛋白)，是一種由單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子。它們在同種細(xì)胞上具有廣譜的抗病毒、影響細(xì)胞生長，以及分化、調(diào)節(jié)免疫功能等多種生物活性。根據(jù)IFN的來源即動物種類、細(xì)胞類型、誘生劑的性質(zhì)和誘生條件不同，可分為α、β、Υ三種。其中，干擾素-β主要由成纖維細(xì)胞產(chǎn)生，在體內(nèi)具有增強(qiáng)細(xì)胞表面HLA1、II類抗原表達(dá)，提高血清新蝶吟和β2-微球蛋白水平、增強(qiáng)NK細(xì)胞活力和ADCC作用以及外周淋巴細(xì)胞2’，5’-寡腺昔合成酶活性。臨床已將干擾素-β應(yīng)用于病毒感染和腫瘤疾病的治療中。
[0003]我國是生豬養(yǎng)殖大國，豬圓環(huán)病毒病、豬繁殖與呼吸綜合征、豬偽狂犬病等多種豬病毒性傳染病給養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。目前我國雖廣泛接種各種豬病疫苗，仍不能有效控制疾病流行。干擾素β具有較強(qiáng)的抗病毒效應(yīng)及免疫調(diào)節(jié)活性，因此在獸藥領(lǐng)域中的應(yīng)用越來越廣泛。在不同類型的干擾素中，干擾素β比干擾素α具有更好的抗SARS-CoV效果，而干擾素β在酸、堿、熱的穩(wěn)定性也明顯優(yōu)于干擾素α。然而，干擾素β種屬差異較大，僅依靠在活豬體內(nèi)提取遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足市場的要求。動物用基因工程干擾素β無藥物殘留、無副作用，很受臨床獸醫(yī)和養(yǎng)殖戶的青睞，但是市場上多數(shù)類似藥物依然面臨著產(chǎn)量不足、質(zhì)量層次不齊、價格昂貴等問題。
[0004]另一方面，作為小分子量蛋白，豬干擾素β I也與其他干擾素β —樣，存在血漿清除速度較快的缺陷，從而導(dǎo)致在臨床治療中需要重復(fù)多次用藥才能達(dá)到治療效果。同樣，半衰期短及用藥的頻繁也將成為使用豬干擾素β I治療豬病毒性疾病的瓶頸。IgG免疫球蛋白是人和動物體內(nèi)的主要抗體，它在體內(nèi)的半衰期約為20天。其穩(wěn)定性是由于IgG的Fe片段可與新生Fe受體(FcRn)結(jié)合，避免IgG進(jìn)入溶酶體中被降解。有鑒于此，本發(fā)明嘗試考慮在豬干擾素β I上增加IgG的Fe片段來構(gòu)成融合蛋白，以提高豬干擾素β I體內(nèi)半衰期，達(dá)到長效的目的。但是，一般來說，在小分子蛋白上增加IgG的Fe片段后都會使得蛋白的生物活性有很大程度的降低。由此，本發(fā)明的目的是提供一種既能保留豬干擾素β?原有活性，又可以延長體內(nèi)半衰期的豬干擾素β I與Fe片段的融合蛋白。
[0005]然而，通過大腸桿菌表達(dá)的重組蛋白多為不溶解、無活性的細(xì)胞內(nèi)聚集物，即包涵體。包涵體的復(fù)性是一個非常復(fù)雜的過程，如果復(fù)性條件不適宜將會出現(xiàn)分子內(nèi)二硫鍵的錯配，分子間共價結(jié)合或疏水結(jié)合形成聚合體，一方面降低重組蛋白的比活率，造成產(chǎn)品質(zhì)量不合格，同時又產(chǎn)生沉淀析出，影響得率。因此，本發(fā)明所要解決的另一個技術(shù)問題是采用合適的方法將大腸桿菌表達(dá)的蛋白包涵體復(fù)性為具有生物活性的蛋白。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足之處，通過密碼子優(yōu)化的方式，提供一種可在大腸桿菌內(nèi)高效表達(dá)的重組豬干擾素β 1-Fc融合蛋白以及其基因和表達(dá)、純化、復(fù)性方法。
[0007]本發(fā)明提供了重組豬干擾素β 1-Fc融合蛋白，所述融合蛋白包括豬干擾素β I部分和Fe片段部分，其中，豬干擾素β I部分為豬干擾素β I胞外區(qū)的全部序列，F(xiàn)e片段部分包括鉸鏈區(qū)、CH2區(qū)和CH3區(qū)，豬干擾素β I與Fe片段部分之間為直接融合。
[0008]其中的Fe片段選自人或動物的免疫球蛋白Fe，是Fe全長或是部分序列，F(xiàn)e選自IgG、IgM、IgD、IgA,每種免疫球蛋白類型包括各亞型,如IgGl、IgG2、IgG3、IgG4。本發(fā)明的融合蛋白中的Fe片段部分特別優(yōu)選來自豬的IgGl。
[0009]優(yōu)選地，本發(fā)明的重組豬干擾素β 1-Fc融合蛋白具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，其中第2-165位氨基酸殘基為豬干擾素β I的胞外區(qū)序列，第166-395位氨基酸殘基為豬IgGl序列。
[0010]本發(fā)明提供了編碼上述所述重組豬干擾素β 1-Fc融合蛋白的基因，其堿基序列如SEQ ID Ν0:1所示。該序列是專為大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行密碼子優(yōu)化得到的序列，相比之下能顯著提高異源基因在宿主菌中的表達(dá)。
[0011]本發(fā)明還提供了包含了上述所述編碼重組豬干擾素β 1-Fc融合蛋白的基因的質(zhì)粒，所述的質(zhì)粒優(yōu)選為原核表達(dá)質(zhì)粒，最優(yōu)選為pET21b載體。
[0012]本發(fā)明還提供了包含有上述所述質(zhì)粒的大腸桿菌菌株，優(yōu)選地，所述菌株選自大腸桿菌BL21 (DE3)菌株。
[0013]本發(fā)明還提供了重組豬干擾素β 1-Fc融合蛋白在大腸桿菌表達(dá)方法，包括如下步驟:
[0014]該方法的步驟為:
[0015]1.挑取I個或多個含有上述所述重組豬干擾素β 1-Fc融合蛋白的大腸桿菌菌落，接入LB培養(yǎng)液，于37 °C培養(yǎng)過夜；
[0016]2.取適量過夜培養(yǎng)物，接入于所述過夜培養(yǎng)物的100倍量的LB培養(yǎng)液中，于37°C震蕩培養(yǎng)至對數(shù)中期，即菌體密度0D_=1.0 ；
[0017]3.在培養(yǎng)物中加入濃度為Im mol/L的IPTG，于37°C，誘導(dǎo)表達(dá)4h后，于4°C以轉(zhuǎn)速5000rpm,離心處理15min,收集含有重組豬干擾素β 1-Fc融合蛋白的大腸桿菌菌體。
[0018]所述LB培養(yǎng)液中均含有氨芐青霉素50-100 μ g/ml。
[0019]本發(fā)明的上述所述表達(dá)方法是經(jīng)過發(fā)明人反復(fù)多次實驗摸索和驗證得到的用于表達(dá)重組豬干擾素β 1-Fc融合蛋白的最為有效的方法，該方法的表達(dá)量高，且表達(dá)得到包涵體復(fù)性后活性更高。
[0020]本發(fā)明還提供了重組豬干擾素β 1-Fc融合蛋白的包涵體純化方法，包括如下步驟:
[0021]1.將收集得到的上述含有誘導(dǎo)重組豬干擾素β 1-Fc融合蛋白大腸桿菌沉淀，用預(yù)冷的PBS重懸，并于4°C高速離心處理；重復(fù)一次。
[0022]2.吸去上清，稱菌體沉淀重量，每克(濕重)加入裂解緩沖液Buffer A3_10mL，攪動緩沖液，使菌體懸起。[0023] 3.每克(濕重)菌體加入3-10yL濃度為lOOmmol/L的PMSF，3-100yL濃度為100mg/mL的溶菌酶，于冰上攪動。
[0024]4.破碎菌體，樣品置于冰上，超聲，并于4°C高速離心處理。
[0025]5.沉淀用洗滌緩沖液Buffer B洗滌，并于4°C高速離心處理，沉淀包涵體，重復(fù)一次。
[0026]6.包涵體沉淀用變性緩沖液Buffer C溶解,室溫下攪拌30_60min。
[0027]7.充分混勻后室溫高速離心處理，棄沉淀，取上清，即得到重組豬干擾素β 1-Fc融合蛋白變性溶液。
[0028]該純化方法優(yōu)選步驟如下:
[0029]1.將收集得到的上述含有誘導(dǎo)重組豬干擾素β 1-Fc融合蛋白大腸桿菌沉淀，用預(yù)冷的PBS重懸，于4°C，以12000rpm的轉(zhuǎn)速離心15min ;重復(fù)一次。
[0030]2.吸去上清，稱菌體沉淀重量，每克(濕重)加入裂解緩沖液Buffer A5mL，用磨光玻璃棒攪動，使菌體懸起。
[0031]3.每克(濕重)菌體加入5μ L濃度為100mmol/L的PMSF，5y L濃度為100mg/mL的溶菌酶，冰上攪動20min。
[0032]4.用探針型超聲波儀破碎菌體，樣品置于冰上，超聲120次，每次5s間隔5s，循環(huán)三次，每次循環(huán)至冷卻樣品之間等待2min,等待樣品冷卻。于4°C ,以12000rpm的轉(zhuǎn)速離心15min,棄上清。
[0033]5.沉淀用洗漆緩沖液Buffer B洗漆,于4?,以12000rpm的轉(zhuǎn)速離心15min,沉淀
包涵體，重復(fù)一次。
[0034]6.包涵體沉淀用變性緩沖液Buffer C溶解，室溫下攪拌30min。
[0035]7.充分混勻后室溫下以12000rpm的轉(zhuǎn)速離心15min，棄沉淀，取上清，即得到重組豬干擾素β 1-Fc融合蛋白變性溶液。
[0036]本發(fā)明還提供了優(yōu)化后的重組豬干擾素β 1-Fc融合蛋白的包涵體復(fù)性方法，包括如下步驟:
[0037]取適量用變性緩沖液Buffer C溶解的重組豬干擾素β 1-Fc融合蛋白變性溶液，用復(fù)性緩沖液Buffer D將蛋白濃度稀釋到0.2mg/mL, 4°C復(fù)性至24h時，將復(fù)性后重組蛋白溶液用0.45 μ m濾膜過濾，即得到低濃度的重組豬干擾素β 1-Fc融合蛋白溶液。并可進(jìn)一步超濾脫鹽、濃縮，低溫真空干燥，即獲得重組豬干擾素β 1-Fc融合蛋白粉末。各緩沖液的成分及其含量如下表所示:
[0038]
【權(quán)利要求】
1.一種重組豬干擾素β 1-Fc融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白包括豬干擾素β?部分和Fe片段部分，所述豬干擾素β?部分為豬干擾素β I胞外區(qū)的全部序列，所述Fe片段部分包括鉸鏈區(qū)、CH2區(qū)和CH3區(qū)，豬干擾素β I與Fe片段部分之間為直接融合。
2.如權(quán)利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO:2所示。
3.—種編碼權(quán)利要求2中所述的融合蛋白的基因，其堿基序列如SEQ ID NO:1所示。
4.一種載體,所述載體含有權(quán)利要求3的基因。
5.如權(quán)利要求4所述的載體，所述載體為pET21b。
6.一種大腸桿菌，所述大腸桿菌具有權(quán)利要求4或5的載體。
7.如權(quán)利要求6所述的大腸桿菌，所述大腸桿菌為BL21(DE3)菌株。
8.—種重組豬干擾素β 1-Fc融合蛋白的原核細(xì)胞表達(dá)方法，包括如下步驟: (1)在合適的條件下于培養(yǎng)基中培育權(quán)利要求6或7中所述的大腸桿菌； (2)從大腸桿菌和/或培養(yǎng)基中分離重組豬干擾素β1-Fc融合蛋白。
9.如權(quán)利要求8所述的表達(dá)方法，包括如下步驟: (O挑取一個或多個含有權(quán)利要求6或7中所述的大腸桿菌菌落，接入含抗生素的LB培養(yǎng)液，培養(yǎng)過夜； (2)取過夜培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接入于含抗生素的新鮮LB培養(yǎng)液中，于37°C震蕩培養(yǎng)至菌體密度OD600=L O ； (3)在培養(yǎng)物中加入濃度為Immo I/L的IPTG，37°C，誘導(dǎo)表達(dá)3h后，離心處理收集含有重組豬干擾素β 1-Fc融合蛋白的大腸桿菌菌體沉淀。
10.一種重組豬干擾素β 1-Fc融合蛋白的純化和復(fù)性方法，其特征在于，包含如下步驟: (1)將收集得到的如權(quán)利要求9所述的含有誘導(dǎo)重組豬干擾素β1-Fc融合蛋白大腸桿菌沉淀，PBS重懸，并于4°C高速離心處理，重復(fù)一次； (2)吸去上清，稱菌體沉淀重量，每克(濕重)菌體加入裂解緩沖液BufferA3-1OmL,攪動緩沖液，使菌體懸起； (3)每克(濕重)菌體加入3-10μ L濃度為100mmol/L的PMSF，3-100yL濃度為IOOmg/mL的溶菌酶,于冰上攪動； (4)破碎菌體，樣品置于冰上，超聲，并于4°C高速離心處理； (5)沉淀用洗滌緩沖液BufferB洗滌，并于4°C高速離心處理，沉淀包涵體，重復(fù)一次； (6)包涵體沉淀用變性緩沖液BufferC溶解,室溫下攪拌30_60min ； (7)充分混勻后室溫高速離心處理，棄沉淀，取上清，即得到重組豬干擾素β1-Fc融合蛋白變性溶液； (8)取用變性緩沖液BufferC溶解的重組豬干擾素β 1-Fc融合蛋白變性溶液，用復(fù)性緩沖液Buffer D將重組豬干擾素β l_Fc融合蛋白變性溶液的濃度稀釋至0.2mg/mL，4°C復(fù)性24h，將復(fù)性后重組蛋白溶液用0.45 μ m濾膜過濾，即得到重組豬干擾素β l_Fc融合蛋白復(fù)性溶液； 所述重組豬干擾素β 1-Fc融合蛋白復(fù)性溶液可進(jìn)一步超濾濃縮、脫鹽至最小體積，低溫真空干燥，即獲得重組豬干擾素β 1-Fc粉末。
【文檔編號】C12N1/21GK103570836SQ201310511897
【公開日】2014年2月12日 申請日期:2013年10月25日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月25日
【發(fā)明者】馬永, 王安良, 章成昌, 徐春林, 陳晨, 王耀方 申請人:江蘇眾紅生物工程創(chuàng)藥研究院有限公司, 常州京森生物醫(yī)藥研究所有限公司