一種攜帶IL-15/sIL-15Ra融合基因的微環(huán)DNA表達載體的構建方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物工程領域，具體涉及一種攜帶IL-15/sIL-15Ra融合基因的微環(huán) DNA表達載體的構建方法。
【背景技術】
[0002] IL-15是1994年Grabstein等在檢測猴腎表皮細胞系CV-1/EBVA上清液時發(fā)現的 一種可溶性細胞因子，它能維持CTLL-2細胞的增殖，具有許多與IL-2相似的生物活性，因 而受到廣泛關注。研宄發(fā)現，IL-15和它的可溶性受體sIL-15Ra形成復合物后，能夠更有效 地與IL-15R/IL-2R 0、y亞基結合，并且在血清中的半衰期可以由原來的30分鐘延長到 20小時，其生物活性也可以提高至少50倍。體外研宄表明，IL-15/sIL-15Ra復合物可以極 大地促進⑶8+T、NK、NKT的增殖和功能，因此又被稱為超級白介素-15 (Hyper-IL-15)。多 項研宄表明，該復合物在多種腫瘤模型中表現出比IL-15更強的抗腫瘤效應，全身性給予 IL-15/sIL-15Ra復合物可以明顯消退已建立的胰腺癌和轉移性黑色素瘤。
[0003] 微環(huán)DNA (minicircle DNA，MC)表達載體是傳統質粒在大腸桿菌中通過位點 特異性重組得到的一種新型超螺旋表達框。在攜帶真核表達框的親本質粒兩側插入重 組酶識別位點，誘導體內相關重組酶表達，該重組酶將識別位點中的DNA序列切斷，親本 質粒（parental plasmid，PP)被分成2個超螺旋分子，一個是具有復制功能的小質粒 (miniplasmid，MP)，另一個是攜帶真核表達框的微環(huán)DNA。微環(huán)DNA表達載體沒有復制起 始點和抗性標記等細菌序列，增加了生物安全性，它比傳統載體在生物體內的表達時間長， 表達效率高。經實驗證明，帶有目的基因的微環(huán)DNA表達載體可用于體內外各種實驗，其在 生物體內的存在時間要比傳統質粒要長的多，比如利用傳統質粒轉入的基因，2周后在體內 就基本檢測不到了，而以微環(huán)質粒為載體的目的基因在3周的時候還能在體內檢測到。
[0004] 但是，現有技術中還沒有將IL-15/SIL-15Ra融合基因整合于微環(huán)DNA表達載體中 的相關報道。

【發(fā)明內容】

[0005] 針對上述情況，本發(fā)明的目的在于提供一種攜帶IL-15/sIL_15Ra融合基因的微 環(huán)DNA表達載體的構建方法。
[0006] 具體而言，通過分別克隆小鼠的IL-15和sIL-15Ra基因，利用重組PCR技術將兩 個基因融合在一起，構建IL-15/sIL-15Ra融合基因的重組親本質粒，轉化大腸桿菌后，通 過甩環(huán)和純化，獲得攜帶IL-15/sIL-15Ra融合基因的微環(huán)DNA表達載體。
[0007] 為了達到上述目的，本發(fā)明采用如下技術方案： 一種攜帶IL-15/sIL-15Ra融合基因的微環(huán)DNA表達載體的構建方法，其包括以下步 驟： 1) IL-15/sIL-15Ra融合基因的獲?。?從小鼠組織中提取總RNA，逆轉錄成cDNA，設計引物并按下法合成IL-15/sIL-15Ra融 合基因：首先以cDNA為模板，利用引物對1和引物對2分別擴增出表達IL-15和sIL-15Ra 的兩個基因片段，其次以表達IL-15和sIL-15Ra的兩個基因片段為模板，利用引物對3和 引物對4分別擴增出帶有重疊序列的表達IL-15和sIL-15Ra的兩個基因片段，最后通過重 疊PCR技術將二者采用包含45至90個堿基的軟鏈接連接起來，得到IL-15/sIL-15Ra融合 基因，并以其為模板，利用引物對5擴增出帶有酶切位點的IL-15/sIL-15Ra融合基因，通過 純化、回收及測序，得到序列正確的帶有酶切位點的IL-15/sIL-15Ra融合基因； 其中：引物對1中的正向引物為SEQ ID NO:l，反向引物為SEQ ID NO:2;引物對2中 的正向引物為SEQ ID NO:3,反向引物為SEQ ID N0:4;引物對3中的正向引物為SEQ ID NO:5,反向引物為SEQ ID NO:6;引物對4中的正向引物為SEQ ID NO:7,反向引物為SEQ ID NO:8;引物對5中的正向引物為SEQ ID NO:9,反向引物為SEQ ID NO: 10,所述引物的序列 如下所示（以下劃線標注的堿基對應擴增后基因片段中的重疊序列，以下劃線及斜體標注 的堿基對應擴增后融合基因中酶切位點的序列）： SEQ ID N0:1 ：5'-ATGAAAATTTTGAAA-3'； SEQ ID N0:2:5'-TCAGGACGTGTTGATGAACA-3' ； SEQ ID N0:3:5'-GGCACCACGTGTCCACCTC-3' ； SEQ ID N0:4 ：5'-TCATTTCGTCATTTTGGAACTGTGG-3,； SEQ ID N0:5 ：5'-ATGAAAATTTTGAAA-3'； SEQ ID N0:6 :5'-AGAGCCACCTCCGCCTGAACCGCCTCCACCTCAGGACGTGTTGATGAACA-3' ； SEQ ID N0:7 :5'-GGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCGGGCACCACGTGTCCACCTC-3' ； SEQ ID N0:8 ：5'-TCATTTCGTCATTTTGGAACTGTGG-3,； SEQ ID NO:9 ：5' -GAArr<XCACCATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTTCC AGGTTCCACTGGTGACAACTGGATAGATGTA-3' ； SEQ ID NO:10 ：5'-GGAr6CTCATTTCGTCATTTTGGAACTGTGG~3'； 2) IL-15/sIL-15Ra融合基因重組親本質粒的構建： 將步驟1)中序列正確的帶有酶切位點的IL-15/sIL-15Ra融合基因插入到微環(huán)親本 克隆載體中，轉化感受態(tài)大腸桿菌后篩選陽性菌落，抽取質粒后，通過測序獲得序列正確的 IL-15/sIL-15Ra融合基因重組親本質粒； 3) IL-15/sIL-15Ra融合基因微環(huán)DNA的誘導和純化： 將步驟2)中獲得的序列正確的IL-15/sIL-15Ra融合基因重組親本質粒轉化至大腸桿 菌菌體，首先將菌體接種于TB培養(yǎng)基中，搖菌過夜，次日加入LB培養(yǎng)基，然后分次向菌液中 添加阿拉伯糖以誘導微環(huán)DNA的產生，隨時檢測pH值并保持在7. 0~8. 5的范圍之內，誘導 完畢后進行質粒抽提和純化，得到攜帶IL-15/sIL-15Ra融合基因的微環(huán)DNA表達載體。
[0008] 上述技術方案中，步驟1)中所述組織為肌肉組織，通過Trizol法提取其中的總 RNA〇
[0009] 上述技術方案中，步驟1)中所述軟鏈接包含78個堿基。
[0010] 上述技術方案中，步驟2)中所述微環(huán)親本克隆載體為pMC. CMV-MCS-SV40polyA載 體。
[0011] 上述技術方案中，步驟2)中采用雙酶切法將序列正確的IL-15/SIL-15Ra融合基 因插入到微環(huán)親本克隆載體中，優(yōu)選使用EcoRI內切酶和BamHI內切酶。
[0012] 上述技術方案中，步驟2)中所述感受態(tài)大腸桿菌為感受態(tài)DH5a大腸桿菌。
[0013] 上述技術方案中，步驟3)中所述大腸桿菌為大腸桿菌ZYCY10P3S2T。
[0014] 上述技術方案中，步驟3)中分3~5次向菌液中添加阿拉伯糖，各次之間的間隔為 1~3小時。
[0015] 上述技術方案中，步驟3)中所述阿拉伯糖與菌液之間的重量體積比為3~6g: 1L。
[0016] 由于上述技術方案的運用，本發(fā)明與現有技術相比具有下列優(yōu)點： (1) 本發(fā)明首次將IL-15/sIL-15Ra融合基因重組于微環(huán)DNA，與體外將IL-15和 IL-15Ra兩種細胞因子混合或兩種質粒的共轉染等傳統方法相比，IL-15/sIL-15Ra融合基 因的獲得更加方便，其功能也更加穩(wěn)定； (2) 在生物體內表達時，攜帶IL-15/sIL-15Ra融合基因的微環(huán)DNA由于沒有復制起始 點和抗性標記等細菌序列，故而增加了生物安全性； (3) 經實驗證明，攜帶11-15/8幾-151^融合基因的微環(huán)0嫩可用于各種體內外實驗，其 在生物體內存在的時間要比傳統質粒更長。
【附圖說明】
[0017] 圖1為IL-15、sIL-15Ra以及IL-15/sIL-15Ra融合基因的2%瓊脂糖凝膠電泳圖， 其中A中的M代表Marker，1代表表達IL-15的基因片段，2代表表達sIL-15Ra的基因片 段，B中的M代表Marker，l代表1L-15/sIL-15Ra融合基因。由此可知，表達IL-15的基因 片段與表達sIL-15Ra的基因片段成功地連接在一起，形成了 IL-15/sIL-15Ra融合基因。
[0018] 圖2為攜帶IL-15/sIL-15Ra融合基因的T載體的BamHI/EcoRI雙酶切鑒定電泳圖 以及測序比對圖，其中