一種糖胺聚糖裂解酶及其編碼基因與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種糖胺聚糖裂解酶及其編碼基因與應(yīng)用，屬于生物技術(shù)技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 糖胺聚糖（Glycosaminoglycan, GAG)是廣泛存在與動(dòng)物結(jié)締組織中的一類多 糖。GAG屬于直鏈多糖，由氨基己糖和糖醛酸及其它們異構(gòu)化或硫酸化殘基以雙糖單位重 復(fù)構(gòu)成，其結(jié)構(gòu)通式為[己糖醛酸-己糖胺] n，重復(fù)雙糖結(jié)構(gòu)的個(gè)數(shù)（n)隨種類而異，一 般在30和250之間。GAG根據(jù)其單糖組成及糖苷鍵連接形式的不同，可分為硫酸軟骨素 (chondroitin sulfate，CS)、硫酸皮膚素（dermatan sulfate，DS)、硫酸角質(zhì)素（kermatan sulfate，KS)、透明質(zhì)酸（hyaluronic acid，HA)、肝素（heparin，HP)及硫酸乙酰肝素 (heparin sulfate，HS)等類別。其中HA廣泛存在于動(dòng)物結(jié)締組織的細(xì)胞外基質(zhì)中，在 胚胎、滑液、玻璃體等組織中尤為豐富，起到潤滑、防震和增稠劑的作用。CS常以蛋白聚糖 聚集體形式存在于動(dòng)物鼻骨、喉骨、軟骨等組織中（Lauder RM，Chondroitin sulphate:A complex molecule with potential impacts on a wide range of biological systems. Complementary therapies in medicine，2009, 17:56-62.)，具有治療風(fēng)濕病、關(guān)節(jié)炎、骨質(zhì) 疏松癥等多種藥理學(xué)活性。HP主要存在于肺、肝、皮膚和其它結(jié)締組織的肥大細(xì)胞中，是一 種天然的抗凝劑，臨床上用作抗凝血酶的增強(qiáng)劑。
[0003] 大量研宄表明，GAG糖鏈的長度，單糖殘基和硫酸根基團(tuán)的排列形式?jīng)Q定了糖鏈與 各類蛋白因子結(jié)合的能力，進(jìn)而影響其所在蛋白聚糖的生物學(xué)活性。其中，由于低分子量 的GAG具有粘度小、溶解性好、易吸收等特點(diǎn)，相對于普通的GAG，有著更高的生物活性。因 此，低分子量GAG制備工藝的研宄是當(dāng)前的一個(gè)熱點(diǎn)話題。低分子量GAG的制備（Higashi K，et al. Photochemical preparation of a novel low molecyLar weight heparin. Carbohydrate Polymer，2012,87:1737-1743.)通常包括化學(xué)解聚法、物理解聚法、生物解 聚法、化學(xué)酶法合成等方法。其中生物解聚法主要是指酶裂解法，因其具有反應(yīng)效率高、污 染小、成本低等優(yōu)點(diǎn)，具有廣闊的應(yīng)用前景（Akio Hamai，et al. Two Distinct Chondroitin S y Lfate ABC Lyases. J. Biol. Chem. 1997, 272:9123-9130.)〇
[0004] 糖胺聚糖裂解酶是一類主要存在于微生物體內(nèi)，能將硫酸皮膚素、硫酸軟 骨素、透明質(zhì)酸等糖胺聚糖裂解為寡糖及不飽和二糖的裂解酶（Stern R，Jedrzejas MJ. Hyaluronidases ：their genomics structure, and mechanisms of action. Chemical Reviews，2006, 106 :818-839.)。根據(jù)其底物特異性的不同，可以分為透明質(zhì)酸酶 (hyaluronidase，HAase)、硫酸軟骨素酶（chondroitin sy Lfate lyase，ChSase)、肝素 裂解酶（heparin lyase)等。其中微生物來源的HAase通過作用于0-1，4糖苷鍵來降 解HA，終產(chǎn)物是不飽和寡糖（Xueping Guo，et al. A Novel Hyaluronidase Produced by Bacillus sp.A50.PLoS One. 2014, 9:94156)。此外還可在一定程度上催化作用于CS。 ChSase能將CS裂解為不飽和二糖及寡糖，根據(jù)其作用底物的差異主要分為ChSase ABC、 ChSase AC、ChSase B及ChSase C等多種類型。肝素酶主要從一些利用肝素為碳源的細(xì)菌 中分離得到，肝素黃桿菌是商品肝素酶的唯一來源。已從肝素黃桿菌中分離純化出的肝素 酶有三種，分別為肝素酶I、II、III，這三種酶具有不同的酶切識(shí)別位點(diǎn)。針對糖胺聚糖裂 解酶的開發(fā)已成為目前的研宄熱點(diǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供了一種糖胺聚糖裂解酶及其編碼基因與應(yīng)用。 本發(fā)明還構(gòu)建了該核酸分子的重組表達(dá)載體以及表達(dá)該重組蛋白的宿主細(xì)胞。
[0006] 本發(fā)明技術(shù)方案如下：
[0007] -種糖胺聚糖裂解酶的編碼基因ssgaglyase，核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0008] 一種糖胺聚糖裂解酶SSGAGlyase，氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
[0009] 一種重組載體，在質(zhì)粒上插入了含有上述糖胺聚糖裂解酶的編碼基因 ssgaglyase〇
[0010] 根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述的質(zhì)粒為pET28a(+)質(zhì)粒。
[0011] 一種重組細(xì)胞，將上述重組載體轉(zhuǎn)化入宿主細(xì)胞中獲得。
[0012] 根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述的宿主細(xì)胞為細(xì)菌、酵母或絲狀真菌。
[0013] 進(jìn)一步優(yōu)選的，所述的宿主細(xì)胞為大腸桿菌。最優(yōu)的，所述的宿主細(xì)胞為大腸桿菌 BL21(DE3) 〇
[0014] 上述糖胺聚糖裂解酶SSGAGlyase在生產(chǎn)低分子量糖胺聚糖中的應(yīng)用。
[0015] 根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述的低分子量糖胺聚糖為硫酸軟骨素和/或透明質(zhì)酸。
[0016] 有益效果
[0017] 本發(fā)明所述的糖胺聚糖裂解酶SSGAGlyase能夠選擇性降解CS、HA、DS，且有較高 的酶解活性，最終降解產(chǎn)物均為二糖，不能降解HP和HS。為系統(tǒng)的研宄新型糖胺聚糖裂解 酶提供參考，為糖胺聚糖的后續(xù)研宄開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。
【附圖說明】
[0018] 圖1、設(shè)計(jì)簡并引物克隆部分基因序列的電泳結(jié)果照片；
[0019] 圖中：M為marker ;1、2、3出現(xiàn)非特異性條帶；4、5出現(xiàn)明亮的單一條帶，為正確克 隆的產(chǎn)物；
[0020] 圖2、目的基因克隆電泳結(jié)果照片；
[0021] 圖中：M、IW為marker ;1、2、3、4、5、6為正確克隆的產(chǎn)物；
[0022] 圖3、重組蛋白的表達(dá)純化的結(jié)果照片；
[0023] 圖中：M為marker ;1為菌液上清，2為含空白質(zhì)粒的對照菌液上清；3為菌體沉淀； 4、5、6、7為純化得到的蛋白溶液；
[0024] 圖4A、實(shí)驗(yàn)組吸光度隨反應(yīng)時(shí)間的變化曲線；
[0025] 圖4B、對照組吸光度隨反應(yīng)時(shí)間的變化曲線；
[0026] 圖5A、重組蛋白酶解CS的產(chǎn)物分析圖譜；
[0027] 圖5B、重組蛋白酶解HA的產(chǎn)物分析圖譜；
[0028] 圖6、重組質(zhì)粒pET28a(+)-His_SSGAGlyase物理構(gòu)建圖譜。
【具體實(shí)施方式】
[0029] 下面結(jié)合實(shí)施例及說明書附圖，對本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步說明，但本發(fā)明所 保護(hù)范圍不限于此。
[0030] 發(fā)明人從土壤中篩選出一株產(chǎn)糖胺聚糖裂解酶菌株，通過對其形態(tài)分析和 16SrRNA基因序列的比對，鑒定該菌株屬于節(jié)桿菌屬（Arthrobacter sp.)，并命名為 SSAs-l〇
[0031] 實(shí)施例1全新糖胺聚糖裂解酶編碼基因的克隆
[0032] 1、擴(kuò)增模板的制備
[0033]使用Bacterial DNA Kit試劑盒（購自O(shè)MEGA Bio-tek公司）提取菌株SSAs-1 的全基因組，作為PCR擴(kuò)增全新GAG裂解酶編碼基因的模板。
[0034] 2、簡并引物的設(shè)計(jì)
[0035] 通過與同源關(guān)系較近已知的糖胺聚糖裂解酶氨基酸序列的比對，確定GNWWSWEIG 和WYECGNGENN為該類糖胺聚糖裂解酶家族保守序列，并據(jù)此設(shè)計(jì)PCR簡并引物，引物序列 如下：
[0036]上游引物 JP-L1 :5'-GGCAACTGGTGGTCMTGGGAG-3'；
[0037]下游引物 JP-L2:5 ' -CCAACAARAGCGGYAACGGCGT-3 '。
[0038] 3.擴(kuò)增部分目的基因
[0039] 使用Taq酶（購自Thermo Scientific公司）擴(kuò)增目的基因，PCR擴(kuò)增程序如下：
[0040] 95°C 預(yù)變性 10min ;95°C 變性 lmin，50°C 退火 lmin，72°C 延伸 2min，循環(huán) 30 次； 72°C延伸 10min ;
[0041] PCR擴(kuò)增體系如下：
[0042] DNA 模板（100ng/ y L)，1 y L ; JP-L1 (20 y M)，1 y L ; JP-L2 (20 y M)，1 y L ; dNTPs(10mM)，l yL ;Taq(2U/yL)，l yL ;10XTaq buffer，5yL ;ddH20，加至 50yL。
[0043] PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，結(jié)果如圖1所示。
[0044] 將電泳回收的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)DNA序列檢測，該序列長度為879bp。
[0045] 4、應(yīng)用DNA walking技術(shù)克隆剩余基因序列（參見Yao-Guang Liu，et al. High-efficiency thermal asymmetric interlaced PCR for amplification of unknown flanking sequences.BioTechniques，2007,44:649 - 656)，利用 SEQ ID NO. 1 所 示核苷酸序列，設(shè)計(jì)DNA walking引物，DNA walking引物序列如下：
[0046] Dff-Ll ：TTGGCGATCAGGTCCGGGCTG
[0047] DW-L2 ：GCTGAAGGAACTCGCCGCTTC
[0048] 使用Genome walking Kit (購自TAKARA BIO INC?公司）試劑盒，擴(kuò)增編碼糖胺 聚糖裂解酶的未知基因片段并測序確定DNA序列，預(yù)測編碼目標(biāo)基因的起始密碼子（ATG) 和終止密碼子（TAG)，從而確定目標(biāo)基因序列的長度為2370bp。
[0049] 5、根據(jù)DNA walking實(shí)驗(yàn)結(jié)果設(shè)計(jì)目的基因上下游引物，
[0050] SS-L1 ：ATGACGCGTGAACTTTCCCGAC
[0051] SS-L2 ：CTAGCGGTGCAGCGTGACCTC
[0052] 并以全基因組為模板PCR擴(kuò)增全部目的基因。測序得到目的基因的核苷酸序列如 SEQ ID NO. 1所示，并驗(yàn)證了目標(biāo)基因序列的長度為2370bp。
[0053