高正電荷熒光蛋白在糖胺聚糖及其類似物分析檢測中的應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及高正電荷綠色熒光蛋白在糖胺聚糖研宄中的應用，屬于生物化學技術 領域。
【背景技術】
[0002] 糖胺聚糖（Glycosaminoglycans，GAGs)又稱為粘多糖，是重復二糖單位組成的 直鏈聚陰離子多糖。主要包括透明質酸（Hyaluronic Acid，HA)，肝素/硫酸乙酰肝素 (Heparin/Heparan Sulfate，Hep/HS)，硫酸軟骨素 / 硫酸皮膚素（Chondroitin Sulfate/ Dermatan Sulfate，CS/DS)，硫酸角質素（Keratan Sulfate，KS)。除硫酸角質素的二糖單 位是由中性的D-半乳糖和N-乙酰葡糖胺組成以外，其它GAGs的二糖單位均是由己糖醛酸 (D-葡萄糖醛酸/L-艾杜糖醛酸）與己糖胺（N-乙酰葡萄糖胺/N-乙酰半乳糖胺）組成。 其中HA結構相對簡單，由D-葡萄糖醛酸和N-乙酰葡糖胺組成的二糖單位經β -1，4-糖苷 鍵連接而成。其它GAGs則由于各種修飾酶的作用使糖鏈變得異常復雜，主要表現在糖鏈中 不同部位羥基（-0Η)和氨基（-NH 2)的硫酸化，D-葡萄糖醛酸在C5-差向異構酶的作用下轉 變?yōu)長-艾杜糖醛酸，己糖胺二位氨基的乙酰化等。GAGs糖鏈結構的這種高度復雜性不是隨 機發(fā)生的，而是具有高度的時空特異性，是各種糖鏈合成相關酶在不同細胞組織和器官的 不同發(fā)育階段表達調控水平所致，不同的結構使其具有不同的功能，結構的復雜性賦予其 功能的多樣性。
[0003] GAGs廣泛存在于動物細胞細胞表面和細胞基質中，通過與各種蛋白的特異相互作 用參與了細胞的增值和分化、細胞間的識別、細胞轉移、組織形態(tài)發(fā)生、癌變等各種生理和 病理過程[1-4]，GAGs所具有的一系列重要的生物學功能使其成為重要的生物活性分子， 在醫(yī)藥及功能食品中得到廣泛應用，如H印、CS、HA等[5, 6]。
[0004] GAGs的結構相對于核酸和蛋白質來說更為復雜，它的結構復雜性和多樣性為研宄 其結構與功能的關系帶來了很大的挑戰(zhàn)。各種陽離子染料（如：阿利新藍，甲苯胺藍和酰 胺黑等）常被用于樣品中GAGs的染色和檢測。然而這類染料具有很多缺點，如生物相容 性較差，不適用于對活細胞和組織染色；選擇性較低，致使出現很高的背景值；靈敏度較低 等。近年來，各種新型的陽離子發(fā)色團被合成并用于緩沖液或血清中的Hep進行高靈敏度 檢測，但其生物相容性及在其它糖胺聚糖檢測方面的應用有待進一步研宄。因此，亟待發(fā)展 一種生物相容性好、靈敏度高的多用途GAG探針用于各種生物樣品中GAGs的觀察和檢測。
[0005] 綠色焚光蛋白（GFP)是最早在一種學名為Aequorea victoria的水母中發(fā)現的。 因為GFP與活體生物的生物相報道基因被用于細胞生物學和分子生物學研宄。并且GFP可 以作為分子探針用于活體的實時監(jiān)測。最近，通過將GFP上的一些非保守氨基酸突變?yōu)橘?氨酸、精氨酸等堿性氨基酸，從而在不影響GFP熒光特性的情況下使其帶大量的正電荷，這 種高正電荷綠色熒光蛋白已被成功用于蛋白與核酸進入細胞的運輸載體，并作為核酸檢測 的高靈敏度探針[7, 8]。

【發(fā)明內容】

[0006] 本發(fā)明針對現有技術的不足，提供一種新的檢測糖胺聚糖的手段，即運用高正電 綠色熒光蛋白對糖胺聚糖進行定性定量分析檢測。
[0007] 本發(fā)明的技術方案如下：
[0008] 高正電荷熒光蛋白作為熒光標記物在糖胺聚糖和/或糖胺聚糖類似物分析檢測 中的應用，所述尚正電荷焚光蛋白的氣基酸序列如SEQ ID NO. 1所不。
[0009] 根據本發(fā)明優(yōu)選的，所述的糖胺聚糖類似物選自天然或人工半合成及全合成的聚 陰離子多糖；進一步優(yōu)選，所述的糖胺聚糖類似物選自：硫酸化多糖、多聚唾液酸、褐藻膠、 卡拉膠，巖藻聚糖或脂多糖。
[0010] 根據本發(fā)明優(yōu)選的，具體步驟如下：
[0011] ⑴使樣品與高正電荷熒光蛋白接觸，進行孵育結合，孵育時間5~30min，孵育后 待測樣品；
[0012] (2)去除未與待檢測樣品中糖胺聚糖和/或糖胺聚糖類似物結合的高正電荷熒光 蛋白，或者采用熒光淬滅劑淬滅與待檢測樣品中糖胺聚糖和/或糖胺聚糖類似物結合的高 正電荷熒光蛋白，制得待檢測樣品；
[0013] (3)對待檢測樣品進行熒光測定，根據熒光強度對樣品中糖胺聚糖和/或糖胺聚 糖類似物含量進行定性和/或定量分析。
[0014] 根據本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟（1)中的樣品為液體、固相載體、細胞、組織、器官。
[0015] 根據本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟⑴中，高正電荷熒光蛋白的接觸濃度為 0. 01-5. 0 μ g/ml。
[0016] 根據本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟（2)中，熒光淬滅劑選自：石墨烯、納米金和/或有機 小分子焚光淬滅劑。
[0017] 根據本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟（3)中，定量分析是通過檢測不同稀釋度的標準樣 品的熒光強度繪制標準曲線，根據標準曲線的濃度與熒光強度之間的線性關系獲得線性方 程，將待測樣品的熒光強度數值代入所得線性方程，計算獲得樣品中糖胺聚糖和/或糖胺 聚糖類似物的含量。
[0018] 根據本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟（3)中熒光測定為采用熒光顯微鏡、流式細胞儀或 活體成像設備進行定性分析。
[0019] 有益效果
[0020] 本發(fā)明首次將高正電GFP(ScGFP)作為生物相容性、高靈敏度和高選擇性熒光探 針，應用于用于活細胞表面的GAGs的可視化，血清中GAGs的高靈敏性定量分析，肝素中過 硫酸化的硫酸軟骨素污染分析等。從而克服了傳統陽離子染料在GAGs檢測中的生物相容 性差、選擇性低、靈敏度低等缺點，具有重要應用價值，可被廣泛應用于GAGs相關的基礎和 應用研宄、臨床診斷、醫(yī)藥和食品的檢測等。
【附圖說明】
[0021] 圖1 :重組高正電綠色熒光蛋白（ScGFP)表達及純化情況的聚丙烯酰胺凝膠電 泳圖（SDS-PAGE)。各泳道加入的樣品分別是：M:蛋白質分子量標準，條帶自上至下大小 為 116kD，66. 2kD，45kD，35kD，25kD，18. 4kD，14. 4kD ;泳道 I :對照菌株破壁前菌體，上樣 量10 μ L，泳道2 :重組菌破壁前菌體，上樣量10 μ L，泳道3 :重組菌破壁后上清，上樣量 10 μ L，泳道4 :經鎳柱純化的ScGFP，上樣量10 μ L。
[0022] 圖2 :不同濃度的糖胺聚糖對抑制氧化石墨烯淬滅ScGFP熒光的作用。A :透明質 酸（HA) ;Β:硫酸軟骨素A(CS-A) ;C:硫酸皮膚素（DS) ;D:肝素Ofep)。由下向上，糖胺聚糖 的濃度分別為 〇, 〇· 05, 0· 1，0· 15, 0· 2, 0· 25, 0· 3, 0· 35, 0· 4, 0· 45, 0· 5, 0· 55, 0· 6, 0· 65, 0· 7， 0. 75, 0. 8, 0. 85, 0. 9, 0. 95, 1 μ g/ml.
[0023] 圖3 :血清中不同濃度的肝素抑制氧化石墨烯淬滅ScGFP熒光的作用。由下向上， H印的濃度分別為 0, 0· 05, 0· 1，0· 15, 0· 2, 0· 25, 0· 3, 0· 35, 0· 4, 0· 45, 0· 5, 0· 55, 0· 6, 0· 65， 0. 7, 0. 75, 0. 8, 0. 85, 0. 9, 0. 95, 1 μ g/ml.
[0024] 圖4 :含不同過硫酸化硫酸軟骨素（OSCS)的肝素經肝素酶降解后對抑制氧化石墨 烯淬滅ScGFP熒光的作用。
[0025] 圖5 :共聚焦顯微鏡輔助檢測細胞表面的糖胺聚糖。
[0026] 圖6 :流式細胞儀輔助檢測細胞表面的糖胺聚糖。A :未用酶處理；B :經硫酸軟骨素 降解酶ABC處理；C :經肝素酶I、II和III處理；D :經硫酸軟骨素降解酶ABC和肝素酶I、 II和III共處理。
【具體實施方式】
[0027] 以下實施例的闡述，是為了全面公開本發(fā)明如何實施的一些常用技術，而不是為 了限制本發(fā)明的應用范圍。發(fā)明人已經盡最大努力確保實施例中各參數的準確性（例如 量，溫度，等等），但是一些實驗誤差和偏差也應該予以考慮。
[0028] 實施例1、ScGFP基因的獲得
[0029] 通過文獻報道獲得ScGFP (+36)的氨基酸序列[7]，并將所得的氨基酸序列轉變?yōu)?相應的堿基序列，并對所對應的堿基進行密碼子優(yōu)化，使其更容易在大腸桿菌中表達。所對 應的DNA序列由生工生物工程公司全合成。
[0030] 實施例2、ScGFP (+36)蛋白的表達與純化
[0031] 以實施例1得到的ScGFP基因為模板，進行PCR擴增。引物如下：
[0032] 正向引物 ScGFP-F:
[0033] (gCATATGATGGGTCACCATCATCATCATCACG)
[0034] 反向引物 ScGFP-R:
[0035] (gCTCGAGTTTGTAGCGTTCGTCACGACCGTG)
[0036] 正向引物下劃線標注的是限制性內切酶Nde I位點，反向引物下劃線標注的是限 制性內切酶Xho I位點。對PCR產物進行雙酶切，并將經過雙酶切的PCR產物與同樣經過 雙酶切pET-22b載體連接，并且篩選陽性的重組質粒（pET22b-ScGFP)?；驕y序結果表明， 在pET-22b的Nde I和Xho I酶切位點之間插入ScGFP基因，且插入方向正確。
[0037] 將pET22b-ScGFP轉化大腸桿菌菌株BL21 (DE3)(購自美國Novagen公司），然后 按照該公司提供的操作步驟進行重組高正電綠色熒光蛋白pET22b-ScGFP誘導表達。并用 Ni Sepharose? 6Fast Flow(GE)凝膠對scGFP進行純化，純化條件按照GE公司的產品手冊 操作。用聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測重組ScGFP的純化情況，結果如圖1所示，純化后的重組 ScGFP在電泳膠上呈單一條帶，且位置與預測的分子量相吻合；經測序，氨基酸序列如SEQ ID NO. 1 所示。
[0038] 實施例3、不同濃度的糖胺聚糖抑制氧化石墨烯淬滅scGFP熒光的作用
[0039] 在 IOmM Tris-HCl IOOmM NaCl (ρΗ7· 0)溶液中加入 0· 01-0. 5 μ g 的 ScGFP，然后 分別加入肝素（Hep)、硫酸軟骨素A(CS-A)、硫酸皮膚素（DS)、透明質酸（HA)使其終濃度為 0-1 μ g/ml，總體積為190 μ 1，室溫放置IOmin后，加入10 μ 1的氧化石墨稀，混勻、室溫放 置lOmin。用熒光分光光度計（F-4600,日立