一種重組人激肽釋放酶1及其編碼基因和制備方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種重組人激肽釋放酶1(Homo?sapiens?kallikrein1，hKLK1)及其編碼基因、表達(dá)、純化和包涵體復(fù)性方法，屬于生物基因工程領(lǐng)域。KLK1對(duì)心腦血管疾病、糖尿病并發(fā)癥等多種疾病均具有治療作用，但是動(dòng)物組織及人體液中提取的KLK1產(chǎn)量較低，且可能涉及安全性問(wèn)題。本發(fā)明采用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)對(duì)密碼子優(yōu)化后的重組人激肽釋放酶1基因進(jìn)行異源表達(dá)。此外，針對(duì)原核表達(dá)體系中的人激肽釋放酶1多以包涵體的形式表達(dá)的問(wèn)題，本發(fā)明還提供了重組人激肽釋放酶1包涵體復(fù)性和純化的方法，經(jīng)一步純化人激肽釋放酶1純度達(dá)到95%以上，并且具有較高活力。
【專利說(shuō)明】—種重組人激肽釋放酶1及其編碼基因和制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物工程基因領(lǐng)域，涉及一種重組人激肽釋放酶I及其編碼基因，以及其表達(dá)、純化和包涵體復(fù)性方法。
【背景技術(shù)】
[0002]激肽釋放酶一激肽系統(tǒng)(kallikrein kinin system, KKS)作為一個(gè)復(fù)雜的內(nèi)源性多酶系統(tǒng)，參與調(diào)控心血管、腎臟、神經(jīng)系統(tǒng)等的生理功能，與心臟病、腎病、炎癥反應(yīng)、癌癥等疾病的發(fā)生有著密切關(guān)系。KKS是體內(nèi)主要的降壓系統(tǒng)之一，由激肽原、激肽釋放酶(kallikrein，KLK)和激肽組成。KLK分為兩大類:血漿KLK和組織KLK，分別由前激肽釋放酶和KLK前體轉(zhuǎn)換而來(lái)。它們?cè)诜肿恿?、底物、免疫學(xué)特性、基因結(jié)構(gòu)和釋放的激肽種類方面有很大差異。其中，組織KLKl分解高分子激肽原(High Molecular Weight Kininogen,LMWK)生成激肽，參與多種生理過(guò)程，對(duì)血壓調(diào)節(jié)、電解質(zhì)平衡、炎癥反應(yīng)等生理或病理過(guò)程進(jìn)行調(diào)控，對(duì)心腦血管疾病、不孕不育癥、糖尿病腎病、視網(wǎng)膜靜脈阻塞都有療效。
[0003]目前，市售的KLKl主要來(lái)源于豬的胰臟提取或是人尿液提取，豬KLKl用于人類疾病的治療有較大的免疫原性，人尿提取的KLKl產(chǎn)量不高，而且可能帶有一些人類疾病病原。市場(chǎng)上還沒(méi)有重組KLKl產(chǎn)品，對(duì)于重組KLKl藥品的開發(fā)還處于初級(jí)階段，十分有必要進(jìn)行重組KLKl的研究。雖然已有畢赤酵母菌株進(jìn)行可溶表達(dá)KLKl蛋白的成功實(shí)例，但是酵母表達(dá)系統(tǒng)工藝復(fù)雜、耗時(shí)較長(zhǎng)，且胞內(nèi)表達(dá)不利于下游蛋白分離純化。因此本發(fā)明通過(guò)基因工程手段提供了一種成本低廉且可以大量表達(dá)重組人激肽釋放酶I表達(dá)系統(tǒng)和表達(dá)方法。
[0004]隨著后基因組計(jì)劃的進(jìn)行，將不斷地有新的功能基因被發(fā)現(xiàn)、克隆和表達(dá)，將會(huì)有越來(lái)越多的重組蛋白問(wèn)世；在已有的重組蛋白表達(dá)體系中，大腸桿菌(Escherichia coli,E.coli)原核表達(dá)系統(tǒng)因其操作方便、價(jià)格低廉、高效表`達(dá)和穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)而成為生產(chǎn)重組蛋白的首選表達(dá)體系，其中包括重組人干擾素a 2b、重組人干擾素a lb、重組人干擾素Y、重組人白介素_2、重組人粒細(xì)胞刺激因子等重組蛋白藥物。但若以人源KLKl (Homosapiens kallikreinl,以下簡(jiǎn)稱hKLKl)的原始核苷酸序列直接用大腸桿菌進(jìn)行表達(dá)，由于種屬差異，是無(wú)法最有效的表達(dá)hKLKl的，因此仍然需要尋找到一個(gè)更適合于大腸桿菌表達(dá)的hKLKl核苷酸序列和表達(dá)方法。另一方面，由于外源基因在E.coli中的高效表達(dá)，常導(dǎo)致重組蛋白聚集形成不溶性、無(wú)活性的包涵體；要想得到具有生物活性的重組蛋白，必須進(jìn)行包涵體的體外重折疊復(fù)性，而包涵體的復(fù)性是一個(gè)非常復(fù)雜的過(guò)程，不僅與蛋白質(zhì)復(fù)性的過(guò)程控制密切相關(guān)，還很大程度上取決于目的蛋白自身的性質(zhì)。hKLKl蛋白具有5對(duì)二硫鍵，對(duì)于hKLKl蛋白復(fù)性具有十分高的技術(shù)難度，如果復(fù)性條件不適會(huì)導(dǎo)致分子內(nèi)二硫鍵的錯(cuò)配，同時(shí)分子間共價(jià)結(jié)合或疏水結(jié)合易形成聚合體，造成產(chǎn)品質(zhì)量不合格，易產(chǎn)生沉淀析出，影響蛋白回收率和蛋白活性。雖然已有大腸桿菌表達(dá)成功的hKLKl蛋白，但只是通過(guò)復(fù)性方法制備hKLKl蛋白作為抗原制備抗體，表達(dá)hKLKl蛋白也沒(méi)有明確的活性(施偉慶，張磊，孫懷昌.人胰腺激肽釋放酶cDNA的克隆、序列分析和原核表達(dá)[J].農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2003,11 (2):169~172)。此外，有研究人員獲得帶His標(biāo)簽的大腸桿菌表達(dá)hKLKl蛋白，但是研究結(jié)果顯示其表達(dá)的hKLKl蛋白活性極低，與豬胰腺激肽釋放酶相比只有0.lIU/mL (李體遠(yuǎn)，杜珙，蔡筱彥，等.人組織激肽釋放酶成熟蛋白在大腸桿菌中的高效表達(dá)[J].中國(guó)生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào)，2003，19 (3):312~316)。因此，本發(fā)明所要解決的另一個(gè)技術(shù)問(wèn)題是:使大腸桿菌表達(dá)的人激肽釋放酶I包涵體復(fù)性為具有生物活性的蛋白酶，經(jīng)過(guò)簡(jiǎn)單純化使重組激肽釋放酶I具有較高純度和活性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足之處，首先通過(guò)密碼子優(yōu)化的方式，提供一種可在大腸桿菌內(nèi)高效表達(dá)且有活性的重組人激肽釋放酶I的基因序列和表達(dá)、純化、復(fù)性方法。
[0006]本發(fā)明提供了一種重組人激肽釋放酶1，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
[0007]本發(fā)明提供了編碼上述所述重組人激肽釋放酶I的基因，其堿基序列如SEQ IDNO:1所示。該序列是專為大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行密碼子優(yōu)化得到的序列，相比之下能顯著提高異源基因在宿主菌中的表達(dá)效率。
[0008]本發(fā)明還提供了包含了上述所述編碼重組人激肽釋放酶I的基因的載體，所述的載體優(yōu)選為原核表達(dá)質(zhì)粒，優(yōu)選為pET21b或pET28a，最優(yōu)選為pET21b。
[0009]本發(fā)明還提供了包含有上述所述載體的大腸桿菌菌株，優(yōu)選地，所述菌株選自大腸桿菌BL21 (DE3)菌株。
[0010]本發(fā)明還提供了重組人激肽釋放酶I在大腸桿菌表達(dá)方法，包括如下步驟: [0011]該方法的步驟為:
[0012]1.挑取上述所述重組人激肽釋放酶I的大腸桿菌單菌落，接入LB培養(yǎng)液，于37°C培養(yǎng)過(guò)夜；
[0013]2.取過(guò)夜培養(yǎng)物接入于LB培養(yǎng)液中，于37°C震蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)中期(0D_=1.5)；
[0014]3.在培養(yǎng)物中加入IPTG至0.5-1.2mmol/L，于37°C，誘導(dǎo)表達(dá)2-5h后，于4°C離心處理并收集含有重組人激肽釋放酶I的大腸桿菌菌體沉淀。
[0015]上述所述LB培養(yǎng)液中均含有氨芐青霉素80-120 μ g/mL。
[0016]本發(fā)明還提供了重組人激肽釋放酶I的包涵體純化方法，包括如下步驟:
[0017]1.將收集得到的上述含有誘導(dǎo)重組人激肽釋放酶I大腸桿菌菌體沉淀，用預(yù)冷的PBS重懸，并于4°C離心處理。
[0018]2.吸去上清，稱菌體沉淀重量，按濕重每克菌體加入裂解緩沖液Buffer A5_15mL。
[0019]3.按濕重每克菌體加入5-8 μ L的濃度為80mmol/L的PMSF，5-50 μ L的50mg/mL溶菌酶，重懸混勻后10-37°C保存。
[0020]4.超聲或高壓破碎菌體，并于4°C以離心處理，棄上清。
[0021]5.沉淀用洗滌緩沖液Buffer B重懸，并于4°C以離心處理，沉淀包涵體。
[0022]6.包涵體沉淀用變性緩沖液Buffer C溶解，25°C下攪拌10_60min。
[0023]7.充分重懸混勻后以4°C離心處理，棄沉淀，取上清，即得到重組人激肽釋放酶I變性溶液。
[0024]該純化方法優(yōu)選步驟如下:[0025]1.將收集得到的上述含有誘導(dǎo)重組人激肽釋放酶I大腸桿菌菌體沉淀，用預(yù)冷的PBS重懸,4°C以6000rpm離心15min ;重復(fù)一次。
[0026]2.吸去上清，稱菌體沉淀重量，按濕重每克菌體加入裂解緩沖液Buffer A12mL，使菌體重懸。
[0027]3.按濕重每克菌體加入7 u L濃度為80mmol/L的PMSF, 8 u L濃度為50mg/mL的溶菌酶，重懸混勻后25°C保存。
[0028]4.超聲破碎菌體，樣品置于冰上，超聲20min，每次3s間隔3s。超聲結(jié)束，4°C以13000rpm高速離心15min,棄上清。
[0029]5.沉淀用洗滌緩沖液Buffer B洗滌，4°C以13000rpm高速離心15min，收集包涵
體沉淀，重復(fù)一次。
[0030]6.包涵體沉淀用變性緩沖液Buffer C溶解，室溫下攪拌30min，至溶液澄清。
[0031]7.充分混勻后室溫下以13000rpm的轉(zhuǎn)速離心15min，棄沉淀，取上清，即得到重組人激肽釋放酶I變性溶液。
[0032]本發(fā)明還提供了優(yōu)化后的重組人激肽釋放酶I的包涵體復(fù)性純化方法，包括如下步驟:
[0033]取適量用變性緩沖液Buffer C溶解的上述所述的重組人激肽釋放酶I變性溶液，測(cè)定其濃度，然后用變性緩沖液Buffer C將蛋白濃度稀釋到0.lmg/mL，4°C稀釋復(fù)性。復(fù)性至16h時(shí)，將復(fù)性后重組蛋白溶液用0.22-0.45um濾膜過(guò)濾，即得到低濃度的重組人激肽釋放酶I復(fù)性溶液。用Buffer E為基礎(chǔ)緩沖液，將低濃度的重組人激肽釋放酶I復(fù)性溶液上親和色譜柱純化，用0.25-0.35M NaCUBuffer E緩沖液洗脫收集目的峰，得到重組hKLKl純品。并可進(jìn)一步超濾脫鹽、濃縮，于真空冷凍干燥機(jī)低溫真空干燥，即獲得重組人激肽釋放酶I凍干粉末。
[0034]本發(fā)明的經(jīng)優(yōu)化過(guò)的重組人激肽釋放酶I的基因序列，更適于大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的表達(dá)，所表達(dá)的重組人激肽釋放酶I高于人激肽釋放酶I天然基因序列在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的表達(dá)量，表達(dá)的hKLKl為無(wú)糖基化修飾KLKl蛋白，而且表達(dá)的hKLK活性更高。尤其是本發(fā)明的上述所述表達(dá)、復(fù)性、純化方法是經(jīng)過(guò)發(fā)明人反復(fù)多次實(shí)驗(yàn)摸索和驗(yàn)證得到的用于大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)重組人激肽釋放酶I的最為有效的方法，該方法的表達(dá)量高，且表達(dá)得到包涵體復(fù)性后活性更高。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0035]圖1表示重組人激肽釋放酶I密碼子優(yōu)化前后核苷酸序列比較
[0036]其中，奇數(shù)行(即上端基因序列)為人激肽釋放酶I天然基因核苷酸序列，即密碼子優(yōu)化前的序列；偶數(shù)行(即下端基因序列)為本發(fā)明的重組人激肽釋放酶I的基因核苷酸序列，即密碼子優(yōu)化后的序列。
[0037]圖2-a、圖2-b為重組人激肽釋放酶I密碼子優(yōu)化前后在大腸桿菌表達(dá)宿主中CAI指數(shù)。
[0038]其中，圖2-a表示人激肽釋放酶I天然基因核苷酸序列在大腸桿菌表達(dá)宿主中CAI指數(shù)經(jīng)過(guò)程序計(jì)算為0.70 ;圖2-b表示優(yōu)化后的本發(fā)明的重組人激肽釋放酶I密碼子在大腸桿菌表達(dá)宿主中CAI指數(shù)經(jīng)過(guò)程序計(jì)算為0.88。[0039]圖3_a、圖3_b為人激肽釋放酶I密碼子優(yōu)化前后在大腸桿菌表達(dá)宿主中最優(yōu)密碼子頻率分布區(qū)域圖。
[0040]其中，圖3_a表示人激肽釋放酶I天然基因核苷酸序列在大腸桿菌表達(dá)宿主中最優(yōu)密碼子頻率分布區(qū)域圖，從圖中可以看出:人激肽釋放酶I天然基因核苷酸序列的低利用率密碼子(利用率低于50%的密碼子)出現(xiàn)百分比為20% ;圖3-b表示優(yōu)化后的本發(fā)明的重組人激肽釋放酶I密碼子在大腸桿菌表達(dá)宿主中最優(yōu)密碼子頻率分布區(qū)域圖，優(yōu)化后的本發(fā)明的重組人激肽釋放酶I密碼子序列的低利用率密碼子出現(xiàn)百分比為O。
[0041]圖4-a、圖4-b為重組人激肽釋放酶I密碼子優(yōu)化前后在大腸桿菌表達(dá)宿主中平均GC堿基含量分布區(qū)域圖。
[0042]其中，圖4_a表示人激肽釋放酶I天然基因核苷酸序列在大腸桿菌表達(dá)宿主中平均GC堿基含量為:56.06% ;圖4-b表示優(yōu)化后的本發(fā)明的重組人激肽釋放酶I密碼子在大腸桿菌表達(dá)宿主中平均GC堿基含量為:53.36%。
[0043]圖5-a、圖5-b為重組人激肽釋放酶I密碼子優(yōu)化前后mRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)圖。
[0044]圖5-a人激肽釋放酶I天然基因mRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)圖，圖5_b為密碼子優(yōu)化后的本發(fā)明的人激肽釋放酶I的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)圖。
[0045]圖6-a為重組人激肽釋放酶I表達(dá)質(zhì)粒pET21b_hKLKl的構(gòu)建過(guò)程圖。圖6_b為重組人激肽釋放酶I表達(dá)質(zhì)粒pET28a-hKLKl的構(gòu)建過(guò)程圖。
[0046]圖7-a為重組人激肽釋放酶I基因PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖。
[0047]其中，泳道I為Nde I和Xho I酶切pET21b載體；泳道2為500bp DNA Ladder ；泳道3為兩端含有Nde I和Xho I酶切位點(diǎn)的重組人激肽釋放酶I基因PCR產(chǎn)物。
[0048]圖7_b為重組人激肽釋放酶I基因PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖。
[0049]其中，泳道I為Nde I和Xba I酶切pET28a載體；泳道2為500bp DNA Ladder ；泳道3為兩端含有Nde I和Xba I酶切位點(diǎn)的重組人激肽釋放酶I基因PCR產(chǎn)物。
[0050]圖8-a、圖8-b為重組人激肽釋放酶I的SDS-PAGE凝膠電泳圖。
[0051]圖8-a為重組人激肽釋放酶I的SDS-PAGE凝膠電泳圖。將pET21b_hKLKl轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21 (DE3)中，檢測(cè)重組人激肽釋放酶I的表達(dá)情況。
[0052]其中，泳道I為(10_230kDa)寬范圍預(yù)染蛋白上樣Marker ;泳道2為未加入IPTG誘導(dǎo)的重組人激肽釋放酶I大腸桿菌裂解液；泳道3為加入IPTG誘導(dǎo)的重組人激肽釋放酶I大腸桿菌裂解液。
[0053]圖8-b為重組人激肽釋放酶I的SDS-PAGE凝膠電泳圖。將pET28a_hKLKl轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21 (DE3)中，檢測(cè)重組人激肽釋放酶I的表達(dá)情況。
[0054]其中，泳道I (10_230KDa)寬范圍預(yù)染蛋白上樣Marker，泳道2為加入IPTG誘導(dǎo)的重組人激肽釋放酶I大腸桿菌裂解液:泳道3為未加入IPTG誘導(dǎo)的重組人激肽釋放酶I大腸桿菌裂解液。
[0055]圖9為重組人激肽釋放酶I的免疫印跡圖。
[0056]其中，泳道l(10_230KDa)寬范圍預(yù)染蛋白上樣Marker，泳道2為:未加入IPTG誘導(dǎo)的重組人激肽釋放酶I大腸桿菌裂解液，泳道3未加入IPTG誘導(dǎo)的重組人激肽釋放酶I大腸桿菌裂解液。
[0057]圖10重組人激肽釋放酶I高效表達(dá)誘導(dǎo)條件優(yōu)化的SDS-PAGE凝膠電泳圖。[0058]其中，泳道I為(10-230kDa)寬范圍預(yù)染蛋白上樣Marker ;泳道2為0.5mmol/LIPTG誘導(dǎo)2h的含重組人激肽釋放酶I大腸桿菌裂解液；泳道3為0.5mmol/L IPTG誘導(dǎo)3h的含重組人激肽釋放酶I大腸桿菌裂解液；泳道4為0.5mmol/L IPTG誘導(dǎo)4h的含重組人激肽釋放酶I大腸桿菌裂解液；泳道5為0.5mmol/L IPTG誘導(dǎo)5h的含重組人激肽釋放酶I大腸桿菌裂解液；泳道6為0.8mmol/L IPTG誘導(dǎo)2h的含重組人激肽釋放酶I大腸桿菌裂解液；泳道7為0.8mmol/L IPTG誘導(dǎo)3h的含重組人激肽釋放酶I大腸桿菌裂解液；泳道8為0.8mmol/L IPTG誘導(dǎo)4h的含重組人激肽釋放酶I大腸桿菌裂解液；泳道9為0.8mmol/L IPTG誘導(dǎo)5h的含重組人激肽釋放酶I大腸桿菌裂解液；泳道10為1.2mmol/L IPTG誘導(dǎo)2h的含重組人激肽釋放酶I大腸桿菌裂解液；泳道11為1.2mmol/L IPTG誘導(dǎo)3h的含重組人激肽釋放酶I大腸桿菌裂解液；泳道12為1.2mmol/L IPTG誘導(dǎo)4h的含重組人激肽釋放酶I大腸桿菌裂解液；泳道13為1.2mmol/L IPTG誘導(dǎo)5h的含重組人激肽釋放酶I大腸桿菌裂解液。
[0059]圖11為復(fù)性后的重組人激肽釋放酶I包涵體SDS-PAGE電泳圖。
[0060]其中，泳道I為(10_230KDa)寬范圍的預(yù)染的蛋白上樣Marker ;泳道2為用BufferA超聲破碎后的重組人激肽釋放酶I包涵體沉淀；泳道3為Buffer B第一次清洗后重組人激肽釋放酶I包涵體沉淀；泳道4為Buffer B第二次清洗后重組人激肽釋放酶I包涵體沉淀；泳道5為Buffer C變性后的重組人激肽釋放酶I溶液；泳道6為稀釋法復(fù)性后的重組人激肽釋放酶I ;泳道7為復(fù)性后重組蛋白溶液過(guò)0.22 μ m濾膜，即得到重組人激肽釋放酶I復(fù)性溶液；泳道8為hKLKl復(fù)性蛋白經(jīng)親和色譜柱純化得到的重組人激肽釋放酶I蛋白樣品。
[0061]圖12為重組人激肽酶I復(fù)性蛋白親和色譜柱純化樣品UPLC檢測(cè)效果圖。檢測(cè)結(jié)果顯示重組人激肽釋放酶I純化后的蛋白純度95%以上。
[0062]其中，在檢測(cè)時(shí)間為10.5min時(shí)出現(xiàn)的單一蛋白洗脫峰為重組人激肽釋放酶I純
化蛋白樣品。
[0063]圖13為重組人激肽酶I蛋白樣品N端氨基酸檢測(cè)效果圖。
[0064]其中，圖13-a為重組人激肽釋放酶I純化蛋白樣品N端的第一個(gè)氨基酸為蛋氨酸(Met)，圖13-b為第二個(gè)氨基酸為異亮氨酸(lie)，圖13_c為第三個(gè)氨基酸為纈氨酸(Val),圖13-d為第四個(gè)氨基酸為甘氨酸(Gly)，圖13_e為第五個(gè)氨基酸為甘氨酸(Gly)。
[0065]圖14為重組人激肽酶I蛋白樣品質(zhì)譜高分辨分子量檢測(cè)效果圖。
[0066]其中，圖14為重組人激肽酶I蛋白樣品的質(zhì)譜高分辨分子量檢測(cè)峰。質(zhì)譜圖顯示重組人激肽酶I蛋白為單一主峰，分子量為26526Da。
【具體實(shí)施方式】
[0067]下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明，應(yīng)理解，引用實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。
[0068]實(shí)施例1重組人激肽釋放酶I基因優(yōu)化設(shè)計(jì)
[0069]1.密碼子優(yōu)化
[0070]發(fā)明人根據(jù)GenBank已公開的人激肽釋放酶I (Homo sapiens kallikreinl)的cDNA序列(GenBank登錄號(hào):NM_002257.3)和GenBank已公開的人激妝釋放酶I (Homosapiens kallikrein)的氨基酸序列(GenBank登錄號(hào):AAA59455.1)，由于hKLKl存在氨基酸多態(tài)性，結(jié)合已公開的中國(guó)人胰組織激肽釋放酶基因(戴勇，彭武建，李體遠(yuǎn)，等.人胰激肽釋放酶基因的克隆及融合蛋白的表達(dá)[J].中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志，2005，15 (16):2405~2409)，去除天然表達(dá)hKLKl的信號(hào)肽和前肽氨基酸序列，確定本發(fā)明基因優(yōu)化前的hKLKl基因序列，對(duì)該基因進(jìn)行密碼子優(yōu)化后得到本發(fā)明的重組人激肽釋放酶I基因，如SEQ IDNO:1所示。
[0071]下面是對(duì)重組人激肽釋放酶I進(jìn)行密碼子優(yōu)化，優(yōu)化前后各參數(shù)對(duì)比如下:
[0072]1.密碼子適應(yīng)指數(shù)(Codon Adaptation Index, CAI)
[0073]由圖2-a可知，密碼子沒(méi)有優(yōu)化前，人激肽釋放酶I天然基因在大腸桿菌中密碼子適應(yīng)指數(shù)(CAI)為0.70。由圖2-b可知，通過(guò)密碼子優(yōu)化后，使得本發(fā)明的重組人激肽釋放酶I基因在大腸桿菌中CAI指數(shù)為0.88。通常CAI=I時(shí)被認(rèn)為目的基因在表達(dá)系統(tǒng)中是最理想的高效表達(dá)狀態(tài)，CAI指數(shù)越低表明該基因在該宿主中表達(dá)水平越差，因此可以看出密碼子優(yōu)化后得到的hKLKl基因序列可以提高h(yuǎn)KLKl基因在大腸桿菌中的表達(dá)水平。
[0074]2.最優(yōu)密碼子使用頻率(Frequency of Optimal Codons, FOP)
[0075]由圖3_a可知，基于大腸桿菌表達(dá)載體，密碼子沒(méi)有優(yōu)化前，人激肽釋放酶I天然基因序列的低利用率密碼子出現(xiàn)百分比為20%。這條未進(jìn)行優(yōu)化的基因含有串聯(lián)稀有密碼子，這些密碼子可能降低翻譯效率，甚至能夠解散翻譯裝配物，導(dǎo)致目的基因無(wú)表達(dá)或表達(dá)量不高。由圖3-b可知，通過(guò)密碼子優(yōu)化后，本發(fā)明的重組人激肽釋放酶I基因在大腸桿菌系統(tǒng)中出現(xiàn)低利用率密碼子的頻率為O。
[0076]3.GC 喊基含量(GC curve)
[0077]GC含量理想分布區(qū)域?yàn)?0%_70%，在這個(gè)區(qū)域外的出現(xiàn)任何峰都會(huì)不同程度地影響轉(zhuǎn)錄和翻譯效率。由圖4-a、圖4-b的人激肽釋放酶I基因的GC堿基平均含量分布區(qū)域圖對(duì)比可知，由圖4-a中顯示人`激肽釋放酶I天然基因中在優(yōu)化前GC堿基平均含量為56.06%,由圖4-b中顯示出優(yōu)化后的序列消除了 GC含量在30%-70%區(qū)域外所有堿基，最終得到優(yōu)化后重組人激肽釋放酶I的GC堿基平均含量為53.36%。
[0078]4.優(yōu)化前后順式作用元件情況如下:
[0079]
【權(quán)利要求】
1.一種人激肽釋放酶I的編碼基因，其特征在于，其堿基序列如SEQ ID N0:2所示。
2.一種含有如權(quán)利要求1所述的編碼基因的原核表達(dá)質(zhì)粒。
3.如權(quán)利要求2所述的原核表達(dá)質(zhì)粒，其特征在于，所述質(zhì)粒為pET21b或pET28a。
4.一種含有如權(quán)利要求1所述的編碼基因的大腸桿菌菌株。
5.如權(quán)利要求4所述的大腸桿菌菌株，其特征在于，所述菌株為大腸桿菌BL21(DE3)菌株。
6.一種重組人激肽釋放酶I在大腸桿菌表達(dá)方法，包括如下步驟: (1)將如權(quán)利要求5所述的大腸桿菌菌落接入LB培養(yǎng)液,于37°C培養(yǎng)過(guò)夜； (2)取過(guò)夜培養(yǎng)物接入于LB培養(yǎng)液中，于37°C震蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)中期(0D_=1.5)； (3)在培養(yǎng)物中加入IPTG至0.5-1.2mmol/L，于37°C，誘導(dǎo)表達(dá)2_5h后，于4°C離心處理并收集含有重組人激肽釋放酶I的大腸桿菌菌體沉淀。
7.如權(quán)利要求6所述的LB培養(yǎng)液中含有氨芐青霉素80-120u g/mL。
8.—種重組人激肽釋放酶I在大腸桿菌表達(dá)后的純化與復(fù)性方法，包括如下步驟: (1)將含有誘導(dǎo)重 組人激肽釋放酶I的大腸桿菌菌體沉淀，用預(yù)冷的PBS重懸，并于4°C離心處理； (2)吸去上清，按濕重每克菌體加入裂解緩沖液BufferA5_15mL ； (3)按濕重每克菌體加入5-8ii L的80mmol/L PMSF, 5-50 y L的50mg/mL溶菌酶，重懸混勻后10-37°C保存； (4)超聲或高壓破碎菌體，并于4°C離心處理，棄上清； (5)沉淀用洗滌緩沖液BufferB重懸，并于4°C以離心處理，沉淀包涵體； (6)包涵體沉淀用變性緩沖液BufferC溶解，25°C下攪拌10_60min ； (7)充分重懸混勻后以4°C離心處理，棄沉淀，取上清，即得到重組人激肽釋放酶I變性溶液； (8)繼續(xù)用變性緩沖液BufferC將上述所述的重組人激肽釋放酶I變性溶液溶解并稀釋到蛋白濃度0.lmg/mL，4°C稀釋復(fù)性，復(fù)性至16h時(shí)，將復(fù)性后重組蛋白溶液用濾膜過(guò)濾，即得到低濃度的重組人激肽釋放酶I復(fù)性溶液； (9)用BufferE為基礎(chǔ)緩沖液，將所述低濃度的重組人激肽釋放酶I復(fù)性溶液上親和色譜柱純化，用0.25-0.35M NaCUBuffer E緩沖液洗脫收集目的峰，得到重組hKLKl純品。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，步驟(1)中所述的含有誘導(dǎo)重組人激肽釋放酶I的大腸桿菌菌體沉淀為如權(quán)利要求6所述的大腸桿菌菌體沉淀。
10.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于: 所述 Buffer A 配比為=Tris-HCl (含量為 35mmol/L)，NaCl (含量為 0.15mol/L)，EDTA(含量為lmmol/L)，以及PMSF (含量為0.lmmol/L)，溶液基質(zhì)為蒸餾水，pH為7.4 ; 所述 Buffer B 配比為=Tris-HCl (含量為 35mmol/L)，NaCl (含量為 0.15mol/L)，EDTA(含量為lmmol/L)，Triton X-100 (含量為1% (v/v)),以及尿素(含量為1.5mol/L)，溶液基質(zhì)為蒸懼水，pH為7.4 ; 所述 Buffer C 配比為=Tris-HCl (含量為 45mmol/L)，NaCl (含量為 0.20mol/L)，EDTA(含量為lmmol/L)，PMSF (含量為0.lmmol/L)，尿素(含量為8mol/L)，以及DTT (含量為lOmmol/L)，溶液基質(zhì)為蒸餾水，pH為7.8 ;所述 Buffer D 配比為:Tris_HCl(含量為 35mmol/L)，EDTA(含量為 lmmol/L)，GSH:GSSG(摩爾比為5:1)，L-精氨酸(含量為0.5mol/L)，甘油(含量為25% (v/v)), NaCl (含量為·0.30mol/L)，溶液基質(zhì)為蒸餾水，pH為7.8 ;所述Buffer E配比為:Tris_·HCl (含量為20mmol/L)，溶液基質(zhì)為蒸餾水，pH為7.3。
【文檔編號(hào)】C12N1/21GK103710367SQ201310718972
【公開日】2014年4月9日 申請(qǐng)日期:2013年12月23日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月23日
【發(fā)明者】馬永, 章成昌, 王安良, 周嬌嬌, 徐春林, 陳晨, 王耀方 申請(qǐng)人:江蘇眾紅生物工程創(chuàng)藥研究院有限公司, 常州京森生物醫(yī)藥研究所有限公司