專利名稱：：穩(wěn)定的激肽釋放酶-1注射液的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及含有蛋白酶的溶液，更具體地涉及穩(wěn)定的激肽釋放酶-1注射液。
背景技術(shù)：
：激肽釋放酶-l(Kallikrein-l)是一種絲氨酸蛋白酶，在人或動(dòng)物體內(nèi)主要作用于激肽原，使之水解釋放出激肽，通過激肽發(fā)揮擴(kuò)張毛細(xì)血管、松弛血管平滑肌、改善微循環(huán)、增加血流量、抗凝、溶血栓、降低血液粘度和血壓，以及具有治療不育癥等作用。其中更多相關(guān)的背景信息可另參考本專利申請(qǐng)人已經(jīng)提交的中國(guó)專利申請(qǐng)2006100277541和200710038911.3PCT/CN2007/070800。激肽釋放酶-l在溶液狀態(tài)下極不穩(wěn)定，因此通常需要將其凍干保存，該凍干制劑在配制成溶液，也需要盡快使用，以避免活性喪失。例如，在中國(guó)專利ZL200410096060.4中公開了一種水溶液，其中將甘露醇、水解明膠(或右旋糖酐)和檸檬酸鈉組合，用以溶解從人尿中提取的人尿激肽原酶(人激肽釋放酶-l)凍干粉，以達(dá)到保持主藥活性的作用。這種采用凍干粉針劑，并再配以由一定的輔料組成的水溶液來(lái)溶解的制劑方式，不僅增加了生產(chǎn)成本，而且臨床使用也不方便，此外，溶解后保持主藥活性的時(shí)間也非常短暫。因此，本領(lǐng)域迫切需要提供能保持激肽釋放酶-1長(zhǎng)期穩(wěn)定性的液體制劑。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明旨在提供穩(wěn)定的含有激肽釋放酶-1的注射液。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供上述穩(wěn)定的含有激肽釋放酶-1的注射液的制備方法。在本發(fā)明的第一方面，提供了一種穩(wěn)定的激肽釋放酶-l注射液，所述的注射液中含有(1)激肽釋放酶-10.05-40.00AU/ml;(2)磷酸鹽緩沖液10-50mmol/L，p服.0-8.0;(3)氯化鈉0.01-0.2mol/L;和(4)蛋白酶保護(hù)劑0.01-20%(w/v)(以注射液的總體積為基準(zhǔn))。在另一優(yōu)選例中，所述的蛋白酶保護(hù)劑為0.5—10%;優(yōu)選1一5%。在另一優(yōu)選例中，所述的蛋白酶保護(hù)劑選自下述的一種或多種甘露醇、水解明膠、右旋糖酐、葡萄糖、蔗糖、海藻糖、聚乙烯吡洛烷酮、甘氨酸、聚乙二醇；所述的蛋白酶保護(hù)劑優(yōu)選自下述的一種或多種甘露醇、水解明膠、右旋糖酐、甘氨酸。在另一優(yōu)選例中，以注射液的總體積為基準(zhǔn)，其中所述的甘露醇0.5-10%(w/v)，水解明膠O.1-10%(w/v)，右旋糖酐O.5-10%(w/v)，甘氨酸O.05-2%(w/v);優(yōu)選所述的甘露醇l-4%(w/v)，水解明膠1-3%(w/v)，右旋糖酐l-4%(w/v)，甘氨酸0.5-l%(w/v)。在另一優(yōu)選例中，激肽釋放酶-1是天然提取或重組的；優(yōu)選重組人激肽釋放酶-l。在另一優(yōu)選例中，其中所述的磷酸鹽緩沖液是磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖對(duì)；所述的氯化鈉為0.卜0.2mol/L;所述的右旋糖酐選自右旋糖酐-20、右旋糖酐-40或右旋糖酐-70。在另一優(yōu)選例中，以注射液的總體積為基準(zhǔn)，所述的溶液中還含有0.005-0.02。/。(w/v)防腐劑。在本發(fā)明的第二方面，提供了一種如上所述的注射液的制備方法，所述的方法包括步驟(a)將磷酸鹽、氯化鈉、蛋白酶保護(hù)劑和注射用水混合；(b)用磷酸或Na0H調(diào)節(jié)p朋.0—8.0;和(c)加入激肽釋放酶-1后注射用水定容，得到如上所述的穩(wěn)定的激肽釋放酶-1注射液。在另一優(yōu)選例中，所述的磷酸鹽緩沖液是磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖對(duì)。在另一優(yōu)選例中，在步驟(a)中還可以加入防腐劑，使步驟(c)中所得到的注射液中，以注射液的總體積為基準(zhǔn)含有0.005-0.02%(w/v)防腐劑。據(jù)此，本發(fā)明提供了能保持激肽釋放酶-1長(zhǎng)期穩(wěn)定性的液體制劑。具體實(shí)施例方式發(fā)明人發(fā)現(xiàn)在含有激肽釋放酶-1的水溶液中加入一定種類和一定量的蛋白酶保護(hù)劑，可以長(zhǎng)時(shí)間地保持激肽釋放酶-l在水溶液中的活性。具體地，發(fā)明人向處于磷酸鹽緩沖體系(pH6.0-8.0)中的激肽釋放酶-l溶液中加入甘露醇、水解明膠、右旋糖酐、葡萄糖、蔗糖、海藻糖、聚乙烯吡洛烷酮、甘氨酸、和聚乙二醇中的一種或多種作為蛋白酶保護(hù)劑，并適當(dāng)再添加氯化鈉用以調(diào)節(jié)水溶液的滲透壓，就制成能長(zhǎng)期保持活性(穩(wěn)定性)，可供臨床中方便使用的激肽釋放酶-1液體制劑。如本文所用，"激肽釋放酶-l"和"激肽原酶"可以互換使用，此外，目前文獻(xiàn)中還有在這兩個(gè)詞前冠以來(lái)源的組織器官或代謝產(chǎn)物名稱，如'胰激肽原酶'、'胰激肽釋放酶'、'尿激肽原酶'等，均與本專利中所描述的，按國(guó)際上建議的'激肽釋放酶-r這一名稱所指的是同一種成分。它是一種絲氨酸蛋白酶，可作用于激肽原，使之水解釋放出激肽，通過激肽發(fā)揮擴(kuò)張毛細(xì)血管、松弛血管平滑肌、改善微循環(huán)、增加血流量、抗凝、溶血栓、降低血液粘度和血壓等作用。英文名為Kallikrein與Kininogermse、Kallidinogenase、Kininogenin所描述的都是同一類成分，不過目前多用Kallikrein—詞。已經(jīng)從人和動(dòng)物體的不同組織、器官或尿液中獲得了許多Kallikrein類成分，其中將含量最高，發(fā)現(xiàn)也最早的命名為Kallikrein-1(激肽釋放酶-1)。該成分在人或哺乳動(dòng)物的胰腺和腎臟中含量最高，其代謝后又通過腎臟，隨尿排出體外。因此，從人或動(dòng)物尿中分離出來(lái)的早年所稱的尿激肽原酶(或尿激肽釋放酶)實(shí)際就是新分類中的激肽釋放酶-l(Kallikrein-1)。不同來(lái)源的激肽釋放酶-1的分子量差別很大。例如，從人尿中或胰腺中分離出的人激肽釋放酶-1，其相對(duì)分子量為33800。而通過基因方法獲得的重組人激肽釋放酶-1的分子量從26000-35000不等，這主要取決于采用的表達(dá)系統(tǒng)(E.cli、酵母、昆蟲細(xì)胞、CHO細(xì)胞等)以及表達(dá)的方式(細(xì)胞內(nèi)或分泌表達(dá))等不同，蛋白糖基化的修飾方式、修飾程度不同以及純化方式對(duì)糖鏈影響等而引起的差別。例如，E.coli或酵母細(xì)胞內(nèi)表達(dá)出的激肽釋放酶-1其分子量約26000左右，而CHO細(xì)胞表達(dá)的激肽釋放酶-l可達(dá)到35000左右。本專利中的激肽釋放酶-1可以是天然提取或重組的，可以是尿激肽原酶或胰激肽原酶，較佳地是重組人激肽釋放酶-1。在本發(fā)明中，"重組激肽釋放酶-l"可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法獲得，一種優(yōu)選的方法可以如本發(fā)明實(shí)施例1中所提供的，也可以參考中國(guó)專利2006100277541以及200710038911.3、PCT/CN2007/070800中的相關(guān)內(nèi)容。如本文所用，"蛋白酶保護(hù)劑"、"保護(hù)劑"和"穩(wěn)定劑"可以互換使用，都是指可以保持激肽釋放酶-1活性的物質(zhì)，選自下述的一種或多種甘露醇、水解明膠、右旋糖酐、葡萄糖、蔗糖、海藻糖、聚乙烯吡洛烷酮、甘氨酸、聚乙二醇；較佳地選自甘露醇、水解明膠、右旋糖酐、和甘氨酸中的一種或多種。在本發(fā)明中，含有激肽釋放酶-1的水溶液在4-37'C放置，以激肽釋放酶-1和溶液剛開始混合為時(shí)間的起始點(diǎn)(O時(shí))，以0時(shí)每毫升(ml)水溶液中激肽釋放酶-l的活性單位(AU)為起始活性值，如果放置0-300天，每ml水溶液中激肽釋放酶-1的AU是起始活性值的80-120%，就是本發(fā)明所指的穩(wěn)定，較佳地是90-110%，更佳地為95-105%。本發(fā)明提供的含有激肽釋放酶-1的穩(wěn)定的注射液中選用磷酸鹽緩沖體系，pH6.0-8.0，優(yōu)選pH7.0;所述的磷酸鹽緩沖體系是磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖體系。本發(fā)明使用氯化鈉用以調(diào)節(jié)水溶液的滲透壓，氯化鈉的濃度為0.Olmol/L-0.2mol/L，優(yōu)選0.lmol/L-0.2mol/L，更優(yōu)選0.15mol/L。蛋白質(zhì)(酶)類藥物的保護(hù)劑一直是生物制品類新藥開發(fā)的研究重點(diǎn)，也是蛋白質(zhì)類藥物制劑生產(chǎn)中必須要解決的關(guān)鍵問題之一。本發(fā)明中蛋白酶保護(hù)劑可以為水解明膠、甘露醇、右旋糖酐、葡萄糖、蔗糖、海藻糖、聚乙烯烷酮、甘氨酸以及聚乙二醇等數(shù)種物質(zhì)中的一種或幾種組合，優(yōu)選水解明膠、甘露醇、右旋糖酐、甘氨酸及其組合物；右旋糖酐可以為右旋糖酐-20、右旋糖酐-40或右旋糖酐-70。本發(fā)明中蛋白酶保護(hù)劑的濃度是以所提供的注射液的總體積為基準(zhǔn)，為0.01%-20%;較佳地為O.5—10%;更佳地為1—5%。本發(fā)明中具體保護(hù)劑用量(w/v)為水解明膠的濃度為0.1%-10%、甘露醇的濃度為0.5%_10%、右旋糖酐的濃度為0.5%-10%、甘氨酸的濃度為0.05%-2%;優(yōu)選水解明膠濃度為1%-3%、甘露醇濃度為1%-4%、右旋糖酐濃度為1%-4%、甘氨酸濃度為0.5°/。-1%;蛋白酶保護(hù)劑可以選用上述任意一種或者它們的組合物。在另一優(yōu)選例中，本發(fā)明提供的含有激肽釋放酶-1的穩(wěn)定的注射液可以使用下述方法制備獲得稱取磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、氯化鈉、蛋白酶保護(hù)劑，加入適量的注射用水充分溶解后，用磷酸或NaOH調(diào)節(jié)至適當(dāng)?shù)膒H值，再量取適量的激肽釋放酶-1，加入注射用水進(jìn)行定容，過濾除菌，灌裝，壓塞、軋蓋即可。本發(fā)明提供的含有激肽釋放酶-1的穩(wěn)定的注射液不僅可以保證重組或自人的組織、體液或代謝物中生物提取的人激肽釋放酶-1在水溶液中保持長(zhǎng)期穩(wěn)定性，而且也對(duì)從動(dòng)物胰腺中提取的動(dòng)物的激肽釋放酶-l(或動(dòng)物胰激肽原酶)活性保持有很好的效果。本發(fā)明提到的上述特征，或?qū)嵤├岬降奶卣骺梢匀我饨M合。本案說明書所揭示的所有特征可與任何組合物形式并用，說明書中所揭示的各個(gè)特征，可以任何可提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特別說明，所揭示的特征僅為均等或相似特征的一般性例子。本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)在于1、本發(fā)明提供的含有激肽釋放酶-1的穩(wěn)定的注射液中蛋白的穩(wěn)定性好；2、本發(fā)明提供的注射液制作簡(jiǎn)便，成本低；3、本發(fā)明提供的穩(wěn)定的含有激肽釋放酶-1的注射液中不含人血白蛋白作為保護(hù)劑，避免了增加引入外源性病毒的潛在危險(xiǎn)。下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則所有的百分比和份數(shù)按重量計(jì)。除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學(xué)用語(yǔ)與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明方法中。文中所述的較佳實(shí)施方法與材料僅作示范之用。本發(fā)明中激肽釋放酶-1活性和比活性的檢測(cè)方法和計(jì)算公式如下激肽釋放酶-1能優(yōu)先酶切生色底物S-2266(Val-Leu-Arg-pNA，Chromogenix)，釋放出對(duì)405nm波長(zhǎng)的光波有最大吸收值的-pNA。所以，用生色底物S-2266，采用比色法可以測(cè)定激肽釋放酶-1的活性。一個(gè)激肽釋放酶-1活性單位(AU)是指在37°C，Tris-HC1pH8.0緩沖體系中，1分鐘內(nèi)能水解底物S-2266釋放1umol游離pNA的酶量。測(cè)定的過程①.估計(jì)待測(cè)定樣品活性，用稀釋緩沖液(20mmol/LPBS，pH7.0)準(zhǔn)確地將待測(cè)定樣品作一系列稀釋，如10X、IOOX、200X等。②.在潔凈、干烤過的試管中加入400uL反應(yīng)緩沖液(0.2mol/lTris-HC1,pH8.2)，再加入20uL稀釋后的待測(cè)定樣品溶液，對(duì)照樣中則加入20uL稀釋緩沖液，混勻后，37t:水浴保溫5分鐘，確保樣品反應(yīng)時(shí)溫度一致。③.分別向各待測(cè)樣品中分別加入40uL底物S-2266溶液(2mmol/L)，混勻，精確計(jì)時(shí)，并于37'C(水浴)之中反應(yīng)15min。.反應(yīng)時(shí)間一到，即向各反應(yīng)樣品中加入40uL反應(yīng)終止液(50%乙酸溶液)終止反應(yīng)，選用405nm波長(zhǎng)，以對(duì)照樣將分光光度計(jì)調(diào)零后測(cè)定各待測(cè)管的A4。5值，A4。s值應(yīng)在0.1-0.2，不在此范圍時(shí)，則增加或減少稀釋倍數(shù)，重新游離型pNA的摩爾消光系數(shù)e=9，600Lmol—1cm—'，每毫升待測(cè)定樣品中激肽釋放酶-1的活性單位，則可按下面公式計(jì)算活性(AU/mL)二0.1736XA4。5X待測(cè)樣的稀釋倍數(shù)該方法測(cè)定激肽釋放酶-1溶液活性濃度的最佳線性范圍是0.017-0.034AU/mL，也就是說只要將待測(cè)定樣品能稀釋到該范圍內(nèi)就能被準(zhǔn)確測(cè)定。以下實(shí)施例配方中各成分來(lái)源如下磷酸氫二鈉購(gòu)自湖南九典制藥有限公司磷酸二氫鈉購(gòu)自湖南九典制藥有限公司氯化鈉購(gòu)自江蘇省勤奮藥業(yè)有限公司甘露醇購(gòu)自廣西南林化學(xué)制藥公司右旋糖酐-40:購(gòu)自上海華茂藥業(yè)有限公司水解明膠購(gòu)自北京華達(dá)杰瑞生物技術(shù)有限公司甘氨酸購(gòu)自生工生物工程(上海)有限公司尼泊金乙脂購(gòu)自中國(guó)醫(yī)藥(集團(tuán))上?；瘜W(xué)試劑公司尼泊金丙脂購(gòu)自中國(guó)醫(yī)藥(集團(tuán))上?；瘜W(xué)試劑公司實(shí)施例1重組人激肽釋放酶-1的制備(以在甲醇酵母系統(tǒng)中分泌表達(dá)人激肽釋放酶-1為例，采用其他表達(dá)系統(tǒng)、表達(dá)方式或表達(dá)基因，其基本操作相似。)將PCR獲得的人激肽釋放酶-1基因(rhKl)插入到pPICZaA(Invitrogen)公司商品化載體之中，構(gòu)造分泌型表達(dá)載體pPICZa-hKl，按分子生物學(xué)基本操作進(jìn)行轉(zhuǎn)化篩選，獲得能分泌表達(dá)人激肽釋放酶-1的rhKl/X33工程菌種。1.rhKl/X33工程菌株在30L罐中發(fā)酵條件確定將種子液按l:15接種量接入裝有15LBSM培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，開始菌體增殖培養(yǎng)階段生長(zhǎng)溫度30'C，起始轉(zhuǎn)速300rpm培養(yǎng)，通氣量15L/min，用氨水將pH值調(diào)為5.0，通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速、通氣量、罐壓維持溶氧值不低于209L約20小時(shí)左右，DO迅速上升，菌體濕重約120g/L時(shí)表明此階段結(jié)束。甘油補(bǔ)料的菌體增殖階段以150-350mL/小時(shí)的速率補(bǔ)加50%的甘油溶液，補(bǔ)加約4小時(shí)至菌體濕重約達(dá)200g/L;停止補(bǔ)料，DO值上升，維持此狀態(tài)(饑餓)半小時(shí)；再用氨水將PH值調(diào)為6.0，準(zhǔn)備誘導(dǎo)。誘導(dǎo)表達(dá)階段緩慢增加甲醇的加入量，待其適應(yīng)后，以120mL/小時(shí)的速率補(bǔ)加，同時(shí)維持DO值不低于20%，溫度保持在3(TC,誘導(dǎo)約64小時(shí)，停止發(fā)酵，離心收獲發(fā)酵上清液。2.純化工藝研究重組人激肽釋放酶-1的純化制備過程共分四步第一步疏水層析向發(fā)酵上清液中加入等體積的40mmol/LPB+2mol/LNa2S04，pH7.0溶液，混勻，調(diào)節(jié)pH至7.0。0.22um膜過濾，上已用20隨ol/LPB+1.0mol/LNa2S04，pH7.0緩沖液平衡過的PhenylS印harose6FF(HS)介質(zhì)，依次用洗脫緩沖液20mmol/LPB+0.58mol/LNa2S04，pH7.0;20mmol/LPB+0.23mol/LNa2S04，pH7.0和注射用水分段洗脫，收集第二個(gè)洗脫緩沖液的洗脫峰。第二步Ni"螯合層析將第一步收集的洗脫峰上經(jīng)過20mmol/LPB+0.5mol/LNaCl，pH7.0緩沖液平衡過的Ni2+-ChelatingS印haroseFF介質(zhì)，用20mmol/LPB，pH7,0緩沖液洗脫并收集洗脫峰。第三步C,螯合層析將第二步收集的洗脫峰上經(jīng)20mmol/LPB+0.15mol/LNaCl，pH7.0緩沖液平衡過的Cu2+—ChelatingS印haroseFF介質(zhì)，分別用20關(guān)ol/LPB，pH7.0和20mmol/LPB+10mmol/L咪唑，pH7.0洗脫緩沖液進(jìn)行洗脫，收集第二個(gè)洗脫緩沖液的洗脫峰。第四步陰離子層析將第三步收集的洗脫峰上QS印haroseFF介質(zhì)，分別用20mmol/LPB+0.15mol/LNaCl,pH7.0禾卩20mtnol/LPB+0.25mol/LNaCl，pH7.0洗脫緩沖液進(jìn)行洗脫，收集第二個(gè)洗脫緩沖液的洗脫峰，經(jīng)0.22濾膜無(wú)菌過濾，即得到高純度的可供制劑穩(wěn)定性研究的重組人激肽釋放酶-1原液。實(shí)施例2重組人激肽釋放酶-1注射液I的制備處方重組人激肽釋放酶-1(甲醇酵母)磷酸氫二鈉磷酸二氫鈉一水合物氯化鈉甘露醇右旋糖酐-40200AU(活性終濃度為0.2AU/mL)1.732g1.077g8.775g10g10g制備工藝按上述處方中的量，稱取磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、氯化鈉、甘露醇、右旋糖酐-40，加入適量的注射用水充分溶解輔料后，用磷酸或NaOH調(diào)節(jié)pH值至7.0，再量取適量的重組人激肽釋放酶-1加入其中，混勻，用注射水定容至lOOOml，過濾除菌，灌裝，壓塞、軋蓋即可，得到重組人激肽釋放酶-1注射液I。本發(fā)明在采用45。C加速試驗(yàn)時(shí)發(fā)現(xiàn)在pH7.0，含0.15mol/L氯化鈉的20mmol/L的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖體系中，不含任何蛋白酶保護(hù)劑條件下配制0.2AU/ml規(guī)格的重組人激肽釋放酶-1溶液，在45。C條件放置2周后重組人激肽釋放酶-1活性會(huì)下降50%左右，而同時(shí)加入1%甘露醇與1%右旋糖酐-40組合用作重組人激肽釋放酶-l保護(hù)劑的溶液，其活性基本穩(wěn)定。見表l。表l45'C條件下，重組人激肽釋放酶-l注射液I活性的考察<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>試驗(yàn)顯示，1%甘露醇與1%右旋糖酐-40組合應(yīng)用對(duì)重組人激肽釋放酶-1活性具有良好的保護(hù)作用。根據(jù)上述(實(shí)施例2)的配方和制備方法，分別獲得三個(gè)批號(hào)的人激肽釋放酶-1注射液(20070601，20070602，20070603)，對(duì)它們進(jìn)行穩(wěn)定性考察，見表2和3。表2人激肽釋放酶-1注射液外觀考察<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>表3人激肽釋放酶-1注射液活性考察<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>結(jié)果表明人激肽釋放酶-1注射液在4'C、25'C、37'C條件下放置九個(gè)月后溶液澄清無(wú)異常，活性穩(wěn)定。實(shí)施例3重組人激肽釋放酶-1注射液II的制備處方重組人激肽釋放酶-1(CHO細(xì)胞)150AU(活性終濃度為0.15AL)/mL)磷酸氫二鈉1.732g磷酸二氫鈉一水合物1.077g氯化鈉8.775g水解明膠10g制備工藝稱取磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、氯化鈉、水解明膠，加入適量的注射用水充分溶解輔料后，用磷酸或NaOH調(diào)節(jié)pH值至7.0，再量取適量的重組人激肽釋放酶-1加入其中，充分混勻，用注射水定容至1000ml，過濾除菌，灌裝，壓塞、軋蓋即可，得到人激肽釋放酶-i注射液n。該處方選用了pH7.0，含0.15mol/L氯化鈉的20mmol/L的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖體系，1%水解明膠作蛋白酶保護(hù)劑。對(duì)該重組人激肽釋放酶-1注射液II進(jìn)行穩(wěn)定性考察，見表4。表4重組人激肽釋放酶-1注射液II于37'C條件放置的穩(wěn)定'生考察放樣時(shí)間(天)071421286090120150180外觀溶液澄清未見變化未見變化未見變化未見變化未見變化未見變化未見變化未見變化未見變化活性(AU/ml)0.2200.2050.2010.2180.2070.1890.1930.1920.1800.172結(jié)果表明，本發(fā)明重組人激肽釋放酶-1注射液n在0時(shí)檢測(cè)的活性較理論活性提高了30%以上(水解明膠對(duì)照溶液本身無(wú)活性，而將其作為蛋白酶保護(hù)劑時(shí)可提高人激肽釋放酶-1的生物活性值)，將重組人激肽釋放酶-1注射液II在37'C條件下放置六個(gè)月后溶液澄清無(wú)異樣、活性基本穩(wěn)定。實(shí)施例4人激肽釋放酶-1注射液III的制備處方人激肽釋放酶-l(人尿中提取)1000AU(活性終濃度為1AU/mL)磷酸氫二鈉1.732g磷酸二氫鈉一水合物1.077g氯化鈉8.775g右旋糖酐-4040g制備工藝稱取磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、氯化鈉、右旋糖酐-40，加入適量的注射用水充分溶解輔料后，用磷酸或NaOH調(diào)節(jié)pH值至7.0，再量取適量的重組人激肽釋放酶-1加入其中，充分混勻，用注射水定容至1000ml，過濾除菌，灌裝，壓塞、軋蓋即可，得到人激肽釋放酶-i注射液ni。該處方選用了pH7.0，含0.15mol/L氯化鈉的20mmol/L的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖體系，4%右旋糖酐-40作蛋白酶保護(hù)劑。對(duì)人激肽釋放酶-l注射液III進(jìn)行穩(wěn)定性考察。結(jié)果表明，本發(fā)明提供的人激肽釋放酶-1注射液HI在37"C條件下放置六個(gè)月后溶液澄清無(wú)異樣、活性基本穩(wěn)定。實(shí)施例5激肽釋放酶處方激肽釋放酶-l(豬胰腺)磷酸氫二鈉磷酸二氫鈉一水合物氯化鈉甘露醇甘氨酸注射液IV的制備200AU(活性終濃度為0.2AU/mL)1.732g1.077g8.775g40g10g制備工藝稱取磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、氯化鈉、甘露醇和甘氨酸，加入適量的注射用水充分溶解輔料后，用磷酸或NaOH調(diào)節(jié)pH值至7.0，再量取適量的激肽釋放酶-1加入其中，充分混勻，用注射水定容至1000ml，過濾除菌，灌裝，壓塞、軋蓋即可，得到激肽釋放酶-i注射液iv。該處方選用了pH7.0,含0.15mol/L氯化鈉的20mmol/L的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖體系，4%甘露醇和1%甘氨酸組合作蛋白酶保護(hù)劑。對(duì)重組人激肽釋放酶-1注射液IV進(jìn)行穩(wěn)定性考察。結(jié)果表明，本發(fā)明提供的激肽釋放酶-l(豬胰腺)注射液IV在37t:條件下放置六個(gè)月后溶液澄清無(wú)異樣、活性基本穩(wěn)定。實(shí)施例6重組人激肽釋放酶-1注射液V的制備按下表所列的配方和實(shí)施例2-5中所述的制備方法得到重組人激肽釋放酶-l(甲醇酵母)注射液V。<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>v代表選中表5中是重組人激肽釋放酶-1注射液V存放在37'C下的活性結(jié)果(AU/mL)。表537'C條件下，重組人激肽釋放酶-l注射液V活性<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>結(jié)果表明，本發(fā)明提供的重組人激肽釋放酶-1注射液v中的保護(hù)劑在重組人激肽釋放酶-1的保存過程中有很好的保護(hù)作用。對(duì)比例1-3各處方中成分如下所示，分別考察這三組處方在液體狀態(tài)下，制劑中重組人激肽釋放酶-1的生物活性。<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>v代表該組配方選擇了本輔料重組人激肽釋放酶-1制劑規(guī)格定為0.1-0.3AU/mL/瓶，在進(jìn)行制劑穩(wěn)定性研究時(shí)，將原液濃度稀釋致上述范圍內(nèi)進(jìn)行。表6是重組人激肽釋放酶-l在上述三組處方中，存放在37'C下，不同檢測(cè)項(xiàng)目于各個(gè)檢測(cè)點(diǎn)的活性結(jié)果(AU/mL)。表6<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>結(jié)果表明，所選用的保護(hù)劑能夠較好地保持重組人激肽釋放酶-1的穩(wěn)定性37"C放樣6個(gè)月后溶液澄清，活性保持在最初狀態(tài)；與注射液V中的處方比較，對(duì)比例中重組人激肽釋放酶-1的活性較低，說明水解明膠有提高其活性的作用，并保持很好的穩(wěn)定性，這與實(shí)施例2的結(jié)果一致。實(shí)施例7-10含有人激肽釋放酶-1的注射液VI-IX按下表所列的配方和實(shí)施例1-4中所述的制備方法得到含有人激肽釋放酶-l(CHO細(xì)胞)的注射液VI—IX。<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>v代表該組配方選擇了本輔料表7所列是含有人激肽釋放酶-1的注射液VI-IX存放在37"C下的活性結(jié)<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>結(jié)果表明，選用水解明膠作蛋白酶保護(hù)劑可以使人激肽釋放酶-1保持在較高的活性，并具有很好的穩(wěn)定性，水解明膠用量的越大，人激肽釋放酶-l的活性越高；當(dāng)水解明膠濃度在〉0.ly。(w/v)濃度時(shí)即可使人激肽釋放酶-l在37°C條件放置6個(gè)月基本穩(wěn)定。同時(shí)在上述實(shí)施例中，防腐劑尼泊金乙脂和尼泊金丙脂以0.02%等量混合時(shí)，于4'C放置一段時(shí)間后有晶體析出，表明0.02%的尼泊金乙脂和尼泊金丙脂等量混合不太適合在此溫度下長(zhǎng)時(shí)間存放，考慮到重組人激肽釋放酶-1液體制劑主要是保存在4'C下，故而適當(dāng)降低防腐劑的用量，選用兩個(gè)劑量0.01%和0.005。/。。通過抑菌能力試驗(yàn)，最終確定0.01%的防腐劑用量，并且此用量在rc下并無(wú)任何晶體析出。實(shí)施例11含有重組人激肽釋放酶-1的注射液x按下表所列的配方和實(shí)施例1-4中所述的制備方法得到含有重組人激肽釋放酶-1(CHO細(xì)胞)的注射液X。<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>V代表該組配方選擇了本輔料表8所列是含有重組人激肽釋放酶-1的注射液X存放在37t下的活性結(jié)果(AU/mL)。表8<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>置六結(jié)果表明，本發(fā)明提供的重組人激肽釋放酶-1注射液X在37"C條件下放個(gè)月后溶液澄清無(wú)異樣、活性穩(wěn)定。實(shí)施例12含有重組人激肽釋放酶-1的注射液XI按下表所列的配方和實(shí)施例2、6中所述的制備方法得到含有高濃度的重組人激肽釋放酶-l(甲醇酵母)的注射液XI。<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>v代表該組配方選擇了本輔料結(jié)果表明，本發(fā)明提供的重組人激肽釋放酶-i注射液XI在37X:條件下放置六個(gè)月后溶液澄清無(wú)異樣、活性穩(wěn)定。通過上述實(shí)施例2-12中各個(gè)不同實(shí)驗(yàn)組的37'C加速穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)，發(fā)明人找到了幾種對(duì)人激肽釋放酶-1有穩(wěn)定保護(hù)作用的物質(zhì)一水解明膠、甘露醇、右旋糖酐、甘氨酸及其組合物，能使激肽釋放酶-1在37"C條件下，穩(wěn)定180天。另外以尼泊金乙脂和尼泊金丙脂的等量混合(其優(yōu)選用量為0.01%)作為防腐劑，能很好的抑制細(xì)菌等微生物污染。以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并非用以限定本發(fā)明的實(shí)質(zhì)技術(shù)內(nèi)容范圍，本發(fā)明的實(shí)質(zhì)技術(shù)內(nèi)容是廣義地定義于申請(qǐng)的權(quán)利要求范圍中，任何他人完成的技術(shù)實(shí)體或方法，若是與申請(qǐng)的權(quán)利要求范圍所定義的完全相同，也或是一種等效的變更，均將被視為涵蓋于該權(quán)利要求范圍之中。權(quán)利要求1.一種穩(wěn)定的激肽釋放酶-1注射液，其特征在于，所述的注射液中含有(1)激肽釋放酶-10.05-40.00AU/ml；(2)磷酸鹽緩沖液10-50mmol/L，pH6.0-8.0；(3)氯化鈉0.01-0.2mol/L；和(4)蛋白酶保護(hù)劑0.01-20％(w/v)。2.如權(quán)利要求1所述的注射液，其特征在于，所述的蛋白酶保護(hù)劑為0.5—10%;優(yōu)選1一5%。3.如權(quán)利要求1所述的注射液，其特征在于，所述的蛋白酶保護(hù)劑選自下述的一種或多種甘露醇、水解明膠、右旋糖酐、葡萄糖、蔗糖、海藻糖、聚乙烯吡洛垸酮、甘氨酸、聚乙二醇；所述的蛋白酶保護(hù)劑優(yōu)選自下述的一種或多種甘露醇、水解明膠、右旋糖酐、甘氨酸。4.如權(quán)利要求3所述的注射液注射劑，其特征在于，其中所述的甘露醇0.5-10%(w/v)，水解明膠0.1-10%(w/v)，右旋糖酐0.5-10%(w/v)，甘氨酸0.05-2%(w/v);優(yōu)選所述的甘露醇l-4%(w/v),水解明膠1-3%(w/v)，右旋糖酐1-4%(w/v)，甘氨酸0.5-1°/。(w/v)。5.如權(quán)利要求1所述的注射液，其特征在于，激肽釋放酶-1是天然提取或重組的；優(yōu)選重組人激肽釋放酶-l。6.如權(quán)利要求l所述的注射液，其特征在于，其中所述的磷酸鹽緩沖液是磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖對(duì)；所述的氯化鈉為0.1-0.2mol/L;所述的右旋糖酐選自右旋糖酐-20、右旋糖酐-40或右旋糖酐-70。7.如權(quán)利要求1所述的注射液，其特征在于，所述的溶液中還含有0.005-0.02。/。(w/v)防腐劑。8.—種如權(quán)利要求l所述的注射液的制備方法，其特征在于，所述的方法包括步驟(a)將磷酸鹽、氯化鈉、蛋白酶保護(hù)劑和注射用水混合；(b)用磷酸或NaOH調(diào)節(jié)pH6.0—8.0;和(c)加入激肽釋放酶-1后注射用水定容，得到如權(quán)利要求1所述的穩(wěn)定的激肽釋放酶-l注射液。9.如權(quán)利要求8所述的制備方法，其特征在于，所述的磷酸鹽緩沖液是磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖對(duì)。10.如權(quán)利要求8所述的制備方法，其特征在于，在步驟(a)中還可以加入防腐劑，使步驟(c)中所得到的注射液中含有O.005-0.02y。(w/v)防腐劑。全文摘要本發(fā)明公開了一種穩(wěn)定的激肽釋放酶-1注射液，所述的注射液中含有(1)激肽釋放酶-10.05-40.00AU/ml；(2)磷酸鹽緩沖液10-50mmol/L，pH6.0-8.0；(3)氯化鈉0.01-0.2mol/L；和(4)蛋白酶保護(hù)劑0.01-20w/v％。本發(fā)明公開的含有激肽釋放酶-1的穩(wěn)定的注射液中蛋白的穩(wěn)定性好；不含人血白蛋白作為保護(hù)劑，避免了增加引入外源性病毒的潛在危險(xiǎn)；而且制作簡(jiǎn)便，成本低。文檔編號(hào)A61K9/08GK101596311SQ20081003842公開日2009年12月9日申請(qǐng)日期2008年6月2日優(yōu)先權(quán)日2008年6月2日發(fā)明者張淑蕓,曹嘉煒,英沈,潘學(xué)工,王書生,陳佩新,陳耀國(guó),黃秀東申請(qǐng)人:上海萬(wàn)興生物制藥有限公司