一種調(diào)控光滑球擬酵母耐酸脅迫能力的轉(zhuǎn)錄因子Asg1p的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種調(diào)控光滑球擬酵母耐酸脅迫能力的轉(zhuǎn)錄因子Asglp，屬于生物工 程領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 光滑球擬酵母（Candidaglabrata)是工業(yè)生產(chǎn)丙酮酸的唯一微生物。除此之外， C.glabrata還可用于工業(yè)生產(chǎn)富馬酸、蘋果酸、a-酮戊二酸等有機酸。有機酸發(fā)酵過程 中，隨著產(chǎn)物的積累，培養(yǎng)基的pH迅速降低，導(dǎo)致菌體的生長和產(chǎn)物的積累減緩甚至停止。 近年來國內(nèi)外主要通過外源添加輔助底物、誘變育種、基因工程和適應(yīng)性進化等策略提高 菌體的酸耐受性和有機酸產(chǎn)量。對C.glabrata進行耐酸機制的研宄可從根本上解決這一 問題，但此機制尚不清楚。因此，進行光滑球擬酵母酸脅迫耐受機制的研宄很有必要，這對 提尚有機酸廣量具有指導(dǎo)意義。
[0003]目前對光滑球擬酵母酸脅迫的研宄尚未廣泛開展，蛋白質(zhì)組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)相對于高 pH來說，光滑球擬酵母對低pH環(huán)境有更強的耐受性。對GPI錨定天冬氨酰蛋白酶的研宄發(fā) 現(xiàn)光滑球擬酵母可通過CgYpsl調(diào)節(jié)質(zhì)子泵CgPmal的活性以適應(yīng)酸脅迫環(huán)境。
[0004] 本發(fā)明旨在鑒定一種調(diào)控光滑球擬酵母耐酸脅迫能力的轉(zhuǎn)錄因子Asglp。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明提供了一種調(diào)控光滑球擬酵母耐酸脅迫能力的轉(zhuǎn)錄因子Asglp，編碼所述 轉(zhuǎn)錄因子的核苷酸序列如SEQIDNO. 1所示。
[0006] 敲除光滑球擬酵母的編碼所述轉(zhuǎn)錄因子Asglp的基因CgASGl，獲得缺失CgASGl 基因的突變菌株CgasglA，突變菌株的生長能力和對酸性環(huán)境的耐受能力都明顯下降；尤 其是在pH2. 0的條件下，突變菌株的H+-ATPase活性降低，引起胞內(nèi)酸化，進而造成胞內(nèi) R0S含量升高?；駽gASGl回補菌株CgasglA/CgASGl表現(xiàn)出與野生型菌株wt相同的 H+-ATPase活性、pHijPR0S水平，在各培養(yǎng)基上均表現(xiàn)出與野生型菌株wt相同的生長表型。
[0007] 應(yīng)用所述轉(zhuǎn)錄因子Asglp調(diào)控光滑球擬酵母的耐酸脅迫性能，可以是調(diào)節(jié)光滑球 擬酵母中基因CgASGl及轉(zhuǎn)錄因子Asglp祀基因的表達水平，以改變其耐受酸脅迫的能力及 有機酸的產(chǎn)量。
[0008] 本發(fā)明提供的一種參與光滑球擬酵母酸脅迫的轉(zhuǎn)錄因子Asglp，其功能是在細胞 生長及酸脅迫耐受中發(fā)揮重要作用，敲除該轉(zhuǎn)錄因子，酵母的礦-ATPase活性降低，引起胞 內(nèi)酸化，進而造成胞內(nèi)R0S含量升高，使得酵母的生長及耐酸脅迫能力下降。本發(fā)明提供的 該調(diào)控光滑球擬酵母耐酸脅迫能力的轉(zhuǎn)錄因子Asglp，能用于構(gòu)建抗酸脅迫的有機酸生產(chǎn) 菌株。
【附圖說明】
[0009] 圖1基因缺失菌株的構(gòu)建及驗證，A敲除框的構(gòu)建，B基因缺失菌株的驗證；
[0010]Ml、M2泳道分別代表2000bp和lOOOObp的DNAmarker;+/-泳道代表分別以菌株 wt基因組和水為模板進行PCR的對照；1、2泳道分別代表菌株wt和突變菌株CgasglA的 陽性轉(zhuǎn)化子基因組；3、4泳道分別代表使用引物P7/P8進行的PCR驗證。
[0011] 圖2基因回補菌株的構(gòu)建及驗證，A目的基因的擴增，B基因回補菌株的驗證；
[0012] M2泳道代表lOOOObp的DNAmarker;+/-泳道代表分別以基因CgASGl和水為模板 進行PCR的對照；1泳道代表CgASGl基因片段；2泳道代表CgasglA/CgASGl陽性轉(zhuǎn)化子的 菌落PCR驗證。
[0013] 圖3光滑球擬酵母生長的測定，A非發(fā)酵性碳源上的平板生長實驗，B不同pH下的 平板生長實驗
[0014] 圖4胞內(nèi)微環(huán)境測定結(jié)果，AH+-ATPase活性，B胞內(nèi)pH，C胞內(nèi)R0S含量
【具體實施方式】
[0015] 以下是光滑球擬酵母（Candidaglabrata)菌株構(gòu)建及驗證、生長性能分析及胞內(nèi) 微環(huán)境測定的實施例。
[0016] 平板生長實驗：將待測菌株的單菌落接種于20mL的YNB(0. 67%不含氨基酸的YNB，2%葡萄糖，pH5. 2)液體培養(yǎng)基中，30°C搖床培養(yǎng)12h至對數(shù)生長期，測定菌體濃度 并將菌懸液調(diào)節(jié)至〇D_= 1. 0,以此為初始濃度，進行5次10倍梯度稀釋，依次將4yL菌 液點種在不同碳源的YNB(0. 67%不含氨基酸的YNB，圖3A中相應(yīng)的碳源）和不同pH的 YNB(0.67%不含氨基酸的YNB，2%葡萄糖，pH3.0和pH2.0)固體培養(yǎng)基上，30°C培養(yǎng)2 天，觀察菌體的生長情況并拍照。
[0017] 細胞活性測定：將對數(shù)期的待測菌株接種于pH2. 0的YNB液體培養(yǎng)基，初始0D_ =0. 1，30°C搖床培養(yǎng)，每隔一定的時間取菌液200yL，稀釋適當(dāng)倍數(shù)（使每塊平板上的單 菌落數(shù)控制在30-300個），涂布YPD(1 %酵母提取物，2%蛋白胨，2%葡萄糖）固體培養(yǎng)基， 24h后進行單菌落計數(shù)，活菌濃度根據(jù)下面的公式計算：
[0018] 活菌濃度=單菌落數(shù)X5X稀釋倍數(shù)（個?mr1)
[0019] 定義Oh的細胞活性為100%，并以此為基礎(chǔ)計算每隔2h在pH2. 0中各菌株的細 胞活性。
[0020] 光滑球擬酵母胞內(nèi)微環(huán)境的測定：通過測定細胞膜H+-ATPase活性、胞內(nèi)pH和胞 內(nèi)R0S含量進行胞內(nèi)微環(huán)境的評價。
[0021] (l)H+-ATPase活性的測定
[0022] 將在pH5. 2或pH2. 0的培養(yǎng)基中培養(yǎng)2h的對數(shù)期細胞通過lmL溶液A(Tris 100mM，EDTA5mM，DTT2mM，pH10.7)重懸，5mL溶液B(蔗糖 0.33M，EDTA5mM，DTT2mM， Tris-HCl0? 1M，pH8.0)稀釋，多次離心后用lOOyL溶液C(甘油 20%，EDTA0.ImM，DTT 0.lmM，Tris-HCl10mM，pH7. 5)重懸，得到總的膜碎片；取5yg膜蛋白在120yL溶液 0(八1?5禮，]\%504101111，1((：1501111，]\^5 501111，謂03501111，恥％51111，鉬酸銨0.21111)中30°〇培養(yǎng) 30min，使用鉬藍比色法測定720nm處的吸光值，并通過對應(yīng)無機磷標(biāo)準(zhǔn)曲線計算H+-ATPase 分解ATP產(chǎn)生的無機磷含量，定義H+-ATPase酶活單位為每分鐘每毫克酶蛋白消耗ATP的 mM數(shù)。
[0023] (2)胞內(nèi)pH
[0024] 將pH5. 2或pH2. 0的培養(yǎng)基中培養(yǎng)2h的對數(shù)期細胞用50mmol?PCP緩沖液 洗兩次，用lmLCP緩沖液重懸至0D6QQ= 0. 5,添加CFDA-SE至終濃度160ymol?L'