專利名稱：一種檢測光滑假絲酵母菌的實時熒光定量pcr試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種檢測光滑假絲酵母菌(光滑念珠菌)的試劑盒，具體地說，涉及一種以實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)檢測光滑假絲酵母菌的試劑盒。
背景技術(shù)：
近年來，隨著免疫受損人群(包括惡性腫瘤、血液病、艾滋病、SARS、糖尿病、自身免疫病、嚴重燒傷和創(chuàng)傷、長期吸毒者等)的不斷擴大；廣譜抗生素、皮質(zhì)類固醇激素和免疫抑制劑在臨床上廣泛應(yīng)用；器官移植、導(dǎo)管插管、介入治療等新技術(shù)的普遍開展，使機會性真菌感染的發(fā)病率急劇上升，已經(jīng)成為院內(nèi)感染死亡的主要原因之一。美國國家醫(yī)院感染監(jiān)測中心(NNIS)資料顯示，20世紀90年代住院患者深部真菌感染率為80年代的1. 9倍。1995-2002年美國49所醫(yī)院連續(xù)7年的監(jiān)測資料表明，念珠菌敗血癥在醫(yī)院感染敗血癥中居第4位，病死率則居首位。近年非白念珠菌的分離率升高，其中由光滑念珠菌引起的感染明顯增加。調(diào)查顯示1989—1999年，由光滑念珠菌所致的血源性感染上升，是引起念珠菌血癥的第2位常見病原菌，從全球范圍來看，約占念珠菌血癥的15%。光滑念珠菌也是口腔黏膜的重要病原真菌，由其引起的口腔感染占艾滋病患者口腔念珠菌感染的14%。同樣，光滑念珠菌是分離自尿液的第2位常見病原真菌和引起外陰陰道念珠菌病(VVC)最常見的非白念珠菌，從VVC患者病灶部位分離的念珠菌中，光滑念珠菌占；34· 5%ο與其他非白念珠菌相比，光滑念珠菌引起的感染的病死率最高，為409Γ70%，腫瘤患者和骨髓移植患者發(fā)生的光滑念珠菌血癥的病死率分別高達50%和100%。由于真菌感染初期癥狀不明顯，臨床表現(xiàn)缺乏特征性，早期診斷困難，易導(dǎo)致抗真菌治療的延遲。而真菌感染尤其是深部真菌感染時病情兇險，常貽誤治療時機。加上光滑假絲酵母菌對常用抗真菌藥物包括兩性霉素B的敏感性低，且近年來對氟康唑的耐藥率呈上升趨勢，致使臨床使用常見抗真菌藥物治療效果不佳。因此快速準確的診斷和鑒定感染真菌種類對指導(dǎo)治療用藥十分重要，能顯著提高機會性真菌感染患者的生存率。目前真菌感染的臨床鑒定主要依賴于顯微鏡下孢子和菌絲的形態(tài)、培養(yǎng)的菌落特征以及生化結(jié)果，但這些傳統(tǒng)的診斷方法通常周期長、敏感性差、陽性率低，不能滿足臨床需要。作為金標準的組織病理學(xué)和深部組織培養(yǎng)由于其有創(chuàng)性而難于被患者接受。因此， 如何提高真菌感染的早期、特異診斷水平是目前臨床真菌學(xué)領(lǐng)域的研究熱點，也是臨床檢驗中要解決的關(guān)鍵問題。測定循環(huán)抗原與抗體的血清學(xué)方法，由于發(fā)生真菌感染的宿主多免疫受損，缺乏可檢測到的抗體，或者抗體產(chǎn)生的變化較大，因此檢測抗體對于診斷的意義不大。目前主要檢測血液循環(huán)中的抗原，如甘露聚糖、(1，；3)-β-葡聚糖及D-/L-阿拉伯糖醇(DA/LA)等， 但致病性真菌之間存在交叉抗原，導(dǎo)致血清學(xué)檢查難以獲得滿意結(jié)果。分子生物學(xué)方法在臨床病原性真菌檢測中的應(yīng)用，為提高病原性真菌的檢測靈敏度和特異性提供了良好的手段。常用的分子生物學(xué)方法有PCR、核酸探針、限制性酶切反應(yīng)、 PCR-RFLP, PCR-SSCP、基因芯片技術(shù)等。普通PCR因其易引起實驗室污染，很少用于臨床檢驗，通用引物PCR具有快速敏感的優(yōu)勢，但分離的特異性差，尤其不能對光滑念珠菌這種對部分抗真菌藥物原發(fā)不敏感的菌株進行鑒定；核酸探針為增加特異性需要大量的探針，價格昂貴且耗時，不能用于常規(guī)實驗室檢查；PCR-SSCP、PCR-RFLP、基因芯片技術(shù)等敏感性和特異性都較好，但操作比較復(fù)雜、儀器設(shè)備要求高，多用于科研，目前均不宜用于臨床檢測。 因此，尋找一種能快速、敏感和特異檢測病原真菌的方法成為臨床的迫切需求。實時熒光定量PCR技術(shù)在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團，利用熒光信號實時監(jiān)測整個PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析。避免了傳統(tǒng)PCR以終產(chǎn)物檢測定量產(chǎn)生的偏差，提高了實驗的重復(fù)性。與常規(guī)PCR相比特異性更強，有效解決PCR產(chǎn)物污染，自動化程度高，敏感性通常達100拷貝/ ml，線性范圍寬，重復(fù)性好，且檢測時間短。 目前，實時熒光定量PCR已廣泛應(yīng)用，美國食品與藥品管理局(FDA)已經(jīng)批準了一些定量檢測病原體的PCR診斷試劑盒，如用于HIV、結(jié)核分枝桿菌、沙眼衣原體等的實時熒光PCR檢測的試劑盒。同樣，中國目前也已批準了乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、HIV和SARS等的實時熒光PCR檢測試劑盒的生產(chǎn)和臨床應(yīng)用。在病原性真菌檢測中的研究也有報道。在歐盟， 基于定量PCR檢測融合基因的一些診斷試劑盒已經(jīng)通過CE認證。因此，開發(fā)一種能夠檢測光滑假絲酵母菌的實時熒光定量PCR試劑盒，為臨床提供新的快速早期診斷手段，以期發(fā)現(xiàn)更多的光滑假絲酵母菌感染，采用更有效的治療藥物和方案，救治更多的患者；同時也可監(jiān)測療效，幫助臨床評價治療效果，并有效降低醫(yī)療成本。對IFI的診斷，治療和預(yù)后具有重要意義。眾所周知，在使用已知的實時熒光定量PCR技術(shù)檢測和定量分析臨床樣品中某特定靶核酸的實踐中，為了減少和避免檢測結(jié)果的假陰性或假陽性，提高定量分析的準確性， 一個關(guān)鍵性的基本技術(shù)環(huán)節(jié)和技術(shù)難點是如何基于已知的靶多核苷酸序列設(shè)計并制備適當?shù)囊锖凸押塑账崽结槨１景l(fā)明人在以往多年從事PCR技術(shù)特別是實時熒光定量PCR技術(shù)研究的基礎(chǔ)上，開發(fā)相應(yīng)的試劑盒應(yīng)用于光滑假絲酵母菌的檢測和定量分析，成功地完成了本發(fā)明，并通過了一定樣本量的臨床試用和評價。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種利用實時熒光聚合酶鏈式反應(yīng)技術(shù)進行光滑假絲酵母菌檢測的試劑盒，利用本試劑盒可以準確鑒別并定量光滑假絲酵母菌。為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案
根據(jù)GENBANK上公布的核酸序列，尋找光滑假絲酵母菌核酸序列的特異性保守區(qū)，并針對保守區(qū)設(shè)計靶核苷酸引物和探針。這些引物探針在DNA聚合酶、PCR反應(yīng)酶以及PCR反應(yīng)液中，通過熒光PCR儀實現(xiàn)體外核酸的循環(huán)擴增。本發(fā)明設(shè)計的光滑假絲酵母菌特異性的正向引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO 1 所示。本發(fā)明設(shè)計的光滑假絲酵母菌特異性的反向引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO 2 所示。
本發(fā)明設(shè)計的光滑假絲酵母菌的特異性探針，其核苷酸序列如SEQ ID NO :3所示。 所述探針的兩端分別結(jié)合有熒光發(fā)生基團FAM和熒光淬滅基團ECLIPSE。一種檢測光滑假絲酵母菌的實時熒光定量PCR試劑盒，包括如下物質(zhì) PCR反應(yīng)液、引物探針混合液、PCR反應(yīng)酶、純H2O和陽性定量標準品。所述PCR 反應(yīng)液由 Tris-HCl (50mmol/L，ρΗ8· 0)、MgCl2 (8mmol/L)和 KCl (250mmol/L)組成。所述引物探針混合液中引物濃度均為0. 2mmol/L，探針濃度均為0. lmmol/L。所述PCR反應(yīng)酶由Hotstart Taq DNA聚合酶和dNTPs組成。Taq酶、dNTPs均可采用市售產(chǎn)品；如TaKaRa公司的產(chǎn)品，其中每人份PCR反應(yīng)酶系中Hotstart Taq DNA聚合酶的用量為5U，dNTPs用量為lOmmol/L。所述陽性定量標準品為含有序列為SEQ ID NO :4的DNA片段的pMD19_T重組質(zhì)粒。其中所述陽性定量標準品的制備方法由以下步驟組成
(1)以提取的光滑假絲酵母菌DNA為模板，用序列為SEQN0.5和SEQ NO. 6的引物擴增出序列為SEQ NO. 4的DNA片段，擴增程序為95°C 15分鐘；94°C 30秒，55°C 30秒，72°C 30秒，35個循環(huán)，最后一步為72°C 7分鐘；
(2)回收并純化擴增所得的DNA片段SEQN0. 4 ；
(3)將DNA片段SEQN0. 4插入到pMD19_T，即可。在上述檢測光滑假絲酵母菌的實時熒光定量PCR試劑盒中，還可以添加陰性質(zhì)控品和陽性質(zhì)控品。所述陰性質(zhì)控品為生理鹽水，所述陽性質(zhì)控品為滅活的光滑假絲酵母菌菌液，菌液濃度為5. OX 1(T5. OX IO6拷貝/mL。試劑盒中進行待檢標本檢測可同時進行兩種質(zhì)控品的檢測，僅當陽性質(zhì)控品檢測時FAM通道熒光信號呈陽性，陰性質(zhì)控品檢測FAM通道熒光信號均呈陰性時，待檢標本的檢測結(jié)果才有效。上述檢測光滑假絲酵母菌的實時熒光定量PCR試劑盒的PCR擴增的條件為 950C 15分鐘；94°C 15秒，58°C 45秒，40個循環(huán)(58°C時收集熒光信號)。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果
(1)對光滑假絲酵母菌核酸擴增水平進行檢測，可反映出患者體內(nèi)光滑假絲酵母菌感染的狀態(tài)，可用于真菌感染的監(jiān)測和防治，有助于疾病的早期診斷和治療；(2)實時熒光 PCR技術(shù)針對光滑假絲酵母菌核酸特異性序列設(shè)計引物、探針，具有較高通量，操作簡便、相對降低成本的優(yōu)點，更適用于大多數(shù)患者檢測。(3)本發(fā)明的試劑盒擴增待檢標本由市售的實時熒光定量PCR儀自動完成，操作簡單，耗時少，且最大限度地減少了污染的發(fā)生。檢測結(jié)果可用于光滑假絲酵母菌檢測、輔助臨床診斷及常規(guī)監(jiān)測等多個領(lǐng)域研究。


圖1為試劑盒陰性質(zhì)控品的擴增曲線。圖中沒有S型擴增曲線，說明FAM通道熒光信號均呈陰性。圖2為試劑盒陽性質(zhì)控品的擴增曲線。圖中FAM通道的擴增曲線為S型，說明該通道的熒光信號呈陽性。圖3為陽性定量標準品的實時熒光定量PCR的標準曲線圖。
圖4為3例陰性樣本的擴增曲線。圖中沒有S型擴增曲線，說明檢測樣本中無光滑假絲酵母菌核酸。圖5為3例標本(血液、痰液、肺泡灌洗液)樣本的擴增曲線。圖中FAM通道的擴增曲線為S型，說明樣本有光滑假絲酵母菌核酸的擴增，表示樣本中存在光滑假絲酵母菌。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。實施例1光滑假絲酵母菌檢測試劑盒及其使用
1、制備包括下列組成成分的試劑盒引物探針混合液(25μ 1/管)1管，PCR反應(yīng)液 (250 μ 1/管)1管，PCR反應(yīng)酶系(75 μ 1/管)1管，陽性質(zhì)控品(200 μ 1/管)1管，陰性質(zhì)控品(200 μ 1/管)1管，純H2O (2000μ 1/管)1管。陽性定量標準品4管(IO7拷貝/ml、IO6 拷貝 /ml、IO5 拷貝 /ml、IO4 拷貝 /ml)。2、標本的采集、保存和運輸
2.1標本類型血液、痰液、肺泡灌洗液等。2. 2標本采集、保存和運送取200ul的血液、痰液、肺泡灌洗液等置于無菌離心管中，貼好標簽，置冰壺內(nèi)攜至實驗室或低溫(_20°C _70°C)凍存。標本長途運送采用干冰。3、核酸提取
可采用市售的DNA提取試劑盒，建議使用TaKaRaW hast DNAiso Kit提取試劑盒，并按照試劑盒的說明書進行操作，最后收集約50 μ 1 DNA溶液，直接進行檢測或保存于-20°C4、實時實時熒光定量PCR擴增及檢測
4. 1試劑準備按比例取相應(yīng)量的引物探針混合液、PCR反應(yīng)液、PCR反應(yīng)酶系(引物探針混合液 μ /人份+ PCR反應(yīng)液 ομ /人份+ PCR酶系3μ1/人份+純H2O 16μ1/人份)， 充分混勻后按30μ1/管分裝成PCR反應(yīng)管，備用。4.2加樣向PCR反應(yīng)管中，分別加入提取后的陰、陽性質(zhì)控品、樣本DNA溶液 20 μ 1，同時加入4管陽性定量標準品，蓋緊管蓋，放入儀器樣品槽。4. 3編輯(ABI Prism 7500實時熒光定量PCR儀)
打開ktup窗口，按對應(yīng)順序設(shè)置陰、陽性和空白質(zhì)控品及待測標本，并在Name欄中設(shè)置樣品名稱。選中所有設(shè)置樣品孔，雙擊，選擇Add Detector,選擇Importer為FAM和 Quencher 為 ECLIPSE,在 Passive Reference 中選擇(none)。打開 instrument 窗□設(shè)置循環(huán)條件95°C 15分鐘；94°C 15秒，58°C 45秒，40個循環(huán)。所有設(shè)置完成后保存文件，運行。4. 4結(jié)果分析及判斷
反應(yīng)結(jié)束后保存檢測數(shù)據(jù)文件。在Results下打開Amp plot窗口。選擇分析的目的樣品所在位置。將Baseline數(shù)值改為start :3，stop :10，并打開manual設(shè)定Threshold 1.5 士 100000。雙擊 Rn 坐標上數(shù)值打開 Graph settings 窗口，將 Post Run kttings 中 Log 改為 Linear, OK 后打開 Analysis preferences 窗□,在 Analysis 菜單下選擇 Analyze 自動分析結(jié)果。
結(jié)果判斷C (t)值小于35. 0為陽性；大于35. 0且無典型擴增曲線者為陰性；若 C (t)值大于35.0且有典型擴增曲線者建議重做，重做結(jié)果出現(xiàn)C (t)值和典型擴增曲線者判為陽性，否則為陰性。起始模板拷貝數(shù)則根據(jù)標準曲線和所得的C (t)值計算。實施例2應(yīng)用光滑假絲酵母菌檢測試劑盒檢測臨床樣品
選取3例經(jīng)過培養(yǎng)方法鑒定為光滑假絲酵母菌陰性，3例經(jīng)過培養(yǎng)方法鑒定為光滑假絲酵母菌陽性的標本，標本的核酸提取，PCR擴增及結(jié)果分析步驟參照實施例1進行， 同時進行陰、陽性質(zhì)控品的檢測。檢測結(jié)果陰性質(zhì)控品的擴增曲線不呈S型(見圖1)，陽性質(zhì)控品的擴增曲線為明顯S型曲線(見圖2)，陰、陽性質(zhì)控品均符合試劑盒的質(zhì)控要求；儀器根據(jù)陽性定量標準品繪制的標準曲線(見圖3)線性關(guān)系好，提示擴增效率一致，因此待檢標本的檢測結(jié)果是有效的。由待檢標本的檢測結(jié)果可知本試劑盒能特異地檢測到相應(yīng)光滑假絲酵母菌核酸的擴增 (見圖5)，無光滑假絲酵母菌核酸的標本無擴增曲線(見圖4)。本次試驗中6例標本的檢測結(jié)果與真菌培養(yǎng)鑒定結(jié)果完全吻合，說明利用本試劑盒檢測光滑假絲酵母菌是可行的。本試劑盒操作簡便，檢測時間短，可實現(xiàn)高通量檢測， 加之其價格低廉，有望應(yīng)用于光滑假絲酵母菌的臨床檢測。
權(quán)利要求
1.光滑假絲酵母菌特異性的正向引物，其核苷酸序列如SEQID N0:1所示。
2.光滑假絲酵母菌特異性的反向引物，其核苷酸序列如SEQID N0:2所示。
3.光滑假絲酵母菌的特異性探針，其核苷酸序列如SEQID N0:3所示。
4.如權(quán)利要求3所述的特異性探針，其特征在于所述探針的兩端分別結(jié)合有熒光發(fā)生基團FAM和熒光淬滅基團ECLIPSE。
5.一種檢測光滑假絲酵母菌的實時熒光定量PCR試劑盒，其特征在于包括如下物質(zhì)PCR反應(yīng)液、引物探針混合液、PCR反應(yīng)酶、純H20、陽性定量標準品。
6.如權(quán)利要求5所述的檢測光滑假絲酵母菌的熒光定量PCR試劑盒，其特征在于所述 PCR 反應(yīng)液由 Tris-HCl (50mmol/L, ρΗ8· 0)、MgCl2 (8mmol/L)和 KCl (250mmol/L)組成。
7.如權(quán)利要求5所述的檢測光滑假絲酵母菌的熒光定量PCR試劑盒，其特征在于所述引物探針混合液中引物濃度均為0. 2mmol/L，探針濃度均為0. lmmol/L。
8.如權(quán)利要求5所述的檢測光滑假絲酵母菌的熒光定量PCR試劑盒，其特征在于所述 PCR反應(yīng)酶由Hotstart Taq DNA聚合酶和dNIPs組成，其中每人份PCR反應(yīng)酶系中Hotstart Taq DNA聚合酶的用量為5U，dNTPs用量為10mmol/L。
9.如權(quán)利要求5所述的檢測光滑假絲酵母菌的熒光定量PCR試劑盒，其特征在于還含有陰性質(zhì)控品和陽性質(zhì)控品，所述陰性質(zhì)控品為生理鹽水，所述陽性質(zhì)控品為滅活的光滑假絲酵母菌菌液，菌液濃度為5. OX 10，5. OX IO6拷貝/mL。
10.如權(quán)利要求5所述的檢測光滑假絲酵母菌的熒光定量PCR試劑盒，其特征在于所述定量陽性模板為含有序列為SEQ ID NO 4的DNA片段的pMD19_T重組質(zhì)粒。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種檢測光滑假絲酵母菌的實時熒光定量PCR試劑盒。包括如下物質(zhì)PCR反應(yīng)液、引物探針混合液、PCR反應(yīng)酶、純H2O、陽性定量標準品。用于檢測光滑假絲酵母菌核酸擴增水平，可反映患者體內(nèi)光滑假絲酵母菌感染的狀態(tài)，可用于真菌感染的監(jiān)測和防治，有助于疾病的早期診斷和治療；實時熒光定量PCR技術(shù)針對光滑假絲酵母菌核酸特異性序列設(shè)計引物、探針，特異性強，靈敏度高，且具有較高通量，操作簡便、相對降低成本的優(yōu)點，適用于大多數(shù)患者多種標本的檢測。本發(fā)明的試劑盒擴增待檢標本由市售的實時熒光定量PCR儀完成，操作簡單，耗時少，且最大限度地減少了污染的發(fā)生。
文檔編號C12Q1/68GK102181567SQ20111012251
公開日2011年9月14日 申請日期2011年5月12日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月12日
發(fā)明者王前, 鄭磊, 龍燕 申請人:南方醫(yī)科大學(xué)