專利名稱：一種特異檢測ApoE4基因型的試劑盒及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)的領(lǐng)域，具體是ー種快速、特異性檢測ApoE4基因型的試劑盒及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
人類的載脂蛋白E(Ap0lip0pr0tein Ε,ApoE)由19qll. 2所編碼，其基因常見有3 種表型，即ε 2、ε 3和ε 4等位基因所編碼的3種載脂蛋白Ε2、Ε3和Ε4，構(gòu)成6種不同的基因型。包括3種純合子(ε 2/ ε 2、ε 3/ ε 3、ε 4/ ε 4)禾ロ 3種雜合子(ε 2/ ε 3、ε 3/ ε 4、 ε 2/ ε 4)。等位基因的改變造成ΑροΕ4對LDL受體親和力更大，即ΑροΕ4 > ΑροΕ3 > ΑροΕ2， 從而影響脂蛋白代謝及血脂水平，ΑροΕ4/4基因型已作為心腦血管病發(fā)病的獨(dú)立危險因素。 由于ApoE基因與胰島素抵抗(IR)、肥胖等相關(guān)，因此檢測ApoE基因型對醫(yī)學(xué)分子流行病的研究有重要意義。目前，醫(yī)學(xué)分子流行病檢測ΑροΕ4基因型的方法主要是PCR-RFLP，首先從外周血抽提基因組DNA，選用ApoE外顯子4側(cè)翼序列設(shè)計(jì)引物進(jìn)行ΑροΕ4的擴(kuò)增，Hha I進(jìn)行酶切， 然后對酶切產(chǎn)物進(jìn)行垂直非變性PAGE進(jìn)行分離，以確定其基因型。但是此種方法采樣要求高，檢測繁瑣，不利于流行病學(xué)普查的使用，且創(chuàng)傷性的抽血獲得基因組DNA并非被每個個體所接受，尤其是正常對照組的個體。ApoE外顯子4序列GC含量很高，不易擴(kuò)增，對基因型的檢測結(jié)果有很大影響，有必要對擴(kuò)增條件進(jìn)行優(yōu)化。因此，建立一種簡單易行、無創(chuàng)傷的抽提基因組DNA，高效特異性擴(kuò)增ApoE 4基因片段，快速檢測ApoE4基因型的方法對ApoE4 基因型相關(guān)的分子流行病學(xué)和預(yù)防醫(yī)學(xué)的研究有重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷而提供ー種判定時間短，準(zhǔn)確性高的特異性檢測ApoE4基因型的試劑盒及其應(yīng)用。本發(fā)明的目的可以通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)ー種特異檢測ApoE4基因型的試劑盒，其特征在干，該試劑盒由以下試劑組成 4wt%蔗糖水、10mmol/L的NaOH溶液、lmol/L的三羥甲基氨基甲烷(Tris)-HCl (pH 7. 5)溶液、ニ甲基亞砜(DMSO)、試劑I、試劑II、限制性核酸(Hha I)內(nèi)切酶、IOXM Buffer。所述的試劑盒由表1所述配比的試劑組成，表 權(quán)利要求
1.ー種特異檢測ApoE4基因型的試劑盒，其特征在干，該試劑盒由以下試劑組成 4wt%蔗糖水、10mmol/L的NaOH溶液、lmol/L的三羥甲基氨基甲烷(Tris)-HCl (pH 7. 5)溶液、分析純ニ甲基亞砜(DMSO)、試劑I、試劑II、限制性核酸(Hha I)內(nèi)切酶、IOXM Buffer。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的ー種特異檢測ApoE4基因型的試劑盒，其特征在干，所述的試劑盒由表1所述配比的試劑組成，表1
3.—種如權(quán)利要求1所述的特異檢測ApoE4基因型的試劑盒的應(yīng)用，其特征在干，試劑盒的應(yīng)用的步驟如下(1)樣本的制備和貯存10mL4%蔗糖水漱ロ IOs后3000r/min離心5min收集含有頰粘膜上皮細(xì)胞的沉淀，獲取的標(biāo)本若在短時間檢測可貯存于-20°C，若在長時間檢測可貯存于-80°C或液氮中備用；(2)進(jìn)行ApoE4基因的PCR擴(kuò)增；(3)ApoE4PCR產(chǎn)物經(jīng)HhaI酶切后，酶切產(chǎn)物進(jìn)行15% PAGE電泳；(4)參照Richard方法即可以簡化判定ApoE4基因型。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的ー種特異檢測ApoE4基因型的試劑盒的應(yīng)用，其特征在干，所述的ApoE4基因在利用PCR擴(kuò)增，采用5wt%的ニ甲基亞砜對PCR反應(yīng)程序進(jìn)行優(yōu)化，擴(kuò)增的退火溫度為70°C。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種特異檢測ApoE4基因型的試劑盒及其應(yīng)用，試劑盒由以下試劑組成4％蔗糖水、10mmol/L NaOH溶液、1mol/L Tris-HCl(pH 7.5)溶液、DMSO、試劑I、試劑II、Hha I內(nèi)切酶、10×M Buffer。其應(yīng)用樣本的制備和貯存；抽提基因組DNA；ApoE4基因的PCR擴(kuò)增；ApoE4基因型的鑒定。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本試劑盒提供的試劑可以無創(chuàng)獲取個體的基因組DNA；高效擴(kuò)增ApoE4基因，快速準(zhǔn)確判定ApoE4的基因型，并可同時進(jìn)行大量個體的基因型判定；判定時間短、準(zhǔn)確性高，適用于分子流行病學(xué)和預(yù)防醫(yī)學(xué)大規(guī)模篩查工作。
文檔編號C12Q1/68GK102586404SQ20111000277
公開日2012年7月18日 申請日期2011年1月7日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月7日
發(fā)明者呂立夏, 張介平, 徐國彤, 谷輝杰, 鄧佳齊 申請人:同濟(jì)大學(xué)