一種用于培養(yǎng)細(xì)胞的試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及干細(xì)胞的研究領(lǐng)域，特別是涉及一種新型、高效的無血清培養(yǎng)基及其制備方法和用途。
【背景技術(shù)】
[0002]間充質(zhì)干細(xì)胞普遍存在于人體多種組織和器官中，并具有多向分化潛能，具有刺激組織再生、調(diào)節(jié)免疫等功能，在細(xì)胞治療領(lǐng)域有著廣闊的應(yīng)用前景。
[0003]骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞已經(jīng)在臨床上得到了廣泛應(yīng)用，而目前的研究表明，臍帶來源的間充質(zhì)干細(xì)胞不但能夠成為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的理想替代物，而且具有更大的應(yīng)用潛能。其中，源于人臍帶的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(human Umbilical Cord mesenchymal stemcells，hUC-MSCs)表達(dá)多種胚胎干細(xì)胞的特有標(biāo)志，具有分化潛力大、增殖能力強(qiáng)、免疫原性低、取材方便、無道德倫理問題的限制、易于工業(yè)化制備等特征，而且研究證實(shí)hUC-MSCs在神經(jīng)疾病、免疫系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)以及癌癥、心臟病等疾病的動物模型和臨床研究中有良好治療效果，因此有可能成為最具臨床應(yīng)用前景的多能干細(xì)胞。
[0004]若要將hUC-MSCs進(jìn)一步應(yīng)用于臨床，最重要的就是hUC-MSCs的體外大量擴(kuò)增達(dá)到有效的臨床治療劑量，因此hUC-MSCs的體外培養(yǎng)成為了最基礎(chǔ)同時也是最重要的技術(shù)之一?，F(xiàn)有的hUC-MSCs培養(yǎng)方法多采用在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加FBS、青鏈霉素，但非人血清成分復(fù)雜，使hUC-MSCs在長期的培養(yǎng)過程中易分化，且存在傳播異種病原體的危險(xiǎn)。
[0005]此外，雖然已有科研工作者開發(fā)出多種類型的血清替代物，但目前市場可購買的供hUC-MSCs培養(yǎng)的血清替代物以及完全培養(yǎng)基的培養(yǎng)效果仍不理想，尤其對于干細(xì)胞的貼壁、增殖、以及細(xì)胞長期培養(yǎng)后的穩(wěn)定性的維持等特性均無法達(dá)到預(yù)期效果。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]針對上述技術(shù)問題，本發(fā)明的發(fā)明人研究發(fā)現(xiàn)，在hUC-MSCs的培養(yǎng)過程中，細(xì)胞會分泌多種對自身生長有利的因子、蛋白等成分，可以利用這些成分在無血清環(huán)境下進(jìn)行細(xì)胞、特別是干細(xì)胞的長期擴(kuò)增培養(yǎng)。
[0007]因此本發(fā)明的目的是提供一種用于培養(yǎng)細(xì)胞的試劑盒，該試劑盒包括無血清培養(yǎng)基，所述無血清培養(yǎng)基中含有從細(xì)胞培養(yǎng)物獲得的濃縮液，特別適合在無血清環(huán)境下培養(yǎng)細(xì)胞。
[0008]本發(fā)明的技術(shù)方案如下。
[0009]一方面，本發(fā)明提供了一種用于培養(yǎng)細(xì)胞的試劑盒，所述試劑盒包括無血清培養(yǎng)基，所述無血清培養(yǎng)基含有a-MEM/DMEM-F12、β -巰基乙醇、非必需氨基酸、重組人堿性成纖維生長因子(b-FGF)和人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(hUC-MSCs)的培養(yǎng)上清濃縮液。
[0010]優(yōu)選地，所述無血清培養(yǎng)基包含0.05-0.2體積份的β -巰基乙醇、0.5-2體積份的非必需氨基酸水溶液、4-6體積份的培養(yǎng)上清濃縮液、90-95體積份的a-MEM/DMEM-F12和終濃度為5-15ng/ml的重組人堿性成纖維生長因子，其中，所述非必需氨基酸水溶液包含濃度各為8-12mM的甘氨酸、丙氨酸、L-天門酰胺、L-天冬氨酸、谷氨酸、脯氨酸和絲氨酸；
[0011]更優(yōu)選地，所述無血清培養(yǎng)基包含0.1體積份的β -巰基乙醇、1體積份的非必需氨基酸水溶液、5體積份的培養(yǎng)上清濃縮液、94體積份的a-MEM/DMEM-F12和終濃度為10ng/ml的重組人堿性成纖維生長因子。
[0012]所述培養(yǎng)上清濃縮液通過包括以下步驟的方法制得:
[0013]收集人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)上清液，離心，微濾膜過濾，超濾濃縮。
[0014]優(yōu)選地，所述培養(yǎng)上清濃縮液通過包括以下步驟的方法制得:
[0015](1)將人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞以0.5-4X 104個細(xì)胞/cm 2的密度接種于無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)48-72小時使得細(xì)胞達(dá)70% -90%匯合，收集新鮮的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)上清液；
[0016](2)在4°C下以3000-5000g離心15_40min，除去培養(yǎng)上清液中懸浮的細(xì)胞以及細(xì)胞碎片；
[0017](3)將經(jīng)步驟⑵得到的上清液在4°C下以lOOOOg離心30_60min，除去上清液中的細(xì)胞質(zhì)及其他雜質(zhì)；
[0018](4)將經(jīng)步驟(3)得到的上清液過0.22 μ m微濾膜除菌；
[0019](5)將經(jīng)步驟(4)得到的濾過液移入3KD的超濾濃縮管中，在4°C下以3000_4500g離心60-90min，將濾過液濃縮至其體積的1/20至1/50 ；
[0020](6)將經(jīng)步驟(5)得到的濃縮液以PBS緩沖液調(diào)節(jié)終體積為步驟⑴中收集的細(xì)胞培養(yǎng)上清液的1/20。
[0021]在步驟⑴中，人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(hUC-MSCs)優(yōu)選為從自然分娩或剖宮產(chǎn)的健康新生兒新鮮臍帶組織分離出的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞。
[0022]并且優(yōu)選地，步驟(1)中的無血清培養(yǎng)基含有a-MEM/DMEM_F12、β -巰基乙醇、非必需氨基酸、重組人堿性成纖維生長因子(b-FGF)和任選的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)上清濃縮液；優(yōu)選包含0.05-0.2體積份的β -巰基乙醇、0.5-2體積份的非必需氨基酸水溶液、任選的4-6體積份的培養(yǎng)上清濃縮液、90-95體積份的a-MEM/DMEM-F12和終濃度為5-15ng/ml的重組人堿性成纖維生長因子，其中，所述非必需氨基酸水溶液包含濃度各為8-12mM的甘氨酸、丙氨酸、L-天門酰胺、L-天冬氨酸、谷氨酸、脯氨酸和絲氨酸；更優(yōu)選包含
0.1體積份的β -巰基乙醇、1體積份的非必需氨基酸水溶液、任選的5體積份的培養(yǎng)上清濃縮液、94體積份的a-MEM/DMEM-F12和終濃度為10ng/ml的重組人堿性成纖維生長因子。
[0023]所述無血清培養(yǎng)基通過包括以下步驟的制備方法制得:
[0024]收集人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)上清液，離心，微濾膜過濾，超濾濃縮，得到培養(yǎng)上清濃縮液；
[0025]采用β -巰基乙醇、非必需氨基酸和a-MEM/DMEM_F12配制預(yù)混液；
[0026]將培養(yǎng)上清濃縮液、預(yù)混液和重組人堿性成纖維生長因子混合。
[0027]其中，所述培養(yǎng)上清濃縮液優(yōu)選通過包括以下步驟的方法制得:
[0028](1)將人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞以0.5-4X 104個細(xì)胞/cm 2的密度接種于無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)48-72小時使得細(xì)胞達(dá)70% -90%匯合，收集新鮮的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)上清液；
[0029](2)在4°C下以3000-4500g離心15_40min，除去培養(yǎng)上清液中懸浮的細(xì)胞以及細(xì)胞碎片；
[0030] (3)將經(jīng)步驟⑵得到的上清液在4°C下以lOOOOg離心30_60min，除去上清液中的細(xì)胞質(zhì)及其他雜質(zhì)；
[0031 ] (4)將經(jīng)步驟(3)得到的上清液過0.22 μ m微濾膜除菌；
[0032](5)將經(jīng)步驟(4)得到的濾過液移入3KD的超濾濃縮管中，在4°C下以3000_4500g離心60-90min，將濾過液濃縮至其體積的1/20至1/50 ；
[0033](6)將經(jīng)步驟(5)得到的濃縮液以PBS緩沖液調(diào)節(jié)終體積為步驟⑴中收集的細(xì)胞培養(yǎng)上清液的1/20。
[0034]本發(fā)明提供的試劑盒用于培養(yǎng)細(xì)胞、特別是干細(xì)胞，因此還提供所述試劑盒在干細(xì)胞培養(yǎng)、優(yōu)選無血清培養(yǎng)中的用途。其中，本發(fā)明所述干細(xì)胞從哺乳動物、例如人的組織或器官中分離得到，所述組織或器官為骨髓、臍帶和脂肪中的一種或多種；優(yōu)選地，所述干細(xì)胞為哺乳動物來源的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，更優(yōu)選為人來源的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞；進(jìn)一步優(yōu)選地，所述干細(xì)胞是從自然分娩或剖