一種從臍帶外層羊膜組織中分離培養(yǎng)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的穩(wěn)定分離提取方法，特別是從臍帶外層羊膜組織中分離培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSC)是干細(xì)胞家族的重要成員，來(lái)源于發(fā)育早期的中胚層和外胚層，存在于全身結(jié)締組織和器官間質(zhì)中。MSC于20世紀(jì)70年代末首次發(fā)現(xiàn)于骨髓中，然而直到上個(gè)世紀(jì)90年代，MSC多向分化潛能被人們認(rèn)識(shí)后，這種干細(xì)胞才受到越來(lái)越多的關(guān)注。
[0003]間充質(zhì)干細(xì)胞屬于多能干細(xì)胞，目前已有研究表明，MSC可以經(jīng)誘導(dǎo)分化為脂肪、骨、骨韌帶、神經(jīng)、肝、心肌、內(nèi)皮、胰島等多種組織細(xì)胞以及類(lèi)細(xì)胞；并且發(fā)現(xiàn)，間充質(zhì)干細(xì)胞在免疫抑制、內(nèi)分泌系統(tǒng)調(diào)節(jié)、神經(jīng)系統(tǒng)調(diào)節(jié)以及心血管功能改善等方面均具有明顯的功效。
[0004]目前對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞的提取研究也已較為廣泛，包括從脂肪、骨髓、羊水、胎盤(pán)、臍帶組織、臍帶血、牙周等人體多種組織和器官中進(jìn)行提取。其中臍帶來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞由于生長(zhǎng)環(huán)境單一、體外提取方便，使得提取的間充質(zhì)干細(xì)胞純度高、數(shù)量大，可以成為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的理想替代物，具有更廣闊的臨床應(yīng)用潛能。
[0005]鑒于臍帶多能干細(xì)胞的多向分化潛能以及在疾病治療領(lǐng)域的應(yīng)用潛力，目前國(guó)內(nèi)市場(chǎng)的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的存儲(chǔ)業(yè)務(wù)具有廣闊的前景，因此，如何高效規(guī)范的保證干細(xì)胞的分離提取率，以及保證干細(xì)胞優(yōu)質(zhì)，從而滿足未來(lái)干細(xì)胞移植的臨床需求，是目前國(guó)內(nèi)干細(xì)胞存儲(chǔ)業(yè)務(wù)亟待解決的問(wèn)題。
[0006]目前臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞多采用酶消化法和組織貼壁法來(lái)制備，然而在分離提取過(guò)程中，紅細(xì)胞的干擾是影響臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞質(zhì)量和數(shù)量的重要因素，大量紅細(xì)胞的存在使得間充質(zhì)干細(xì)胞的生長(zhǎng)空間受限，同時(shí)影響干細(xì)胞的活力狀態(tài)，對(duì)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分離提取與開(kāi)發(fā)利用造成了很大的影響。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的是針對(duì)本領(lǐng)域的需要，提供一種能夠克服紅細(xì)胞干擾的改進(jìn)的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分離提取方法。
[0008]本發(fā)明的另一目的是提供通過(guò)本發(fā)明的方法獲得的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞。
[0009]具體而言，本發(fā)明針對(duì)目前國(guó)內(nèi)外人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的提取現(xiàn)狀，利用紅細(xì)胞裂解液并采取懸浮培養(yǎng)從新鮮臍帶外層羊膜組織中分離原代間充質(zhì)干細(xì)胞，利用無(wú)血清培養(yǎng)體系原代培養(yǎng)并進(jìn)行穩(wěn)定傳代，以提高臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的分離提取成功率和細(xì)胞純度，為人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的臨床應(yīng)用提供可能。
[0010]本發(fā)明的技術(shù)方案如下。
[0011]—方面，本發(fā)明提供了從新鮮臍帶離體組織外層羊膜中分離和提取間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，其為一種分離培養(yǎng)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，所述方法包括:采用紅細(xì)胞裂解液處理從臍帶分離的外層羊膜組織，并采用間充質(zhì)干細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。
[0012]本發(fā)明采用的紅細(xì)胞裂解液為包含NH4C1和Na2-EDTA的水溶液，優(yōu)選為包含
l-20g/L 的 NH4C1 和 0.05-0.2mM Na2-EDTA 的水溶液，更優(yōu)選為包含 5_10g/L 的 NH4C1 和0.1mM Na2-EDTA的水溶液，pH為7.2-7.4。在使用之前，過(guò)0.22 μ m微濾膜，平衡至室溫。
[0013]本發(fā)明采用的間充質(zhì)干細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基包含a-MEM/DMEM_F12、β -巰基乙醇、非必需氨基酸、重組人堿性成纖維生長(zhǎng)因子(b-FGF)和血清替代物。
[0014]優(yōu)選地，所述間充質(zhì)干細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基包含0.05-0.2體積份的β -巰基乙醇、
0.5-2體積份的非必需氨基酸水溶液、8-12體積份的血清替代物、85-95體積份的a_MEM/DMEM-F12和終濃度為5-15ng/ml的重組人堿性成纖維生長(zhǎng)因子，其中所述非必需氨基酸水溶液包含濃度各為8-12mM的甘氨酸、丙氨酸、L-天門(mén)酰胺、L-天冬氨酸、谷氨酸、脯氨酸和絲氨酸；更優(yōu)選地，所述間充質(zhì)干細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基包含0.1體積份的β-巰基乙醇、1體積份的非必需氨基酸水溶液、10體積份的血清替代物、89體積份的a-MEM/DMEM-F 12和終濃度為10ng/ml的重組人堿性成纖維生長(zhǎng)因子；最優(yōu)選地，所述間充質(zhì)干細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基由所述a-MEM/DMEM-F12、β -巰基乙醇、非必需氨基酸水溶液、重組人堿性成纖維生長(zhǎng)因子和血清替代物組成。
[0015]根據(jù)本申請(qǐng)的【具體實(shí)施方式】，所述非必需氨基酸水溶液可以采用Gibco公司貨號(hào)為11140的產(chǎn)品。
[0016]根據(jù)本申請(qǐng)的【具體實(shí)施方式】，所述血清替代物可以采用KnockOut?SerumReplacement (Gibco 公司產(chǎn)品，貨號(hào) 10828-010)。
[0017]本發(fā)明的方法具體包括:將獲得的外層羊膜組織分割成組織塊，加入1-3倍組織塊體積的所述紅細(xì)胞裂解液，室溫下處理2-5分鐘；然后采用間充質(zhì)干細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)獲得的外層羊膜組織塊，以獲得原代間充質(zhì)干細(xì)胞。
[0018]優(yōu)選地，所述方法包括:將經(jīng)清洗的臍帶外層羊膜組織剪成1-3_3大小的組織塊，加入1.5-2倍組織塊體積的紅細(xì)胞裂解液，室溫下處理2-5分鐘；然后將獲得的組織塊均勻鋪在培養(yǎng)皿中達(dá)60-80%的覆蓋，加入3-5倍組織塊體積的間充質(zhì)干細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基，在37°C和5%濃度的0)2下培養(yǎng)，3-5天時(shí)半量更換新鮮培養(yǎng)基，5-15天時(shí)待組織塊下均勻爬出細(xì)胞后，去掉組織塊，全量更換新鮮間充質(zhì)干細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，此后每3-4天進(jìn)行一次新鮮培養(yǎng)基更換。
[0019]優(yōu)選地，所述方法包括以下步驟:
[0020](1)臍帶組織的預(yù)處理:
[0021]將新鮮臍帶分割成小段，去除血管淤血，縱向剖開(kāi)，剔除臍動(dòng)脈和臍靜脈，鈍性分離外層羊膜組織，加入PBS緩沖液清洗；
[0022](2)紅細(xì)胞裂解液處理:
[0023]將經(jīng)步驟(1)獲得的外層羊膜組織分割成組織塊，加入紅細(xì)胞裂解液處理，離心收集經(jīng)處理的組織塊，加入PBS緩沖液清洗；
[0024](3)原代培養(yǎng):
[0025]采用間充質(zhì)干細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)經(jīng)步驟(2)獲得的外層羊膜組織塊，以獲得原代間充質(zhì)干細(xì)胞；
[0026]優(yōu)選地，所述方法還包括以下步驟:
[0027](4)上清液檢測(cè):
[0028]取步驟⑶中培養(yǎng)細(xì)胞的上清液，檢測(cè)以下項(xiàng)目中的一種或多種:甲肝、乙肝、丙肝、梅毒、人類(lèi)免疫缺陷病毒、支原體、衣原體和內(nèi)毒素；
[0029](5)傳代培養(yǎng):
[0030]取步驟(4)中檢測(cè)項(xiàng)目為陰性的培養(yǎng)細(xì)胞，胰酶消化后離心收集細(xì)胞，傳代培養(yǎng)，收集細(xì)胞備用、凍存或繼續(xù)傳代；
[0031](6)細(xì)胞檢測(cè):
[0032]取步驟(5)中培養(yǎng)的細(xì)胞，檢測(cè)以下項(xiàng)目中的一種或多種:分化能力、細(xì)胞活性、細(xì)胞純度、細(xì)胞污染和增殖特性。
[0033]優(yōu)選地，所述步驟(1)包括:將新鮮臍帶分割成2-3cm長(zhǎng)的小段，去除血管中淤血，縱向剖開(kāi)，剔除臍動(dòng)脈和臍靜脈，鈍性分離外層羊膜組織，加入2-5倍體積的PBS緩沖液，輕微搖晃清洗；
[0034]優(yōu)選地，所述步驟⑵包括:
[0035]將經(jīng)清洗的外層羊膜組織剪成1-3_3大小的組織塊，加入1.5-2倍組織塊體積的紅細(xì)胞裂解液，室溫下處理2-5分鐘，離心收集組織塊，PBS緩沖液清洗2-3次；其中優(yōu)選地，所述離心為1000-1200rpm、4°C下離心6分鐘；
[0036]優(yōu)選地，所述步驟(3)包括:
[0037]將經(jīng)步驟(2)獲得的組織塊均勻鋪在培養(yǎng)皿中達(dá)60-80%、優(yōu)選70%的覆蓋，加入3-5倍組織塊體積的間充質(zhì)干細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基，在37°C和5%濃度的0)2下培養(yǎng)，3-5天時(shí)半量更換新鮮培養(yǎng)基，5-15天、優(yōu)選7-10天時(shí)待組織塊下均勻爬出細(xì)胞后，去掉組織塊，全量更換新鮮間充質(zhì)干細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，此后每3-4天進(jìn)行一次新鮮培養(yǎng)基更換；
[0038]優(yōu)選地，所述步驟(4)包括:
[0039]取步驟(3)中培養(yǎng)細(xì)胞的上清液，檢測(cè)以下項(xiàng)目中的全部:甲肝、乙肝、丙肝、梅毒、人類(lèi)免疫缺陷病毒、支原體、衣原體和內(nèi)毒素；
[0040]優(yōu)選地，所述步驟(5)包括:
[0041]取步驟(4)中全部檢測(cè)項(xiàng)目為陰性的培養(yǎng)細(xì)胞，待貼壁細(xì)胞匯合率達(dá)30-80%、優(yōu)選40-50%時(shí)，胰酶消化后離心收集細(xì)胞，采用間充質(zhì)干細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)至匯合率達(dá)50-90 %、優(yōu)選80-90 %，收集細(xì)胞備用、凍存或繼續(xù)傳代；其中優(yōu)選地，所述胰酶的使用濃度為質(zhì)量百分比為0.125%，消化1-2分鐘，消化過(guò)程中輕拍培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶側(cè)壁；并且其中優(yōu)選地，所述離心為1000-1200rpm、4°C下離心6分鐘；
[0042]優(yōu)選地，將收集的細(xì)胞以2-3X 106細(xì)胞/ml的密度冷凍保存在_196°C液氮中；或者優(yōu)選地，將收集的細(xì)胞以1:3-1:4的比率進(jìn)行細(xì)胞傳代；
[0043]優(yōu)選地，所述步驟(6)包括:
[0044]取步驟(5)中培養(yǎng)的細(xì)胞，檢測(cè)以下項(xiàng)目中的全部:分化能力、細(xì)胞活性、細(xì)胞純度、細(xì)胞污染和增殖特性。
[0045]優(yōu)選地，所述方法中在步驟(1)之前還進(jìn)行臍帶清洗、保存和使用前處理，優(yōu)選包括:
[0046]無(wú)菌條件下采集自然分娩或剖宮產(chǎn)的健康新生兒臍帶組織，經(jīng)表面無(wú)菌生理鹽水清洗后，放入臍帶保存運(yùn)輸液中，優(yōu)選在6小時(shí)內(nèi)冰上運(yùn)輸至潔凈細(xì)胞實(shí)驗(yàn)室；在使用前，將新鮮臍帶以75%乙醇水溶液沖洗2-3遍，再用無(wú)菌生理鹽水沖洗3-5次；
[0047]其中優(yōu)選地，所述臍帶保存運(yùn)輸液為包含注射用青霉素鈉、硫酸鏈霉素、慶大霉素和兩性霉素B的無(wú)鈣鎂D-Hank’s液；更優(yōu)選地，其中所述青霉素鈉、硫酸鏈霉素和慶大霉素的濃度為100-200U/mL，優(yōu)選150U/ml ;兩性霉素B的濃度為200_400U