可降解人羊膜與牛背腱復(fù)合的硬腦膜修補(bǔ)支架及制備方法
【專利摘要】可降解人羊膜與牛背腱復(fù)合的硬腦膜修補(bǔ)支架的制備方法，(1)制備羊膜；(2)制備牛背腱腱片；(3)羊膜與牛背腱腱片的無毒交聯(lián)。人羊膜與牛背腱腱片復(fù)合的硬腦膜修補(bǔ)支架，包括制備得到的羊膜和牛背腱腱片，通過無毒交聯(lián)得到的人羊膜與牛背腱腱片復(fù)合的硬腦膜修補(bǔ)支架。羊膜處理方法符合國家標(biāo)準(zhǔn)，能保留羊膜的生物活性功能；牛背腱腱片的制備與其他膠原膜的制備方法不同，既去除了細(xì)胞、核酸等免疫原性物質(zhì)，又沒有破壞天然牛背腱膠原的結(jié)構(gòu)，使其力學(xué)性能得以保留，而且生物安全性得到提高。兩種天然的膠原膜經(jīng)無毒交聯(lián)、并冷凍干燥后，其各項(xiàng)性能滿足硬腦膜修補(bǔ)的臨床要求。
【專利說明】
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種硬腦膜修補(bǔ)支架，具體來說是一種可降解人羊膜與牛背腱復(fù)合的 硬腦膜修補(bǔ)支架及制備方法。 可降解人羊膜與牛背腱復(fù)合的硬腦膜修補(bǔ)支架及制備方法

【背景技術(shù)】
[0002]硬腦膜是保護(hù)腦組織的一道重要屏障，是一厚而堅(jiān)鋇的雙層膜。硬腦膜的外層是 顱骨內(nèi)面的骨膜，疏松地附于顱蓋，特別是在枕部與顳部附著更疏松，稱為骨膜層；內(nèi)層較 外層厚而堅(jiān)軔，與硬脊膜在枕骨大孔處續(xù)連，稱為腦膜層。創(chuàng)傷、腫瘤侵蝕及手術(shù)等因素均 可造成硬腦膜缺損，必須進(jìn)行修補(bǔ)，以防止腦脊液漏、顱內(nèi)感染和腦皮層粘連引起癲癇等并 發(fā)癥。
[0003]目前硬腦膜修補(bǔ)臨床處理方式有兩種：1.縫合式，用人工硬腦膜修補(bǔ)材料（如"腦 膜衛(wèi)士"，是由牛心包加工而成的）直接縫合缺損處，與自身腦膜縫合在一起，此方法適合小 的漏口，對于急性高顱壓腦疝減壓后腦膨出的病人，縫合操作困難，容易在縫合時傷及腦組 織。 2·貼覆式，用人工硬腦膜修補(bǔ)材料（如膠原蛋白海綿）直接貼覆在缺損處，臨床存在貼 覆不嚴(yán)，腦脊液滲漏，易形成腦膜外積液。
[0004]研究表明，人的硬腦膜每一平方毫米能承受37kg左右的抗張力強(qiáng)度，能承受各種 型號縫線的縫合張力。理想的硬腦膜修補(bǔ)支架應(yīng)包括以下質(zhì)量要素：（1)具有促進(jìn)組織再 生修復(fù)功能；（2)經(jīng)過縫合后，能夠做到縫合致密不透水，防止腦脊液滲漏，保護(hù)腦組織； ( 3)能夠杜絕傳遞潛在的已知或未知感染；(4)使用安全，無排斥反應(yīng)，無毒性反應(yīng)，無致 癌、致畸作用；(5)能夠在新生組織生成以后被完全吸收；( 6)容易保存，手術(shù)前準(zhǔn)備簡單 方便；(7)材料來源方便；(8)價(jià)格相對適中。
[0005] 創(chuàng)傷、腫瘤侵蝕及手術(shù)等因素均可造成硬腦膜缺損，術(shù)后可發(fā)生腦脊液滲漏、盧頁內(nèi) 感染和腦皮層粘連引起癲癇等并發(fā)癥。關(guān)于腦膜修補(bǔ)的文獻(xiàn)報(bào)道最早可以追溯到 1890年， 經(jīng)歷了從用金箔到筋膜，由人尸體腦膜到異種筋膜組織乃至人工合成的高分子聚合物材料 的發(fā)展歷程。
[0006] 目前用于修復(fù)硬腦膜的材料主要有自體筋膜（自體膜材取材有限、引起二次創(chuàng) 傷、強(qiáng)度較硬腦膜差）、同種異體材料（尸體硬腦膜）、異種材料（常見牛心包、豬心包）、天 然及人工合成材料等四類，前兩類替代材料移植后效果相對較好，由于來源有限，限制了 其臨床中廣泛應(yīng)用。后兩類替代物取材方便可以在一定程度上有效地緩解同種供體移植材 料的短缺。
[0007] 近年來國內(nèi)在臨床上應(yīng)用較多的產(chǎn)品是：生物型人工硬腦膜--膠原蛋白海:綿， 主要由I型I父原蛋白凝I父經(jīng)冷凍千燥后制得；去抗原處理后的異種生物材料-"腦膜衛(wèi) 士"（經(jīng)戊二醛處理的牛心包產(chǎn)品）等，有成為主流產(chǎn)品的趨勢。但是由于膠原蛋白海綿 通常是將動物肌腱經(jīng)酸、堿或酶水解成膠原凝膠,再經(jīng)冷凍干燥成海綿狀膠原生物膜，其I逢 合性能、機(jī)械性能較差，且降解速度太快，不能作為常規(guī)材料普遍用于硬腦膜修補(bǔ)術(shù)7 $其 是在硬腦膜缺損較大、腦壓較高的情況下不能使用。同時"腦膜衛(wèi)士，，在制備過程中， 戊二醛組織處理技術(shù)在去掉異種蛋白抗原性的同時，材料中不斷出現(xiàn)的少量醛基，引入了 殘留毒性，不易在附加的后續(xù)處理中徹底清除，這類毒性雖然強(qiáng)度較低，但持續(xù)時間很長， 幾乎與材料的植入壽命相當(dāng)，雖然微弱的殘留毒性在纖維結(jié)締組織形成囊壁后不明顯影響 組織相容性，它卻阻礙細(xì)胞向植入組織的遷移，難以代謝和進(jìn)一步同化植入組織，不利于組 織修復(fù)。
[0008] 再生性修復(fù)是生物醫(yī)學(xué)發(fā)展的趨勢，不僅要求材料具有良好的組織相容性和理想 的機(jī)械特性，還要允許自體細(xì)胞長入其中，逐漸代謝修補(bǔ)材料并形成有功能的新生組織。 目前的替代型硬腦膜修補(bǔ)材料均未達(dá)到這一要求。
[0009] 羊膜作為一種寶貴的自然資源，具有優(yōu)良的生物學(xué)性狀，開發(fā)應(yīng)用前景廣闊。研究 表明，人羊膜上皮細(xì)胞具有明顯的可塑性和多向分化潛能，在不同生長因子的調(diào)節(jié)下，可分 化為肝樣細(xì)胞、心肌樣細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)元細(xì)胞和胰島樣細(xì)胞等多種組織細(xì)胞，在 細(xì)胞替代治療及組織再生醫(yī)學(xué)上有廣闊的應(yīng)用前景。羊膜纖維基質(zhì)中含有多種調(diào)節(jié)細(xì)胞活 性、促進(jìn)損傷組織修復(fù)愈合的生物活性物質(zhì)，包括多種酶、活性蛋白、細(xì)胞因子等。羊膜基質(zhì) 層的隔離作用及多種細(xì)胞因子、生物活性蛋白共同發(fā)揮保護(hù)創(chuàng)面、防止粘連、抑制局部炎癥 反應(yīng)、促進(jìn)損傷區(qū)域組織細(xì)胞修復(fù)增生等生物學(xué)作用，是一種理想的生物修復(fù)支架材料。 [0010]國內(nèi)外羊膜的臨床應(yīng)用范圍在不斷拓展，不僅可以用于眼表重建，還可以用于促 進(jìn)肌腱損傷修復(fù)，促進(jìn)周圍神經(jīng)再生修復(fù)，促進(jìn)骨膜生長及骨愈合，燒傷外科、整形外科、婦 科、泌尿外科等重建黏膜和皮膚組織，在干細(xì)胞研究及組織工程研究領(lǐng)域的應(yīng)用也取得了 可喜成果。但是單獨(dú)的人羊膜作為硬腦膜修復(fù)材料存在力學(xué)性能不達(dá)臨床要求的問題。 [0011] 綜上所述，現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷在于：
[0012] 1.采用小腸粘膜下層（約〇· 08mm)與人羊膜（約0· 05mm)的組合，厚度與硬腦膜 相差較大，縫合性能、機(jī)械性能較差達(dá)不到臨床應(yīng)用的要求；
[0013] 2·在牛心包或豬心包膜上貼附一層培育成活的自體血管內(nèi)皮細(xì)胞或新生兒臍靜 脈內(nèi)皮細(xì)胞，這些活細(xì)胞的培養(yǎng)、保存條件和手術(shù)前準(zhǔn)備要求較高，使用不方便，產(chǎn)品的生 產(chǎn)工藝、生產(chǎn)成本及商品流通成本也都相應(yīng)提高；
[0014] 3.膠原海綿是以動物肌腱膠原為原料，但其制作中膠原蛋白經(jīng)過酸或堿處理后發(fā) 生部分水解,膠原纖維的結(jié)構(gòu)發(fā)生了很大的變化，其力學(xué)性能不如天然狀態(tài)的好；
[0015] 4.合成高分子材料的力學(xué)性能可以滿足硬腦膜修補(bǔ)的臨床要求，但其生物學(xué)性能 包括組織再生修復(fù)、生物相容性等都不如天然高分子材料。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0016] 本發(fā)明的目的是為了解決現(xiàn)有技術(shù)中硬腦膜修補(bǔ)材料所存在的缺陷，提供一種可 降解人羊膜與牛背腱復(fù)合的硬腦膜修補(bǔ)支架及制備方法來解決上述問題。
[0017] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下：
[0018]可降解人羊膜與牛背腱復(fù)合的硬腦膜修補(bǔ)支架的制備方法，其特征在于，包括以 下步驟：
[0019] (1)制備羊膜：按國家標(biāo)準(zhǔn)（YZB/國0593-2005)進(jìn)行羊膜取材和制備；
[0020] ⑵制備牛背腱腱片：新鮮牛背腱用生產(chǎn)工藝用水清洗、用濃度為0. 1% -0. 5% 的過氧乙酸浸泡消毒1-21^，再用去離子水清洗；用1%-5%的鹽水浸泡1-2111'后，置 于-20?--40°C的溫度進(jìn)行冷凍，沿牛背腱纖維走向縱向切成腱片；將腱片置-20°C - -40°C冷凍后取出放入20°C -40°C的清水中融化加漂洗，如此反復(fù)凍融2-5次后，用核酸酶 包括：濃度為100-2〇〇U/mL的DNase和濃度為50-150U/mL的RNase處理，溫度為20-45°C， 搖床震蕩8-24小時后，經(jīng)PBS緩沖液清洗3-5次至ρΗ6· 5-7. 5,制得牛背腱腱片，置4-8°C 的環(huán)境下冷藏備用；
[0021] (3)羊膜與牛背腱腱片的無毒交聯(lián)：將上述羊膜和牛背肌腱膠原膜經(jīng)PBS緩沖液 或生理鹽水浸潤5-10分鐘后，將羊膜的上皮層朝下進(jìn)行平鋪，再將上述處理好的牛背腱 腱片鋪在羊膜上，將羊膜和牛背腱腱片置于無毒交聯(lián)劑中，交聯(lián)劑包括：分子量在15〇〇- 5000的糖蛋白，碳原子數(shù)30以下的羥基脂肪酸，經(jīng)20-60分鐘，25°C _37°C，PH4. 5-7. 5的 交聯(lián)浴后，棄去溶液，并用去離子水反復(fù)漂洗2-5次，控干水后冷凍千燥，包裝、滅菌，制得 人羊膜與牛背腱腱片復(fù)合的硬腦膜修補(bǔ)支架。
[0022] 上述的可降解人羊膜與牛背腱復(fù)合的硬腦膜修補(bǔ)支架的制備方法，其特征在于， 所述步驟（3)中牛背腱腱片包括兩層，兩層牛背腱腱片按照肌腱膠原蛋白纖維走向的橫縱 向交叉疊在一起，然后再將疊好的兩層牛背腱腱片鋪在羊膜上。
[0023] 上述的可降解人羊膜與牛背腱復(fù)合的硬腦膜修補(bǔ)支架的制備方法，其特征在于， 所述步驟（3)中在牛背腱腱片的上面再覆蓋一層羊膜上皮層朝上的羊膜。
[0024] 上述的可降解人羊膜與牛背腱復(fù)合的硬腦膜修補(bǔ)支架的制備方法，其特征在于， 所述步驟（2)中的過氧乙酸的濃度為0. 2%，并且濃度為0. 2%的過氧乙酸中內(nèi)含5%無水 乙醇；核酸酶的溫度為37? ;將制得的牛背腱腱片，置4?的環(huán)境下冷藏備用。
[0025] 上述的可降解人羊膜與牛背腱復(fù)合的硬腦膜修補(bǔ)支架的制備方法，其特征在于， 所述步驟（2)中腱片的厚度為0. 3-0. 5mm,長度為：l〇-l〇〇mm，寬度為：10-50mm。
[0026] 上述的可降解人羊膜與牛背腱復(fù)合的硬腦膜修補(bǔ)支架的制備方法，其特征在于， 所述步驟（3)中在平鋪羊膜時，在羊膜下方鋪墊0.45 μ m微孔的硝酸纖維素濾紙。
[0027] 可降解人羊膜與牛背腱復(fù)合的硬腦膜修補(bǔ)支架，其特征在于，包括通過上述制備 得到的羊膜和牛背腱腱片，通過無毒交聯(lián)得到的人羊膜與牛背腱腱片復(fù)合的硬腦膜修補(bǔ)支 架。
[0028] 上述的可降解人羊膜與牛背腱復(fù)合的硬腦膜修補(bǔ)支架，其特征在于，牛背腱腱片 包括兩層，兩層牛背腱腱片按照肌腱膠原蛋白纖維走向的橫縱向交叉疊在一起，然后再將 疊好的兩層牛背腱腱片鋪在羊膜上。
[0029] 上述的可降解人羊膜與牛背腱復(fù)合的硬腦膜修補(bǔ)支架，其特征在于，牛背腱腱片 的上再覆蓋一層羊膜上皮層朝上的羊膜。
[0030] 本發(fā)明的有益效果為：采用人羊膜和牛背腱腱片經(jīng)無毒交聯(lián)復(fù)合的硬腦膜修補(bǔ)支 架,羊膜處理方法符合國家標(biāo)準(zhǔn)，能保留羊膜的生物活性功能；牛背腱腱片的制備與其他膠 原膜的制備方法不同，既去除了細(xì)胞、核酸、脂肪等免疫原性物質(zhì)，又沒有破壞天然牛背腱 膠原的結(jié)構(gòu)，使其力學(xué)性能得以保留，而且生物安全性得到提高。兩種天然的膠原膜經(jīng)無毒 交聯(lián)、并冷凍干燥后，其各項(xiàng)性能滿足硬腦膜修補(bǔ)的臨床要求。具體包括：1、牛背腱腱片的 制備方法，采用了高滲鹽液浸泡加反復(fù)凍融使細(xì)胞破裂，再結(jié)合酶法破壞核酸類物質(zhì)，通過 本處理既可以去除牛背腱的免疫原性，又能盡量保留天然牛背腱膠原原有的結(jié)構(gòu)及其力學(xué) 性能； 2、兩種膠原膜的復(fù)合采用了無毒交聯(lián)浴加冷凍干燥的方法，使產(chǎn)品的生物安全性增 加，牛背腱腱片的制備方法和排列組合方式，使本發(fā)明產(chǎn)品的力學(xué)性能更佳·3、人羊膜與牛 背鍵膠原膜的組合，既保留了人羊膜優(yōu)良的生物學(xué)性能，特別是再生修復(fù)性能;又增加了牛 背腱腱片的力學(xué)性能，使其能滿足硬腦膜修補(bǔ)材料的臨床需

【專利附圖】

【附圖說明】
[0031] 圖1為本發(fā)明實(shí)施例1的結(jié)構(gòu)示意圖；
[0032] 圖2為本發(fā)明實(shí)施例2的結(jié)構(gòu)示意圖；
[0033] 圖3為本發(fā)明實(shí)施例3的結(jié)構(gòu)示意圖。

【具體實(shí)施方式】
[0034]為使對本發(fā)明的結(jié)構(gòu)特征及所達(dá)成的功效有更進(jìn)一步的了解與認(rèn)識，用以較佳的 實(shí)施例及附圖配合詳細(xì)的說明，說明如下：
[0035]可降解人羊膜與牛背腱復(fù)合的硬腦膜修補(bǔ)支架的制備方法，包括以下步驟：
[0036] (1)制備羊膜：按國家標(biāo)準(zhǔn)（ΥΖΒ/國0593-2005)進(jìn)行羊膜取材和制備；在人羊膜 的制作中，可保留羊膜上皮細(xì)胞或用酶解法去除上皮細(xì)胞； '
[0037] (2)制備牛背腱腱片：利用反復(fù)冷凍與融化，使材料中的細(xì)胞形成冰晶，剩余胞 液的鹽濃度增高而引起細(xì)胞溶脹破碎，改變材料及細(xì)胞表面抗原從而顯著降低生物材料 的抗原性。研究表明，反復(fù)凍融結(jié)合酶處理0. 3mm的肌腱薄片，脫細(xì)胞效果好，膠原不會 發(fā)生崩解，肌腱膠原纖維的天然三維結(jié)構(gòu)及原有力學(xué)性能較大程度得到保留，拉伸強(qiáng)度為 17-29MPa(正常成人臥位時腦脊液壓力為〇· 78?1. 76kpa)，約可保留原始強(qiáng)度的90%。 [0038]具體的方式為：新鮮牛背腱用生產(chǎn)工藝用水清洗、用濃度為〇. 1% -〇. 5%的過氧 乙酸浸泡消毒1-2hr，再用去離子水清洗；用1% -5%的鹽水浸泡l-2hr后，置于-2(TC - -40°C的溫度進(jìn)行冷凍，沿牛背腱纖維走向縱向切成腱片；然后將將腱片置-20一-4〇。〇冷 凍后取出放入 2〇°C -40°C的清水中融化加漂洗，如此反復(fù)凍融2-5次后，用核酸酶包括：濃 度為100-2〇OU/mL的DNase和濃度為 5〇-l5〇U/mL的RNase處理，溫度為25-4(TC,搖床震蕩 12-24小時后，經(jīng)PBS緩沖液清洗3-5次至ρ--6. 5-7· 5,制得牛背腱腱片，置5-8?的環(huán)境下 冷藏備用；
[0039] (3)羊膜與牛背腱腱片的無毒交聯(lián)：將上述羊膜和牛背肌腱膠原膜經(jīng)浸潤5_ 10分 鐘后，將羊膜的上皮層朝下進(jìn)行平鋪，再將上述處理好的牛背腱腱片鋪在羊膜上，將羊膜和 牛背腱腱片置于無毒交聯(lián)劑中，交聯(lián)劑包括：分子量在1500- 5000的糖蛋白，碳原子數(shù)30 以下的羥基脂肪酸，經(jīng)20_6〇分鐘，25°C -37?，ΡΗ4. 5-7. 5的交聯(lián)浴后，棄去溶液，并用去離 子水反復(fù)漂洗2-5次，控干水后冷凍干燥，包裝、滅菌，制得人羊膜與牛背腱腱片復(fù)合的硬 腦膜修補(bǔ)支架。
[0040]兩種f然膠原蛋白都為細(xì)胞外基質(zhì)，其表面具有糖胺聚糖，以多糖鏈形式出現(xiàn)，糖 ，具有許多游離的羥基、羧基、或硫酸基，在電解質(zhì)溶液中帶負(fù)電荷，能夠吸引正電荷，如鈉 離子等，這些陽離子再結(jié)合大量水分子，糖胺聚糖吸水膨脹，具有較大粘稠性；糖胺聚糖的 毛刷狀結(jié)構(gòu)，經(jīng)（輕度）高滲條件處理，部分釋放出分子中結(jié)合水糖胺聚糖收縮，毛刷狀結(jié) 構(gòu)相互鉸接形成黏附，使羊膜與背肌腱形成機(jī)械連接；再經(jīng)雙功能交聯(lián)劑（氨基酸、羥基脂 肪酸）作用，多糖與多糖、多糖與膠原蛋白形成0-0或/和0-N等糖苷鍵共價(jià)連接。機(jī)械結(jié) 合與共價(jià)結(jié)合再經(jīng)過冷凍干燥，使羊膜與肌腱產(chǎn)生非常穩(wěn)定的黏結(jié)。
[0041] 考慮到肌腱膠原蛋白纖維平行排列，橫向抗張力水平低于縱向抗張水平，而硬腦 膜纖維走向多種多樣（以弓狀、放射狀、縱行和斜行纖維為主），臨床縫合處存在多個方向 張力，在本發(fā)明的其中另一個優(yōu)選實(shí)施方式中，步驟（3)中牛背腱腱片包括兩層，兩層牛背 腱腱片按照肌腱膠原蛋白纖維走向的橫縱向交叉疊在一起，然后再將疊好的兩層牛背腱腱 片鋪在羊膜上；在本發(fā)明的其中再一個優(yōu)選實(shí)施方式中，所述步驟（ 3)中在牛背腱腱片的 上再覆蓋一層羊膜上皮層朝上的羊膜。
[0042] 在步驟（2)中的過氧乙酸的濃度為0.2%，并且濃度為0.2%的過氧乙酸中內(nèi)含 5%無水乙醇；核酸酶的酶解溫度為37°C ;將制得的牛背腱腱片，置4°C的環(huán)境下冷藏備用。
[0043] 步驟⑵中腱片的厚度為0· 3-0. 5_，長度為：10-100mm，寬度為：10-50謹(jǐn)。
[0044] 步驟（3)中在平鋪羊膜時，在羊膜下方鋪墊0.45 μ m微孔的硝酸纖維素濾紙。
[0045] 本發(fā)明中的可降解人羊膜與牛背腱復(fù)合的硬腦膜修補(bǔ)支架的制備方法相對于現(xiàn) 有技術(shù)來說，由于使用了牛背腱腱片作為羊膜的基層，為羊膜提供了足夠的張力，保證了其 能夠應(yīng)用于硬腦膜修補(bǔ)中。
[0046] 實(shí)施例1 :
[0047] 參看圖1，可降解人羊膜與牛背腱復(fù)合的硬腦膜修補(bǔ)支架，包括通過上述制備得到 的羊膜100和牛背腱腱片200,將羊膜100的上皮層朝下進(jìn)行平鋪，再將上述處理好的牛背 腱腱片200鋪在羊膜100上，通過無毒交聯(lián)得到的人羊膜與牛背腱腱片復(fù)合的硬腦膜修補(bǔ) 支架。
[0048] 實(shí)施例2 :
[0049] 參看圖2,可降解人羊膜與牛背腱復(fù)合的硬腦膜修補(bǔ)支架，包括通過上述制備得到 的羊膜100和牛背腱腱片200,牛背腱腱片200包括兩層，兩層牛背腱腱片200按照肌腱 膠原蛋白纖維走向的橫縱向交叉疊在一起，然后再將疊好的兩層牛背腱腱片200鋪在羊膜 100上，通過無毒交聯(lián)得到的人羊膜與牛背腱腱片復(fù)合的硬腦膜修補(bǔ)支架。（圖2還有一種 情況是上面再加一層羊膜，）
[0050] 實(shí)施例3 :
[0051]參看圖3,可降解人羊膜與牛背腱復(fù)合的硬腦膜修補(bǔ)支架，包括通過上述制備得 到的羊膜100和牛背腱腱片200,牛背腱腱片200的上再覆蓋一層羊膜上皮層朝上的羊膜 100,通過無毒交聯(lián)得到的人羊膜與牛背腱腱片復(fù)合的硬腦膜修補(bǔ)支架。
[0052]本發(fā)明的有益效果為：采用人羊膜和牛背腱腱片經(jīng)無毒交聯(lián)復(fù)合的硬腦膜修補(bǔ)支 架，羊膜處理方法符合國家標(biāo)準(zhǔn)，能保留羊膜的生物活性功能；牛背腱腱片的制備與其他膠 原膜的制備方法不同，既去除了細(xì)胞、核酸等免疫原性物質(zhì)，又沒有破壞天然牛背腱膠原的 結(jié)構(gòu)，使其力學(xué)性能得以保留，而且生物安全性得到提高。兩種天然的膠原膜經(jīng)無毒交聯(lián)、 并冷凍千燥后，其各項(xiàng)性能滿足硬腦膜修補(bǔ)的臨床要求。具體包括：1、牛背腱腱片的制備方 法，采用了高滲鹽液浸泡加反復(fù)凍融使細(xì)胞破裂，再結(jié)合酶法破壞核酸類物質(zhì)，通過本處理 既可以去除牛背腱的免疫原性，又能盡量保留天然牛背腱膠原原有的結(jié)構(gòu)及其力學(xué)性能； 2、兩種膠原膜的復(fù)合采用了無毒交聯(lián)浴加冷凍干燥的方法，使產(chǎn)品的生物安全性增加，牛 背腱腱片的制備方法和排列組合方式，使本發(fā)明產(chǎn)品的力學(xué)性能更佳；3、人羊膜與牛背鍵 膠原膜的組合，既保留了人羊膜優(yōu)良的生物學(xué)性能，特別是再生修復(fù)性能，又增加了牛背腱 腱片的力學(xué)性能，使其能滿足規(guī)_膜修#材料的臨床需求。
[0053]以上顯示和描述了本發(fā)明的基本原理、主要特征和本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)。本行業(yè)的技術(shù) 人員應(yīng)該了解，本發(fā)明不受上述實(shí)施例的限制，上述實(shí)施例和說明書中描述的只是本發(fā)明 的原理，在不脫離本發(fā)明精神和范圍的前提下本發(fā)明還會有各種變化和改進(jìn)，這些變化和 改進(jìn)都落入要求保護(hù)的本發(fā)明的范圍內(nèi)。本發(fā)明要求的保護(hù)范圍由所附的權(quán)利要求書及其 等同物界定。
【權(quán)利要求】
1. 可降解人羊膜與牛背腱復(fù)合的硬腦膜修補(bǔ)支架的制備方法，其特征在于，包括以下 步驟： (1) 制備羊膜：按國家標(biāo)準(zhǔn)（YZB/國〇593_2〇05)進(jìn)行羊膜取材和制備； (2) 制備牛背腱腱片：新鮮牛背腱去除表面結(jié)締組織，用生產(chǎn)工藝用水清洗、用濃度 為0. 1% -0· 5%的過氧乙酸浸泡消毒l-2hr，再用去離子水清洗；用1% -5%的鹽水浸泡 l-2hr后，置于-20°C--40°C的溫度進(jìn)行冷凍，沿牛背腱纖維走向縱向切成腱片；將腱片 置-20°C --40?冷凍后取出放入20°C -40Γ的清水中融化加漂洗，如此反復(fù)凍融2-5次后， 用核酸酶包括：濃度為100-200U/mL的DNase和濃度為50-150U/mL的RNase處理，溫度為 20-45 °C，搖床震蕩8-24小時后，經(jīng)PBS緩沖液清洗3-5次至ρΗ6· 5-7. 5,制得牛背腱腱片， 保留了牛背腱膠原的天然結(jié)構(gòu)，置4-8?的環(huán)境下冷藏備用； (3) 羊膜與牛背腱腱片的無毒交聯(lián)：將上述羊膜和牛背肌腱膠原膜經(jīng)PBS緩沖液或生 理鹽水浸潤5-10分鐘后，將羊膜的上皮層朝下進(jìn)行平鋪，再將上述處理好的牛背腱腱片鋪 在羊膜上，將羊膜和牛背腱腱片置于無毒交聯(lián)劑中，交聯(lián)劑包括：分子量在1500- 5000的 糖蛋白，碳原子數(shù)30以下的羥基脂肪酸，經(jīng)20-60分鐘，25°C -37°C, ΡΗ4. 5-7. 5的交聯(lián)浴 后，棄去溶液，并用去離子水反復(fù)漂洗2-5次，控干水后冷凍干燥，包裝、滅菌，制得人羊膜 與牛背腱腱片復(fù)合的硬腦膜修補(bǔ)支架。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的可降解人羊膜與牛背腱復(fù)合的硬腦膜修補(bǔ)支架的制備方法， 其特征在于，所述步驟（3)中牛背腱腱片包括兩層，兩層牛背腱腱片按照肌腱膠原蛋白纖 維走向的橫縱向交叉疊在一起，然后再將疊好的兩層牛背腱腱片鋪在羊膜上。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的可降解人羊膜與牛背腱復(fù)合的硬腦膜修補(bǔ)支架的制備方法， 其特征在于，所述步驟（3)中在牛背腱腱片的上面再覆蓋一層羊膜上皮層朝上的羊膜。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的可降解人羊膜與牛背腱復(fù)合的硬腦膜修補(bǔ)支架的制備方 法，其特征在于，所述步驟（2)中的過氧乙酸的濃度為0. 2%，并且濃度為〇. 2%的過氧乙酸 中內(nèi)含5%無水乙醇；核酸酶的酶解溫度為37°C ;將制得的牛背腱腱片，置4Γ的環(huán)境下冷 藏備用。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的可降解人羊膜與牛背腱復(fù)合的硬腦膜修補(bǔ)支架的制備方法， 其特征在于，所述步驟（2)中腱片保留了牛背腱膠原的天然結(jié)構(gòu)，其厚度為〇·3-〇· 5mm，長 度為：10-100mm，寬度為：10-50mm。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的可降解人羊膜與牛背腱復(fù)合的硬腦膜修補(bǔ)支架的制備方法， 其特征在于，所述步驟（3)中在平鋪羊膜時，在羊膜下方鋪墊0.45 μ m微孔的硝酸纖維素濾 紙。
7. 可降解人羊膜與牛背腱復(fù)合的硬腦膜修補(bǔ)支架，其特征在于，包括通過上述制備得 到的羊膜和牛背腱腱片，通過無毒交聯(lián)得到的人羊膜與牛背腱腱片復(fù)合的硬腦膜修補(bǔ)支 架。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的可降解人羊膜與牛背腱復(fù)合的硬腦膜修補(bǔ)支架，其特征在 于，牛背腱腱片包括兩層，兩層牛背腱腱片按照肌腱膠原蛋白纖維走向的橫縱向交叉疊在 一起，然后再將疊好的兩層牛背腱腱片鋪在羊膜上。
9. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的可降解人羊膜與牛背腱復(fù)合的硬腦膜修補(bǔ)支架，其特征在 于，牛背腱腱片的上再覆蓋一層羊膜上皮層朝上的羊膜。
【文檔編號】A61L27/36GK104189955SQ201410389662
【公開日】2014年12月10日 申請日期:2014年8月8日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月8日
【發(fā)明者】苗春云, 傅筱沖, 滕志強(qiáng), 熊貞燕, 賀雅琳 申請人:苗九昌