肌纖維體外培養(yǎng)試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體來(lái)說(shuō)是一種肌纖維體外培養(yǎng)試劑盒，包括消化酶、D-Hanks液、肌細(xì)胞培養(yǎng)液A和肌細(xì)胞培養(yǎng)液B。本發(fā)明培養(yǎng)基可快速通過(guò)體外培養(yǎng)獲得骨骼肌肌纖維衛(wèi)星細(xì)胞，所培養(yǎng)的細(xì)胞形態(tài)均一，繁殖活力強(qiáng)，在分化誘導(dǎo)后具有融合成肌管得能力；利用本發(fā)明試劑盒進(jìn)行體外培養(yǎng)肌衛(wèi)星細(xì)胞的方法不但操作簡(jiǎn)便，而且大大節(jié)省了培養(yǎng)成本，具有一定的經(jīng)濟(jì)意義，且可以獲得大量傳代穩(wěn)定性好的細(xì)胞。
【專利說(shuō)明】肌纖維體外培養(yǎng)試劑盒
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體來(lái)說(shuō)是一種肌纖維體外培養(yǎng)試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002]實(shí)驗(yàn)表明骨胳肌中的肌衛(wèi)星細(xì)胞有自我更新及成肌、成骨、成脂肪等能力，亦稱之為“肌肉干細(xì)胞”，這種細(xì)胞是向成肌細(xì)胞系定向的一種前體細(xì)胞；肌肉再生過(guò)程主要是由肌衛(wèi)星細(xì)胞來(lái)完成的；肌衛(wèi)星細(xì)胞位于肌纖維的肌膜與基底膜之間，一般為小梭形扁平的單核細(xì)胞；當(dāng)肌肉組織受到刺激時(shí)如骨骼肌受損時(shí)，衛(wèi)星細(xì)胞就會(huì)被激活，大量分裂、增殖并相互融合形成再生肌纖維；激活的衛(wèi)星細(xì)胞與受損傷細(xì)胞融合以修復(fù)受損傷細(xì)胞，或幾個(gè)成肌細(xì)胞融合形成肌管，進(jìn)而生成新的肌細(xì)胞。衛(wèi)星細(xì)胞的激活、增殖和分化也是骨骼肌細(xì)胞肥大、數(shù)目增多以及肌纖維轉(zhuǎn)化的重要機(jī)制。肌衛(wèi)星細(xì)胞體外分離培養(yǎng)成為研究肌肉分化途徑及性狀改良的分子機(jī)制的重要技術(shù)平臺(tái)，為改良家畜肌肉品質(zhì)及畜牧業(yè)生產(chǎn)領(lǐng)域奠定研究基礎(chǔ)。
[0003]肌細(xì)胞是肌組織的前體細(xì)胞，易培養(yǎng)、可塑性強(qiáng)，具有骨骼肌的許多重要生物特性，對(duì)于肌衛(wèi)星細(xì)胞的研究成為生物組織工程中的一個(gè)熱門領(lǐng)域。不同年齡、不同肌肉類型中衛(wèi)星細(xì)胞的數(shù)目不同，因此取材對(duì)于肌衛(wèi)星細(xì)胞的原代培養(yǎng)很重要；一般來(lái)說(shuō)，年幼個(gè)體的衛(wèi)星細(xì)胞含量較豐富。開(kāi)發(fā)一種肌纖維體外培養(yǎng)試劑盒對(duì)肌纖維的研究具有重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的 是提供一種肌纖維體外培養(yǎng)試劑盒。
[0005]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是:一種肌纖維體外培養(yǎng)試劑盒，其特征在于:包括消化酶、D-Hanks液、肌細(xì)胞培養(yǎng)液A和肌細(xì)胞培養(yǎng)液B。
[0006]進(jìn)一步的:所述消化酶包括胰酶和I型膠原酶。
[0007]進(jìn)一步的:所述D-Hanks 液由 8g 的 NaCU0.6g 的 Na2HPO4.2H20、4g 的 KC1、0.6g的KH2P04、3.5g的NaHC03、5g的青鏈霉素、1.0g的兩性霉素B和1000mL三蒸水組成。
[0008]進(jìn)一步的:所述細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)液A由70ml的DMEM高糖培養(yǎng)基、20ml的FBS、IOml的胎牛血清、Ig的青鏈霉素和Ig的兩性霉素B組成。
[0009]進(jìn)一步的:所述細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)液B由98ml的DMEM高糖培養(yǎng)液、2m的胎牛血清組成。
[0010]進(jìn)一步的:所述細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)液pH值為7.2。
[0011]本發(fā)明的有益技術(shù)效果是:本發(fā)明培養(yǎng)基可快速通過(guò)體外培養(yǎng)獲得骨骼肌肌纖維衛(wèi)星細(xì)胞，所培養(yǎng)的細(xì)胞形態(tài)均一，繁殖活力強(qiáng)，在分化誘導(dǎo)后具有融合成肌管得能力；利用本發(fā)明試劑盒進(jìn)行體外培養(yǎng)肌衛(wèi)星細(xì)胞的方法不但操作簡(jiǎn)便，而且大大節(jié)省了培養(yǎng)成本，具有一定的經(jīng)濟(jì)意義，且可以獲得大量傳代穩(wěn)定性好的細(xì)胞。
【具體實(shí)施方式】[0012]下面將結(jié)合本發(fā)明實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例僅僅是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例?；诒景l(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒(méi)有作出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。
[0013]實(shí)施例一
肌纖維體外培養(yǎng)試劑盒，包括消化酶、D-Hanks液、肌細(xì)胞培養(yǎng)液A和肌細(xì)胞培養(yǎng)液B。
[0014]其中:消化酶包括胰酶和I型膠原酶。
[0015]其中=D-Hanks液由 8g 的 NaCl、0.6g 的 Na2HPO4.2H20、4g 的 KCl、0.6g 的 KH2PO4'
3.5g的NaHC03、5g的青鏈霉素、1.0g的兩性霉素B和1000mL三蒸水組成。
[0016]其中:細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)液A由70ml的DMEM高糖培養(yǎng)基、20ml的FBSUOml的胎牛血清、Ig的青鏈霉素和Ig的兩性霉素B組成，pH值為7.2。
[0017]其中:細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)液B由98ml的DMEM高糖培養(yǎng)液、2ml的胎牛血清組成，pH值為 7.2。
[0018]利用本發(fā)明培養(yǎng)基培養(yǎng)山羊肌纖維衛(wèi)星細(xì)胞的方法步驟如下:
(1)取樣:在無(wú)菌條件下，取山羊背最長(zhǎng)肌放入冰盒，立即帶回實(shí)驗(yàn)室；
(2)消化:將肌肉樣用剪刀剪碎，加入含有0.25g胰酶和0.2g I型膠原酶的D-Hanks(D-Hanks 液由 8g 的 NaCl、0.6g 的 Na2HPO4.2H20、4g 的 KC1、0.6g 的 ΚΗ2Ρ04、3.5g 的 NaHC03、5g的青鏈霉素、1.0g的兩性霉素B和1000mL三蒸水組成)液中，37 °C條件下消化60~120min，得到細(xì)胞懸浮液；
(3)過(guò)濾:利用篩孔為400目的過(guò)濾篩過(guò)濾細(xì)胞懸液，然后離心，所得細(xì)胞沉淀用D-Hanks液重懸并離心，再用細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)液A (70ml的DMEM高糖培養(yǎng)基、20ml的FBS、IOml的胎牛血清、Ig的青鏈霉素和Ig的兩性霉素B組成，pH值為7.2)重懸細(xì)胞；
(4)初代培養(yǎng):將懸浮的細(xì)胞接種于以多聚賴氨酸包被的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，采用差速貼壁法培養(yǎng)細(xì)胞ppl至pp6，將pp6中的細(xì)胞培養(yǎng)至匯合率為95%，然后采用質(zhì)量濃度為0.25%的胰酶進(jìn)行傳代(I: 1)，即完成山羊肌衛(wèi)星細(xì)胞的體外分離培養(yǎng)；
(5)誘導(dǎo)分化
A、采用100μ I的DMEM高糖培養(yǎng)液對(duì)4 μ g的pEGFP-1RES_Myf6質(zhì)粒和8 μ I的PEI轉(zhuǎn)染試劑分別進(jìn)行孵育5min，然后混合并孵育15min，得PE1-質(zhì)粒復(fù)合物；
B、取體外分離培養(yǎng)的山羊肌衛(wèi)星細(xì)胞并培養(yǎng)至匯合率為75%，棄掉培養(yǎng)液，用DMEM高糖培養(yǎng)液清洗山羊肌衛(wèi)星細(xì)胞兩次，然后補(bǔ)加1.8ml的DMEM高糖培養(yǎng)液，再將PE1-質(zhì)粒復(fù)合物逐滴滴加到山羊肌衛(wèi)星細(xì)胞表面并作用4h，然后更換為細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)液A (70ml的DMEM高糖培養(yǎng)基、20ml的FBSUOml的胎牛血清、Ig的青鏈霉素和Ig的兩性霉素B組成，PH值為7.2)培養(yǎng)24h，再更換為細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)液B (DMEM高糖培養(yǎng)液、2ml的胎牛血清組成，PH值為7.2)，在溫度為37°C并裝有5%C02的培養(yǎng)箱中誘導(dǎo)分化48~72h，即完成山羊肌衛(wèi)星細(xì)胞的誘導(dǎo)分化。
[0019]以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.肌纖維體外培養(yǎng)試劑盒，其特征在于:包括消化酶、D-Hanks液、肌細(xì)胞培養(yǎng)液A和肌細(xì)胞培養(yǎng)液B。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述肌纖維體外培養(yǎng)試劑盒，其特征在于:所述消化酶包括胰酶和I型膠原酶。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述肌纖維體外培養(yǎng)試劑盒，其特征在于:所述D-Hanks液由Sg的NaCU0.6g 的 Na2HPO4.2H20、4g 的 KC1、0.6g 的 KH2PO4,3.5g 的 NaHC03、5g 的青鏈霉素、1.0g的兩性霉素B和1000mL三蒸水組成。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述肌纖維體外培養(yǎng)試劑盒，其特征在于:所述細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)液A由70ml的DMEM高糖培養(yǎng)基、20ml的FBSUOml的胎牛血清、Ig的青鏈霉素和Ig的兩性霉素B組成。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述肌纖維體外培養(yǎng)試劑盒，其特征在于:所述細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)液B由98ml的DMEM高糖培養(yǎng)液、2ml的胎牛血清組成。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述肌纖維體外培養(yǎng)試劑盒，其特征在于:所述細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)液PH值為7.2。
【文檔編號(hào)】C12N5/071GK103667177SQ201310663442
【公開(kāi)日】2014年3月26日 申請(qǐng)日期:2013年12月10日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月10日
【發(fā)明者】段升華 申請(qǐng)人:中山奈德生物科技有限公司