本發(fā)明涉及一種細(xì)胞復(fù)蘇試劑，具體涉及一種新型的細(xì)胞復(fù)蘇試劑，屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
。
背景技術(shù)：
：細(xì)胞凍存使用的凍存試劑有含血清和無(wú)血清兩類(lèi)，由于血清具有成分復(fù)雜、質(zhì)量不穩(wěn)定、價(jià)格昂貴等缺點(diǎn)，所以無(wú)血清凍存和復(fù)蘇技術(shù)成為發(fā)展的趨勢(shì)。本發(fā)明主要是針對(duì)無(wú)血清凍存和復(fù)蘇技術(shù)進(jìn)行的研究。對(duì)細(xì)胞進(jìn)行凍存操作時(shí)，一般是將細(xì)胞懸浮在凍存試劑中，然后采用梯度降溫的方法降溫，降溫速度大約是1℃/min。對(duì)凍存的細(xì)胞進(jìn)行復(fù)蘇時(shí)，一般是將凍存管直接置于37℃迅速解凍，然后加入完全生長(zhǎng)培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，離心棄上清后，再加入完全生長(zhǎng)培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，以供后續(xù)的研究或測(cè)試使用。結(jié)合上述無(wú)血清凍存和復(fù)蘇技術(shù)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行凍存和復(fù)蘇，細(xì)胞凍存后復(fù)蘇率遠(yuǎn)低于含血清的凍存技術(shù)。所以，一些細(xì)胞復(fù)蘇試劑應(yīng)運(yùn)而生。但是，現(xiàn)有的細(xì)胞復(fù)蘇試劑還存在以下兩方面的問(wèn)題：一、通用性較差，一種復(fù)蘇試劑只適用于一種細(xì)胞，或者只適用于少數(shù)幾種相似的細(xì)胞；二、細(xì)胞復(fù)蘇后，復(fù)蘇成活率(復(fù)蘇率)較低，并且活性較差。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：為解決現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種新型的細(xì)胞復(fù)蘇試劑，其不僅可以提高細(xì)胞復(fù)蘇率，而且還具有較好的通用性。為了實(shí)現(xiàn)上述目標(biāo)，本發(fā)明采用如下的技術(shù)方案：一種新型的細(xì)胞復(fù)蘇試劑，其特征在于，各組成成分及用量分別為：本發(fā)明的有益之處在于：(1)不含動(dòng)物成分，使用安全可靠；(2)成分完全明確，便于質(zhì)量控制；(3)即用型，操作更加方便；(4)適用的細(xì)胞類(lèi)型不限；(5)可以在細(xì)胞復(fù)蘇時(shí)獲得更好的復(fù)蘇率。具體實(shí)施方式以下結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作具體的介紹。一、準(zhǔn)備各相關(guān)試劑表1各組的組成成分及用量在本發(fā)明的復(fù)蘇試劑中，我們選用重組人血白蛋白，并將重組人血白蛋白與RPMI-1640培養(yǎng)基按照2:8的體積比混合，不含血清等動(dòng)物成分，使用安全可靠。此外，為了更好的保持復(fù)蘇細(xì)胞的活性，我們經(jīng)反復(fù)驗(yàn)證，最后選定了重組人表皮生長(zhǎng)因子、重組人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子和維生素D作為補(bǔ)充成分，為驗(yàn)證最合適的因子濃度，我們進(jìn)行了上述組分的不同組合，以便驗(yàn)證具體的復(fù)蘇效果。二、制備方法準(zhǔn)備RPMI-1640培養(yǎng)基(購(gòu)自美國(guó)Life公司)、重組人血白蛋白(購(gòu)自武漢禾元生物)、重組人表皮生長(zhǎng)因子(購(gòu)自美國(guó)Peprotech公司)、重組人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(購(gòu)自美國(guó)Peprotech公司)、維生素D(購(gòu)自美國(guó)Sigma公司)。在百級(jí)的無(wú)菌操作臺(tái)里進(jìn)行相關(guān)試劑的配制。重組人表皮生長(zhǎng)因子和重組人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子的配制按照廠(chǎng)家的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。三、使用方法取出凍存管，立即置于37℃水浴鍋中進(jìn)行細(xì)胞復(fù)蘇，解凍過(guò)程中注意輕輕搖動(dòng)凍存管，以保證解凍完全。50-60s左右，當(dāng)凍存管中已無(wú)冰塊，從水浴鍋中取出凍存管，在無(wú)菌操作臺(tái)中加入等體積的細(xì)胞復(fù)蘇試劑，將所有液體轉(zhuǎn)移至15ml離心管中，于37℃二氧化碳培養(yǎng)箱中靜置3min，再加入完全生長(zhǎng)培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，以供后續(xù)的研究或測(cè)試使用。四、復(fù)蘇效果選用人Hela細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)。收集足量的人Hela細(xì)胞，用凍存試劑進(jìn)行細(xì)胞重懸，將符合密度要求(3×106/ml)的細(xì)胞裝入凍存管。使用程序梯度降溫儀給凍存管進(jìn)行降溫，之后轉(zhuǎn)入-196℃液氮環(huán)境。凍存一周后，取出凍存管進(jìn)行細(xì)胞復(fù)蘇，觀察各組細(xì)胞的復(fù)蘇情況，并計(jì)算各組細(xì)胞的復(fù)蘇成活率(簡(jiǎn)稱(chēng)復(fù)蘇率)。1、人Hela細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察凍存一周，使用本發(fā)明的細(xì)胞復(fù)蘇試劑進(jìn)行復(fù)蘇，應(yīng)用相差顯微鏡來(lái)觀察復(fù)蘇后各組細(xì)胞的存活及分化情況，培養(yǎng)3天后計(jì)算克隆形成率。實(shí)驗(yàn)組：使用表1中的復(fù)蘇試劑根據(jù)上述的細(xì)胞復(fù)蘇方法進(jìn)行復(fù)蘇。對(duì)照組：將凍存管直接置于37℃水浴鍋中迅速解凍，然后加入完全生長(zhǎng)培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，離心棄上清后，再加入完全生長(zhǎng)培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。應(yīng)用相差顯微鏡來(lái)觀察復(fù)蘇后各組細(xì)胞的存活及分化情況，觀察結(jié)果顯示：(1)實(shí)驗(yàn)組：人Hela細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)后，生長(zhǎng)狀態(tài)良好，形態(tài)正常，無(wú)懸浮的死細(xì)胞。(2)對(duì)照組：人Hela細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)后，生長(zhǎng)狀態(tài)一般，有部分懸浮的死細(xì)胞。培養(yǎng)3天后計(jì)算克隆形成率，計(jì)算結(jié)果顯示：經(jīng)計(jì)算，各組細(xì)胞的克隆形成率見(jiàn)表2。表2各組細(xì)胞的克隆形成率克隆形成率第1組5％第2組10％第3組50％第4組75％第5組90％第6組60％第7組65％第8組50％第9組45％2、人Hela細(xì)胞的復(fù)蘇率測(cè)定凍存一周，然后復(fù)蘇，計(jì)算各組細(xì)胞的復(fù)蘇率。實(shí)驗(yàn)組：使用表1中的復(fù)蘇試劑進(jìn)行復(fù)蘇。對(duì)照組：將凍存管直接置于37℃迅速解凍，然后加入完全生長(zhǎng)培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，離心棄上清后，再加入完全生長(zhǎng)培養(yǎng)基重懸，去細(xì)胞樣品進(jìn)行復(fù)蘇率的測(cè)定。計(jì)算結(jié)果見(jiàn)表3。表3各組細(xì)胞的復(fù)蘇率細(xì)胞復(fù)蘇率第1組88％第2組90％第3組89％第4組91％第5組98％第6組95％第7組93％第8組92％第9組94％對(duì)照組90％以上試驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明：本發(fā)明的細(xì)胞復(fù)蘇試劑不僅可以很好的保持細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征，而且能夠提高細(xì)胞的復(fù)蘇率。本發(fā)明的細(xì)胞復(fù)蘇試劑，通過(guò)添加2種因子(重組人表皮生長(zhǎng)因子、重組人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子)和1種維生素(維生素D)，并結(jié)合重組人血白蛋白，可以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞復(fù)蘇后，無(wú)需離心去除凍存試劑中的DMSO，可以直接進(jìn)行后續(xù)的細(xì)胞培養(yǎng)，同時(shí)能夠保證細(xì)胞具有較高的復(fù)蘇率(即具有較高的活性)。五、適用的細(xì)胞類(lèi)型選用PBMC細(xì)胞、MSC細(xì)胞、CIK細(xì)胞、NK細(xì)胞、293細(xì)胞、HUVEC細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、人ES細(xì)胞、人iPS細(xì)胞共計(jì)9種不同類(lèi)型的細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)。選用第5組復(fù)蘇試劑。各組細(xì)胞凍存一周后，采用與第四步相同的試驗(yàn)方法進(jìn)行試驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4。表4針對(duì)不同類(lèi)型的細(xì)胞復(fù)蘇試劑的復(fù)蘇效果細(xì)胞名稱(chēng)細(xì)胞特性細(xì)胞復(fù)蘇率PBMC細(xì)胞細(xì)胞形態(tài)正常88％MSC細(xì)胞細(xì)胞形態(tài)正常97％CIK細(xì)胞細(xì)胞形態(tài)正常95％NK細(xì)胞細(xì)胞形態(tài)正常93％293細(xì)胞細(xì)胞形態(tài)正常99％HUVEC細(xì)胞細(xì)胞形態(tài)正常89％成纖維細(xì)胞細(xì)胞形態(tài)正常100％人ES細(xì)胞細(xì)胞形態(tài)正常86％人iPS細(xì)胞細(xì)胞形態(tài)正常88％由表4可知：對(duì)于不同類(lèi)型的細(xì)胞，使用本發(fā)明的細(xì)胞復(fù)蘇試劑復(fù)蘇后，細(xì)胞形態(tài)正常，細(xì)胞復(fù)蘇率(活性)較高。以上試驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明：本發(fā)明的細(xì)胞復(fù)蘇試劑復(fù)蘇效果很好，并且適用的細(xì)胞類(lèi)型不限，通用性強(qiáng)。需要說(shuō)明的是，上述實(shí)施例不以任何形式限制本發(fā)明，凡采用等同替換或等效變換的方式所獲得的技術(shù)方案，均落在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3