專利名稱：一種尿激酶與人尿胰蛋白酶抑制劑的分離方法
技術領域：
本發(fā)明涉及尿激酶、人尿胰蛋白酶抑制劑的純化過程和粗制品的生產技術領域，尤其涉及一種尿激酶與人尿胰蛋白酶抑制劑的分離方法。
背景技術：
男性尿是人體蛋白一種重要的來源，目前從男性尿液中提取的市場最大的兩個藥用蛋白產品分別是尿激酶、人尿胰蛋白酶抑制劑，其具有重要的臨床治療價值，并得到了廣泛的應用。尿激酶(Urokinase，簡寫為UK)，是臨床上重要的溶栓藥物，廣泛用于心腦血管和外周血管等處血栓性疾病的治療，其主要從人尿中提取。人尿中的UK有高分子量(HUK)與低分子量(LUK)兩種形式，由于LUK在臨床上容易引起出血等副反應，因此，藥典要求尿激酶原料藥中HUK需大于90%。
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人尿胰蛋白酶抑制劑(Urinary trypsin inhibitor,以下簡稱為UTI)是一種從人尿中分離純化的由143個氨基酸組成的糖蛋白，等電點在2左右，分子量65000D，具有抑制多種蛋白酶、糖酶和脂酶等水解酶的活性，從而抑制炎癥介質的過度釋放，改善微循環(huán)和組織灌注。而在機體受到嚴重損傷時起抑制全身性炎癥反應(SIRS)的發(fā)生發(fā)展、繼而阻斷多臟器功能障礙(MODS)，保護臟器功能等作用。UK和UTI均具有重要的治療價值，在疾病的治療中發(fā)揮了重要的作用。兩種蛋白質均主要從男性尿液中分離制備，生產方式都是先收集尿液，再將尿液運至相應場所進行集中處理，先用硅膠吸附UK，再用殼聚糖吸附UTI ;其后再利用高pH或者或高鹽等將這些蛋白從吸附劑上釋放出來，利用硫酸銨沉淀等方法得到含有相應蛋白的粗品，粗品再到下游的純化精制工廠進行進一步的分離純化，得到相應的原料藥產品。UK和UTI粗品是中國非常重要的生化產品。在生產過程中，經常發(fā)生UK和UTI混在一起的情況，由于UK是一種絲氨酸蛋白酶，而UTI是一種絲氨酸蛋白酶抑制劑，兩者會相互影響，對產品含量的測定以及后續(xù)純化帶來嚴重影響。給生產者帶來很大的損失。出現(xiàn)上述情況，目前尚無簡便方法進行二者的快速有效分離。有人嘗試重新溶解，再用硅膠等吸附劑加工等辦法來回收UK和UTI，但周期長，活性損失很大，達到30%以上，尤其是對UK，發(fā)生明顯的降解，LUK大幅度增加，導致產品的質量嚴重下降。

發(fā)明內容
發(fā)明目的:本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術的不足，提供一種簡便可行，周期短，有效保護UK和UTI活性，減少UK降解，提高UK質量的尿激酶與人尿胰蛋白酶抑制劑的分離方法。為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明所采用的技術方案為:一種尿激酶與人尿胰蛋白酶抑制劑的分離方法，包括如下步驟:I)將含有尿激酶和人尿胰蛋白酶抑制劑的溶液，調節(jié)pH至9.0 ±0.6 ;
2)緩慢加入16 — 30% (w/v)硫酸銨粉末，一邊加硫酸銨粉末，一邊攪拌使其溶解，直到溶液中出現(xiàn)明顯蛋白沉淀；3)調節(jié) pH 至 9.0±0.6 ;4)靜置I 一 6小時后，離心或者加硅藻土過濾，收集富含尿激酶的沉淀1，獲得尿激酶；5)上清繼續(xù)加入硫酸銨至硫酸銨終濃度為55% (w/v)以上，一邊加硫酸銨粉末，一邊攪拌使其溶解；6)靜置I 一 6小時后，離心或者加硅藻土過濾，收集富含人尿胰蛋白酶抑制劑沉淀2，獲得人尿胰蛋白酶抑制劑。步驟I和步驟3中調節(jié)pH使用氫氧化鈉溶液或氨水溶液。步驟2中，在溶液中出現(xiàn)明顯蛋白沉淀后,再補加1-5% (w/v)硫酸按粉末，并溶解。所述的硫酸銨粉末也可以 采用相當量的硫酸銨溶液替代。本發(fā)明與現(xiàn)有技術相比，其有益效果是:1、本發(fā)明的方法收率很高，尿激酶90%以上的活性保留在沉淀I中，而人尿胰蛋白酶抑制劑90%以上的活性保留在沉淀2中；2、兩者實現(xiàn)了很好的分離，沉淀I中UTI活性低于3%，沉淀2中未能檢測到UK活性；3、該方法整個過程時間短，操作很簡單，成本低，不需要特殊設備，降低設備的投入成本；4、不會引起HUK的明顯降解，且明顯提高了 HUK的比活。
具體實施例方式下面通過最佳實施例，對本發(fā)明技術方案進行詳細說明，但是本發(fā)明的保護范圍不局限于所述實施例。實施例1將10克UK粗制品(3.15萬U/g)和10克UTI粗制品(2.33萬U/g)混合，加IOOml的去離子水，攪拌溶解，離心收集上清液92ml，上清液用IN的NaOH溶液調節(jié)pH至8.4 ;緩慢加入16% (w/v)硫酸銨粉末,一邊加硫酸銨粉末,一邊攪拌使其溶解,溶液中出現(xiàn)明顯蛋白沉淀，再補加4.6g硫酸銨粉末，攪拌溶解后，用IN的NaOH溶液調節(jié)pH至8.4，靜置2小時；3000rpm離心10分鐘，收集沉淀1，上清繼續(xù)加入硫酸銨粉末至60% (w/v),靜置2小時后，3000rpm離心10分鐘，收集沉淀2。測定沉淀I與沉淀2中，UK和UTI的活性，見表I。表1:
Iuk總活性(u) Iuti總活性(u)
|始 3.15 X IO52.33 X IO5
_定 I 3.03 X IO56.51X IO3
2 I未檢出|2.15X105 —從表I可見，UK主要集中在沉淀I中，收率約95%，UTI主要集中在沉淀2中，收率大于90%。起始所用的UK粗品比活為210U/A28Q，沉淀I的比活為650 U/A280,比活明顯提聞。實施例2將10克UK粗制品(3.72萬U/g)和10克UTI粗制品(1.95萬U/g)混合，加IOOml的去離子水，攪拌溶解，離心收集上清液93ml，上清液用IN的NaOH溶液調節(jié)pH至9.6 ;緩慢加入30% (w/v)硫酸銨粉末，一邊加硫酸銨粉末，一邊攪拌使其溶解，再用IN的NaOH溶液調節(jié)PH至9.6，靜置6小時；3000rpm離心10分鐘，收集沉淀1，上清繼續(xù)加入硫酸銨粉末至55% (w/v)，靜置2小時后，3000rpm離心10分鐘，收集沉淀2。測定沉淀I與沉淀2中，UK和UTI的活性，見表2。表2:
權利要求
1.一種尿激酶與人尿胰蛋白酶抑制劑的分離方法，其特征在于，包括如下步驟: 1)將含有尿激酶和人尿胰蛋白酶抑制劑的溶液，調節(jié)pH至9.0 ±0.6 ; 2)緩慢加入16- 30% (w/v)硫酸銨粉末，一邊加硫酸銨粉末，一邊攪拌使其溶解，直到溶液中出現(xiàn)明顯蛋白沉淀； 3)調節(jié)pH 至 9.0±0.6 ；4)靜置I一 6小時后，離心或者加硅藻土過濾，收集富含尿激酶的沉淀1，獲得尿激酶；5)上清繼續(xù)加入硫酸銨至55%(w/v)以上,一邊加硫酸銨粉末,一邊攪拌使其溶解； 6)靜置I一 6小時后，離心或者加硅藻土過濾，收集富含人尿胰蛋白酶抑制劑沉淀2，獲得人尿胰蛋白酶抑制劑。
2.根據(jù)權利要求1所述的尿激酶與人尿胰蛋白酶抑制劑的分離方法，其特征在于:步驟I和步驟3中調節(jié)pH使用氫氧化鈉溶液或氨水溶液。
3.根據(jù)權利要求1所述的尿激酶與人尿胰蛋白酶抑制劑的分離方法，其特征在于:步驟2中，在溶液中出現(xiàn)明顯蛋白沉淀后，再補加1-5% (w/v)硫酸銨粉末，并溶解。
4.根據(jù)權利要求1、2或3所述的尿激酶與人尿胰蛋白酶抑制劑的分離方法，其特征在于:所述的硫酸銨粉末也可以采用相當量的硫酸銨溶液替代。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種尿激酶與人尿胰蛋白酶抑制劑的分離方法。該方法包括如下步驟將含有尿激酶和人尿胰蛋白酶抑制劑的溶液，調節(jié)pH；緩慢加入硫酸銨粉末，一邊加硫酸銨粉末，一邊攪拌直到溶液中出現(xiàn)明顯蛋白沉淀；調節(jié)pH至9.0±0.6；靜置后，離心或者加硅藻土過濾，收集富含尿激酶的沉淀，獲得尿激酶；上清繼續(xù)加入硫酸銨至，一邊加硫酸銨粉末，一邊攪拌使其溶解；靜置后，離心或者加硅藻土過濾，收集富含人尿胰蛋白酶抑制劑沉淀2，獲得人尿胰蛋白酶抑制劑。該方法簡便可行，周期短，有效保護UK和UTI活性，減少UK降解，提高UK質量，不需要特殊設備，降低設備的投入成本。
文檔編號C12N9/72GK103074319SQ20131002036
公開日2013年5月1日 申請日期2013年1月18日 優(yōu)先權日2013年1月18日
發(fā)明者苗丕渠, 蘇古方, 許冬至, 沈小寧 申請人:揚州艾迪生物科技有限公司