專利名稱：一種苦蕎麥胰蛋白酶抑制劑基因tbti的克隆和表達(dá)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，更具體的，本發(fā)明涉及一種苦蕎麥胰蛋白酶抑制劑基因(TBTI)的克隆和表達(dá)方法。
背景技術(shù)：
蛋白酶抑制劑(Protease Inhibitor，PI)是一類對(duì)蛋白酶有抑制作用多肽或蛋白質(zhì)，能夠抑制蛋白水解酶活性，它存在于所有生物體中，是自然界中含量最為豐富的蛋白種類之一。自從40年代發(fā)現(xiàn)豆科植物中存在蛋白酶抑制劑以來，在動(dòng)物、植物和微生物體內(nèi)已發(fā)現(xiàn)普遍存在著多種類型的蛋白酶抑制劑(PI)，后來又陸續(xù)在20種植物中發(fā)現(xiàn)這類蛋白，如煙草、番茄、馬鈴薯、豌豆、玉米、菜豆、小麥、大麥等。PI能與蛋白酶的活性部位和變構(gòu)部位結(jié)合，抑制酶的催化活性或阻止酶原轉(zhuǎn)化為有活性的酶。因此它具有防止體內(nèi)不必要的蛋白降解，調(diào)節(jié)蛋白代謝及調(diào)節(jié)各種蛋白酶的生理活性的功能，與相應(yīng)蛋白水解酶形成一定動(dòng)態(tài)平衡，調(diào)節(jié)生物體內(nèi)許多重要生命活動(dòng)。例如，PI對(duì)胰腺炎、肺氣腫、癌癥、HIV 等疾病有一定療效，已引起醫(yī)藥學(xué)界普遍關(guān)注。很多植物的PI還具抑制某些病原微生物及某些昆蟲體內(nèi)蛋白酶的作用，是植物體的一種自然防御體系，因此PI也具有抗病蟲害天然防御功能，可削弱或阻斷昆蟲消化道內(nèi)蛋白酶對(duì)食物蛋白質(zhì)消化作用限制氨基酸的釋放而使昆蟲因缺少營(yíng)養(yǎng)非正常發(fā)育或死亡，是抗蟲基因工程的理想元件。PI還能抑制某些病原微生物的核酸復(fù)制和侵染相關(guān)酶，從而起到抗病原微生物(細(xì)菌、真菌和病毒)的作用。PI 目前被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)、食品和生物工程等領(lǐng)域中。蕎麥?zhǔn)寝た?Polygonaceae)、蕎麥屬O^agopy-Film Mill)的雙子葉禾谷類作物， 又名烏麥、花麥或三角麥。蕎麥有苦蕎(F.tataricum，又稱野蕎麥、韃靼蕎、萬年蕎、野南蕎)、甜蕎(F. esculentum,又稱普通蕎麥)、金蕎和齒翅野蕎4種。我國(guó)常見的有苦蕎和甜蕎2種，其中苦蕎為中國(guó)獨(dú)有。俄羅斯是世界最大的蕎麥生產(chǎn)國(guó)，中國(guó)次之。目前，我國(guó)蕎麥主要分布在西北、東北、華北以及西南一帶高寒山區(qū)，四川省涼山彝族自治州是苦蕎麥的主要產(chǎn)區(qū)和起源地之一。蕎麥蛋白酶抑制劑對(duì)人體有益，它不但能降血糖、降血脂、降血壓、防止便秘、抑制膽結(jié)石和抗衰老，而且能夠抗癌和防治艾滋病，更吸引人的是，蛋白酶抑制劑對(duì)植物的保護(hù)作用，對(duì)人體TALL細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用，預(yù)示了其在生物農(nóng)藥、輔助治療白血病、生物技術(shù)應(yīng)用中的潛在前景。盡管蕎麥種子中的蛋白酶抑制劑已引起人們廣泛關(guān)注，但與來自大豆、可豆、水稻、馬鈴落等植物中的PI相比，苦蕎麥蛋白酶抑制劑的研究還需要進(jìn)一步深入。目前對(duì)于甜蕎一級(jí)結(jié)構(gòu)的報(bào)道大約已有10種左右，對(duì)于編碼其蛋白序列的基因序列的克隆和原核表達(dá)也有人報(bào)道。對(duì)苦蕎麥蛋白酶抑制劑的純化和特性研究已有相關(guān)報(bào)道，但對(duì)苦蕎麥蛋白酶抑制基因結(jié)構(gòu)及其表達(dá)調(diào)控的研究還處于空白。本發(fā)明利用已知的甜蕎麥胰蛋白酶抑制劑氨基酸序列和其它十幾種植物胰蛋白酶抑制劑的氨基酸序列進(jìn)行氨基酸序列比對(duì)，找出相對(duì)保守的氨基酸序列，然后設(shè)計(jì)兼并引物克隆出TBTI基因的保守序列，再利用Genome-walking技術(shù)和3’RACE技術(shù)克隆出TBTI 的全長(zhǎng)基因序列，并實(shí)現(xiàn)其在真核生物的高效表達(dá)，結(jié)合已知的蛋白質(zhì)序列進(jìn)行分析，得出基因表達(dá)與調(diào)控的相關(guān)信息，為進(jìn)一步研究其生理功能和表達(dá)調(diào)控做好準(zhǔn)備。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克隆出TBTI的全長(zhǎng)基因序列，并實(shí)現(xiàn)其在真核生物的高效表達(dá)， 為下一步把TBTI基因轉(zhuǎn)入小麥、玉米和水稻等作物，提高其抗蟲(小菜娥、玉米螟、甘藍(lán)夜蛾等)和抗病(小麥赤霉病、玉米大斑病、水稻稻瘟病等)能力打下基礎(chǔ)。本發(fā)明的具體實(shí)施步驟如下1、TBTI基因保守區(qū)序列的獲得根據(jù)其它植物胰蛋白酶抑制劑的蛋白質(zhì)氨基酸序列利用DNAMAN和ClustalW2. 0兩種生物信息學(xué)軟件進(jìn)行多重序列比對(duì)找出兩個(gè)保守區(qū)的氨基酸序列=WPELVG和RCDRV，利用已經(jīng)測(cè)得的苦蕎麥胰蛋白酶抑制劑N-端氨基酸序列和甜蕎的胰蛋白酶抑制劑基因序列設(shè)計(jì)兼并引物Pl :TGGCCNGARCTNGTTGGA和P2 RACNCAYACNCGGTCACA，送hvitrogen公司合成引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增.2、TBTI基因5，末端序列的獲得參照Takara公司Genome-Walking試劑盒說明書，根據(jù)已克隆的保守序列設(shè)計(jì)3條特異引物SPl TCACAACGAAAGTCGAAAGTGC, SP2 GGTGGCTAGAGTGGTTAAAGGAGG、SP3 :CTTCCCTTTGGTTCCAACAAGC，利用試劑盒自帶的 3 個(gè)兼并引物API、AP2、AP3分別進(jìn)行3次PCR，PCR產(chǎn)物經(jīng)1 %瓊脂糖凝膠電泳，采用瓊脂糖凝膠回收試劑盒(Omigal公司)回收后，與pGEMT Easy vector (ftOmega，美國(guó))連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5ci感受態(tài)細(xì)胞，含100mg/ml青霉素的LB平板篩選陽性克隆，陽性克隆進(jìn)一步經(jīng)T 載體引物的菌落PCR鑒定后，37°C培養(yǎng)12h，采用質(zhì)粒DNA提取試劑盒(Omigal公司)提取質(zhì)粒DNA，送北京諾賽基因公司測(cè)序。利用NCBI (www. ncbi. nih. gov)的BLAST在線分析工具進(jìn)行序列比對(duì)分析。蛋白質(zhì)的翻譯采用ExPASy網(wǎng)站的tool (http //expasy. org/tools/ dna. html)進(jìn)行。3、TBTI基因3，末端序列的獲得3，RACE cDNA第一鏈合成按TaKaRa公司試劑盒的說明書操作，參照TaKaRa公司3’ RACE試劑盒說明書，根據(jù)已克隆的保守序列設(shè)計(jì)2條特異引物外部引物GSPl GCAGCCACCATAGATAAGGAGAA和內(nèi)部引物GSP2 CTTTAACCACTCGCCACCTGC，利用試劑盒自帶的2個(gè)兼并引物(外部引物AP1和內(nèi)部引物AP2) 分別進(jìn)行2次PCR，PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，采用瓊脂糖凝膠回收試劑盒(Omigal公司)回收后，與pGEMT Easy vector (ftOmega，美國(guó))連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，含100mg/ml青霉素的LB平板篩選陽性克隆，陽性克隆進(jìn)一步經(jīng)T載體引物的菌落PCR 鑒定后，37°C培養(yǎng)12h，采用質(zhì)粒DNA提取試劑盒(Omigal公司)提取質(zhì)粒DNA，送北京諾賽基因公司測(cè)序。利用NCBI (www. ncbi. nih. gov)的BLAST在線分析工具進(jìn)行序列比對(duì)分析。 蛋白質(zhì)的翻譯采用 ExPASy 網(wǎng)站的 tool (http//expasy. org/tools/dna. html)進(jìn)行。4、TBTI全長(zhǎng)基因的獲得，實(shí)現(xiàn)了苦蕎麥胰蛋白酶抑制劑基因在畢赤酵母中的高效表達(dá)。設(shè)計(jì)帶酶切位點(diǎn)的弓丨物Pl :CCGGAATTCCATGTTAATTTACGCTAAAGTT P2 GAATGCGGCCGCTCAACCGACGGTTGG將回收的PCR產(chǎn)物經(jīng)EcoR I，Not I雙酶切后，連入同樣經(jīng)過雙酶切的含有AOXl啟動(dòng)子和氨芐青霉素、卡那霉素抗性基因的表達(dá)載體pPIC9K中；使用電擊轉(zhuǎn)化的方法，將含有TBTI基因的表達(dá)載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)入畢赤酵母GS115感受態(tài)細(xì)胞中，通過MD平板篩選出陽性轉(zhuǎn)化子。


圖1 :TBTI基因保守區(qū)PCR擴(kuò)增電泳檢測(cè)泳道M為Marker I泳道2為目的片段；圖2 =TBTI基因3’端序列PCR擴(kuò)增電泳檢測(cè)泳道M為Marker I，無標(biāo)記泳道為第一輪PCR產(chǎn)物，泳道1為第二輪PCR產(chǎn)物；圖3 =TBTI基因5’端序列PCR擴(kuò)增電泳檢測(cè)泳道M為Marker I，無標(biāo)記泳道為第一輪和第二輪PCR產(chǎn)物，泳道1為第三輪PCR產(chǎn)物；圖4 =TBTI基因全長(zhǎng)序列的PCR擴(kuò)增電泳檢測(cè)泳道M為Marker I，泳道1為目的片段。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步闡述，但實(shí)施例不限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。下述實(shí)施例中，所用的試驗(yàn)材料及其來源包括1、材料、菌株和質(zhì)粒；苦蕎麥種子由西昌學(xué)院食品系胡建平副教授惠贈(zèng)，大腸桿菌DH5 α本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建，受體菌酵母GSl 15購自hvitrogen公司，酵母表達(dá)載體pPIC9K購自hvitrogen公司， 克隆載體PMD19-T Vector,Genome-walking試劑盒和3，RACE試劑盒購自大連寶生物公司。2、化學(xué)試劑和酶制劑；EcoR I、Not I、氨節(jié)青霉素、卡那霉素、T4 DNA Ligase, Taq DNA Polymerase、 Prime STAR 高保真聚合酶、dNTP、DNA Maker DL2000 DNA Maker I 購自 Takara Biotechnology，質(zhì)粒提取試劑盒、純化試劑盒、凝膠回收試劑盒購自O(shè)MEGA。NaCl、NaOH, HCl、K2HPO4 · 3H20、KH2PO4, MgCl2JjC乙酸、甲醇、甲酸、蛋白胨、酵母抽提物、葡萄糖、蔗糖、瓊脂粉、生物素、無氨基酸酵母氮源(YNB)、甘油、瓊脂糖、乙二胺四乙酸 (EDTA)、Tris-HCl、十二烷基硫酸鈉(SDQ、考馬斯亮藍(lán)R250、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、 過硫酸銨、N，N, N’ N’ -四甲基乙二胺(TEMED)等。3、引物合成；本發(fā)明涉及的引物由hvitrogen公司合成。下述實(shí)施例中常規(guī)的基因操作方法參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》(第三版)。實(shí)施例1 :TBTI保守區(qū)的獲得；(一 )實(shí)驗(yàn)方法1、苦蕎麥基因組DNA提取將蕎麥種子于室溫?zé)o土培養(yǎng)至根尖Icm長(zhǎng)時(shí)剪取備用，或?qū)⒎N子種于花盆培養(yǎng)至長(zhǎng)出第一對(duì)子葉時(shí)備用；稱取新鮮備用材料0. 3g，置于陶瓷研缽中，加入液氮研磨成細(xì)粉， 分裝于Eppendorf管中；加ImlRNA提取緩沖液和SDS (終濃度為1 % )，劇烈振蕩2min， 65°C，保溫20min。加5mol/LKAc (終濃度為lmol/L)，充分混勻后冰浴20min, 4°C 8000g離心15min ；吸取上清，加入0. 6倍體積的異丙醇，混勻，_20°C放置Ih以上，4°C 12000g離心15min ；棄上清，沉淀用Iml 70%的乙醇(_20°C預(yù)冷)洗1次，4°C 12000g離心IOmin ；棄上清，用lmll00%的乙醇(_20°C預(yù)冷)洗沉淀1次，4°C 12000g離心IOmin ；吸去上清，將管口用封口膜封好，膜上扎小孔，真空干燥后以25ml滅菌水溶解DNA，_70°C保存。2、TBTI基因保守區(qū)的PCR擴(kuò)增根據(jù)其它植物胰蛋白酶抑制劑的蛋白質(zhì)氨基酸序列利用DNAMAN和ClustalW2. 0 兩種生物信息學(xué)軟件進(jìn)行多重序列比對(duì)找出兩個(gè)保守區(qū)的氨基酸序列=WPELVG和RCDRV， 利用已經(jīng)測(cè)得的苦蕎麥胰蛋白酶抑制劑N-端氨基酸序列和甜蕎的胰蛋白酶抑制劑基因序列設(shè)計(jì)兼并引物Pl :SEQ ID N0:11和P2:SEQ ID NO :12，，送hvitrogen公司合成引物，進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，PCR 反應(yīng)體系為 10XPCR buffer 2. 5 μ L，2. 5mmol/L dNTPs 2. 0 μ L, 25mmol/ L MgCl2 1.5口1^，1(^11101/1引物各1.(^1^，5"]\1 1 Taq 聚合酶 0· 2 μ L，50ng/μ L DNA 模板 2. 5μ L，加 ddH20 M 25 μ L0 反應(yīng)條件為 94°C預(yù)變性 4min ；94°C變性 lmin，47°C退火 lmin， 72°C延伸lmin, 35個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸10min，4°C保存。( 二)實(shí)驗(yàn)結(jié)果1、PCR反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)1. 5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，大小約150bp (圖1)。2、PCR擴(kuò)增得到的TBTI基因保守區(qū)序列連T載體，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5 α，送北京諾賽基因公司測(cè)序結(jié)果(SEQ ID NO 1)及翻譯成蛋白質(zhì)(SEQ ID NO :2)。實(shí)施例2 =Genome-Walking克隆TBTI 5，端基因序列(一 )實(shí)驗(yàn)方法1、參照Takara公司Genome-Walking試劑盒說明書，根據(jù)已克隆的保守序列設(shè)計(jì)3 條特異引物 SPl (SEQ ID NO :13),SP2(SEQ ID NO 14)、SP3 (SEQ ID NO 15)，利用試劑盒自帶的3個(gè)兼并引物API、AP2、AP3分別進(jìn)行3次PCR，PCR產(chǎn)物經(jīng)1 %瓊脂糖凝膠電泳，采用瓊脂糖凝膠回收試劑盒(Omigal公司)回收后，與pGEMT Easy vector (ftOmega，美國(guó))連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，含100mg/ml青霉素的LB平板篩選陽性克隆，陽性克隆進(jìn)一步經(jīng)T載體引物的菌落PCR鑒定后，37°C培養(yǎng)12h，采用質(zhì)粒DNA提取試劑盒(Omigal 公司)提取質(zhì)粒DNA,送北京諾賽基因公司測(cè)序。利用NCBI (www. ncbi. nih. gov)的BLAST 在線分析工具進(jìn)行序列比對(duì)分析。蛋白質(zhì)的翻譯采用ExPASy網(wǎng)站的tool (http//expasy. org/tools/dna. html)進(jìn)行。( 二)實(shí)驗(yàn)結(jié)果1、三輪PCR反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)1. 5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，大小約210bp (圖2)。2、PCR 擴(kuò)增得到的TBTI基因5’端序列連T載體，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5 α，送北京諾賽基因公司測(cè)序結(jié)果(SEQ ID NO 3)及翻譯成蛋白質(zhì)(SEQ ID NO 4)。實(shí)施例3 :3，RACE克隆TBTI 3，端基因序列3，RACE cDNA第一鏈合成按TaKaRa公司試劑盒的說明書操作，參照TaKaRa公司 3'RACE試劑盒說明書，根據(jù)已克隆的保守序列設(shè)計(jì)2條特異引物外部引物GSPl (SEQ ID NO 16)和內(nèi)部引物GSP2(SEQ ID NO 17)，利用試劑盒自帶的2個(gè)兼并引物(外部引物APl 和內(nèi)部引物AP》分別進(jìn)行2次PCR，PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，采用瓊脂糖凝膠回收試劑盒(Omigal公司)回收后，與pGEMT Easy vector (ftOmega，美國(guó))連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌 DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，含100mg/ml青霉素的LB平板篩選陽性克隆，陽性克隆進(jìn)一步經(jīng)T載體引物的菌落PCR鑒定后，37°C培養(yǎng)12h，采用質(zhì)粒DNA提取試劑盒(Omigal公司)提取質(zhì)粒DNA，送北京諾賽基因公司測(cè)序。利用NCBI (www. ncbi. nih. gov)的BLAST在線分析工具進(jìn)行序列比對(duì)分析。蛋白質(zhì)的翻譯采用ExPASy網(wǎng)站的tool (http //expasy. org/tools/dna. html)進(jìn)行。( 二)實(shí)驗(yàn)結(jié)果1、兩輪PCR反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)1. 5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，大小約^Obp (圖3)。2、PCR擴(kuò)增得到的TBTI基因3’端序列連T載體，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5 α，送北京諾賽基因公司測(cè)序結(jié)果(SEQ ID NO 5)及翻譯成蛋白質(zhì)(SEQ ID NO :6)。實(shí)施例4 苦蕎麥胰蛋白酶抑制劑基因TBTI全長(zhǎng)序列的真核表達(dá)以苦蕎麥基因組DNA為模板，采用合成的上游引物(SEQ ID NO :7)和下游引物 (SEQ ID NO :8)，通過PCR獲得目的片段。用EcoR I和Not I對(duì)PCR產(chǎn)物及pPIC9K真核表達(dá)載體分別進(jìn)行雙酶切，連接。將鑒定的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至表達(dá)菌株GS115中構(gòu)建GS115/ Ppic9k/TBTL·將獲得的重組載體pPIC9k-TBTI質(zhì)粒用Mc I酶切，回收片段后電擊轉(zhuǎn)化巴斯德畢赤酵母。畢赤酵母感受態(tài)準(zhǔn)備、電擊轉(zhuǎn)化均參照Invitrogen公司畢赤酵母操作手冊(cè)。將獲得的轉(zhuǎn)化子分別點(diǎn)種到匪和MD平板，并設(shè)陽性對(duì)照GS115 β -gal (Hi s+Mut+)和陰性對(duì)照GSl 15Albumin (His+Muts)，在匪平板和MD平板均能正常生長(zhǎng)的菌落為陽性菌落。隨機(jī)挑選30個(gè)陽性菌落接種5ml BMGY中，30°C劇烈振蕩培養(yǎng)Mh，離心收集菌體，加:3ml BMMY 誘導(dǎo)培養(yǎng)基，30°C繼續(xù)培養(yǎng)48h。篩選出酶活性較高的菌株，命名GS115-pPIC-TBTIX(X為菌株編號(hào))。將GSl 15-pPIC-TBTIX接種于50mLBMGY中，30°C，220r/min振蕩培養(yǎng)，離心收集菌體，加入誘導(dǎo)培養(yǎng)基(利用1. 2. 4優(yōu)化的條件)，30°C，220r/min繼續(xù)培養(yǎng)，分別在O、12、24、 36、48、60、72、84、96、108和12011收集上清，通過對(duì)上清液進(jìn)行抑制活性測(cè)定和SDS-PAGE分析，檢測(cè)重組蛋白的表達(dá)情況。1、質(zhì)粒載體pPIC9K的準(zhǔn)備培養(yǎng)含有pPIC9K質(zhì)粒的大腸桿菌DH5 α于IOmL卡那抗性LB液體培養(yǎng)基中37°C 培養(yǎng)過夜，使用質(zhì)粒提取試劑盒按說明書提取PPIC9K質(zhì)粒。2) PCR產(chǎn)物、pPIC9K質(zhì)粒的雙酶切處理分別取上述PCR產(chǎn)物、pPIC9K質(zhì)粒進(jìn)行EcoR I、Not I雙酶切，酶切方法如下
權(quán)利要求
1.一種苦蕎麥胰蛋白酶抑制劑基因TBTI的克隆和表達(dá)方法，其特征在于，包含以下步驟Al，TBTI基因保守區(qū)序列的獲得根據(jù)其它植物胰蛋白酶抑制劑的蛋白質(zhì)氨基酸序列利用DNAMAN和ClustalW2. 0兩種生物信息學(xué)軟件進(jìn)行多重序列比對(duì)找出兩個(gè)保守區(qū)的氨基酸序列=WPELVG和RCDRV，利用已經(jīng)測(cè)得的苦蕎麥胰蛋白酶抑制劑N-端氨基酸序列和甜蕎的胰蛋白酶抑制劑基因序列設(shè)計(jì)兼并引物Pl =SEQ ID NO 11和P2 =SEQ IDNO :12，送 Invitrogen公司合成引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增；A2,TBTI基因5’末端序列的獲得參照Takara公司Genome-Walking試劑盒說明書，根據(jù)已克隆的保守序列設(shè)計(jì)3條特異引物SPl =SEQ ID NO :13、SP2 =SEQ ID NO :14、SP3 =SEQ ID N0:15，利用試劑盒自帶的3個(gè)兼并引物分別進(jìn)行3次PCR，PCR產(chǎn)物經(jīng)1 %瓊脂糖凝膠電泳，采用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收后，與pGEMT Easy vector連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α 感受態(tài)細(xì)胞，含100mg/ml青霉素的LB平板篩選陽性克隆，陽性克隆進(jìn)一步經(jīng)T載體引物的菌落PCR鑒定后，37°C培養(yǎng)12h，采用質(zhì)粒DNA提取試劑盒提取質(zhì)粒DNA，送北京諾賽基因公司測(cè)序；A3，TBTI基因3，末端序列的獲得3，RACE cDNA第一鏈合成按TaKaRa公司試劑盒的說明書操作，參照TaKaRa公司3’ RACE試劑盒說明書，根據(jù)步驟Al已克隆的保守區(qū)序列設(shè)計(jì)2條特異引物外部引物GSPl :SEQ ID NO :16和內(nèi)部引物GSP2 :SEQ ID N0:17，利用試劑盒自帶的2個(gè)兼并引物，分別進(jìn)行2次PCR，PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，采用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收后，與pGEMT Easy vector連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，含 100mg/ml青霉素的LB平板篩選陽性克隆，陽性克隆進(jìn)一步經(jīng)T載體引物的菌落PCR鑒定后，37°C培養(yǎng)12h，采用質(zhì)粒DNA提取試劑盒提取質(zhì)粒DNA，送北京諾賽基因公司測(cè)序；A4.TBTI全長(zhǎng)基因的獲得及在畢赤酵母中的高效表達(dá)設(shè)計(jì)帶酶切位點(diǎn)的引物P1、P2， 將回收的PCR產(chǎn)物經(jīng)EcoR I, Not I雙酶切后，連入同樣經(jīng)過雙酶切的含有AOXl啟動(dòng)子和氨芐青霉素、卡那霉素抗性基因的表達(dá)載體PPIC9K中；使用電擊轉(zhuǎn)化的方法，將含有TBTI 基因的表達(dá)載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)入畢赤酵母GSl 15感受態(tài)細(xì)胞中，通過MD平板篩選出陽性轉(zhuǎn)化子；
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟Al中的PCR反應(yīng)參數(shù)為 IOXPCR buffer 2. 5μ L,2. 5mmol/L dNTPs 2. O μ L, 25mmol/L MgCl2L 5 μ L，10 μ mol/L 引物各 1. O μ L，5U/M1 Taq 聚合酶 0. 2 μ L，50ng/ μ L DNA 模板 2. 5 μ L,加 ddH20 至 25 μ L。反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性^iin ；94°C變性lmin，47°C退火lmin，72°C延伸lmin，35個(gè)循環(huán)；最后 72°C 延伸 10min，4°C 保存。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟A4中的酶切方法如下
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟A4中的畢赤酵母GSl15感受態(tài)細(xì)胞的制備方法為將畢赤酵母GS115劃線接種YPD平板，28-30°C培養(yǎng)直至長(zhǎng)出單菌落； 挑取一個(gè)單菌落，接種至含有5mL YPD培養(yǎng)基的50mL三角瓶中，28-30°C、250-300rpm培養(yǎng)過夜；取300 μ L的培養(yǎng)物接種至含有500ml YPD液體培養(yǎng)基中，28-30°C >250-300rpm培養(yǎng)過夜，至0D600達(dá)到1. 3左右；將細(xì)胞培養(yǎng)物于4°C，1500g離心5min，用500ml的冰預(yù)冷的無菌去離子水重懸菌體；4°C，1500g離心5min，用250mL的冰預(yù)冷的無菌水重懸菌體；4°C， 1500g離心5min，用20mL的冰預(yù)冷的lmol/L的山梨醇溶液重懸菌體；4°C，1500g離心5min， 用2mL的冰預(yù)冷的lmol/L的山梨醇溶液重懸菌體，等分細(xì)胞懸液為100 μ L/管。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟Α4中所述電擊轉(zhuǎn)化的方法為 吸取20 μ L的線性化DNA加入100 μ L酵母感受態(tài)細(xì)胞中，邊加入邊攪拌混勻，然后轉(zhuǎn)入 0. 2cm冰預(yù)冷的電轉(zhuǎn)化杯中，將電轉(zhuǎn)化杯冰浴5min，在Bio-Rad電穿孔儀上選擇畢赤酵母電擊參數(shù)，進(jìn)行電擊并同時(shí)進(jìn)行電擊條件的優(yōu)化，電擊完畢后，立即加入Iml冰預(yù)冷的lmol/L 的山梨醇溶液將菌體混勻，轉(zhuǎn)至1. 5mL離心管中，28-30°C溫育30min，將菌體懸液涂布于MD 平板上，每400 μ L涂布一塊平板，將平板置于培養(yǎng)，直至單個(gè)菌落出現(xiàn)，即為含有苦蕎麥胰蛋白酶抑制劑基因TBTI的轉(zhuǎn)化子。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種苦蕎麥胰蛋白酶抑制劑基因TBTI的克隆和表達(dá)方法，包含以下步驟A1，TBTI基因保守區(qū)序列的獲得；A2，TBTI基因5’末端序列的獲得；A3，TBTI基因3’末端序列的獲得；A4，TBTI全長(zhǎng)基因的獲得；實(shí)現(xiàn)了苦蕎麥胰蛋白酶抑制劑基因在畢赤酵母中的高效表達(dá)。
文檔編號(hào)C07K14/81GK102191240SQ20111005076
公開日2011年9月21日 申請(qǐng)日期2011年3月3日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月3日
發(fā)明者吳琦, 廖 燕, 李成磊, 茍君波, 阮景軍, 陳惠 , 韓學(xué)易 申請(qǐng)人:四川農(nóng)業(yè)大學(xué)