專利名稱：高純度烏司他丁及其制備方法和含有烏司他丁的藥物組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及高純度烏司他丁和含有烏司他丁的藥物組合物，以及它們的制備方法。更具體地，本發(fā)明涉及無色、高澄清度、效價(jià)高、人尿激肽原酶含量不超過0.0003PNAU的烏司他丁，及其制備方法和含有該烏司他丁的藥物組合物。
背景技術(shù)：
烏司他丁，又名人尿胰蛋白酶抑制劑(Human Urinary Trypsin Inhibitor)，是從人體尿液中分離純化的一種胰蛋白酶抑制劑，1909年，Beurer和Reich第一次報(bào)道了人體尿液中存在這種胰蛋白酶抑制劑。烏司他丁是由143個(gè)氨基酸組成的一種糖蛋白，N端為丙氨酸，C端為亮氨酸，在第10位絲氨酸和45位天冬氨酸上有糖鏈。絲氨酸上的O-糖苷鏈包含多個(gè)硫酸軟骨素單元(5個(gè)Ch4S和10個(gè)Ch0S)。烏司他丁的分子量經(jīng)HPLC法測(cè)定為60～70KD，經(jīng)SDS-PAGE測(cè)定為40～50KD，等電點(diǎn)為2.6，是一種對(duì)熱穩(wěn)定的酸性蛋白。
烏司他丁多樣的生物功能與其獨(dú)特的分子結(jié)構(gòu)相關(guān)，烏司他丁主要由三個(gè)功能域構(gòu)成，包括0連接糖基化區(qū)域(Ala1-Lys21)、N端Kunitz型結(jié)構(gòu)域I(Lys22-Arg77)和具有胰蛋白酶抑制活性的C端Kunitz型結(jié)構(gòu)域II(Thr78-Leu143)。兩個(gè)Kunitz型結(jié)構(gòu)域具有一定的同源性，每個(gè)結(jié)構(gòu)域中都含有6個(gè)保守的半胱氨酸，通過形成3對(duì)二硫鍵維持一定的空間構(gòu)型。烏司他丁的酶抑制活性主要存在于主體蛋白骨架中的Kunitz型結(jié)構(gòu)域。
烏司他丁對(duì)多種水解酶具有有效的抑制作用，對(duì)細(xì)胞膜、溶酶體膜有明顯的穩(wěn)定作用。烏司他丁在人體內(nèi)不僅僅是一種酶抑制劑，同時(shí)還是參與細(xì)胞表達(dá)分泌調(diào)控的重要生理活性物質(zhì)，在炎癥等疾病狀態(tài)下，烏司他丁由粒細(xì)胞酶水解釋放到血液中，參與炎癥反應(yīng)的調(diào)控，局限炎癥反應(yīng)，幫助組織的修復(fù)；在機(jī)體遭遇重大打擊，發(fā)生全身炎癥反應(yīng)時(shí)，減輕過度釋放的炎癥介質(zhì)對(duì)機(jī)體組織造成的損傷。烏司他丁在臨床上用于急性胰腺炎、急性循環(huán)障礙的治療，以及大中型手術(shù)期的器官保護(hù)和危重癥中全身性炎癥反應(yīng)、多器官功能障礙綜合癥的預(yù)防等。
目前臨床使用的烏司他丁產(chǎn)品，由于存在雜蛋白及一些有色基團(tuán)，導(dǎo)致其效價(jià)低，穩(wěn)定性不好，使溶液呈現(xiàn)黃色，又因存在少量人尿激肽原酶而使產(chǎn)品有潛在的降壓副作用，因此去除這些雜質(zhì)進(jìn)一步提高烏司他丁臨床應(yīng)用的安全性是十分必要的。
因此，本領(lǐng)域的技術(shù)人員仍在不斷地探索更好的純化工藝，以提供高純度、性能穩(wěn)定、無副作用的烏司他丁。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是克服現(xiàn)有的烏司他丁純度不高的缺陷，提供一種效價(jià)高、穩(wěn)定性好、純度高、無副作用的烏司他丁。本發(fā)明是通過采用特定的純化工藝實(shí)現(xiàn)上述目的的。
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種高純度烏司他丁。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種制備所述的高純度烏司他丁的方法。
本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供一種以高純度烏司他丁作為活性成分的藥物組合物。
本發(fā)明的目的是通過以下的技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)一種高純度烏司他丁，其特征在于該烏司他丁具有以下特性-濃度為5萬單位/ml時(shí)，在405nm處的光吸收值不超過0.05，人尿激肽原酶的含量不超過0.0003PNAU；-采用十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠(PAGE)電泳，即SDS-PAGE法測(cè)定的分子量為40,000±3,000Da或采用高效液相色譜(HPLC)法測(cè)定的分子量為67,000±5,000Da；-抑制胰蛋白酶的活性不低于3500單位/mg蛋白(采用凱氏定氮法測(cè)定蛋白含量)。
優(yōu)選，本發(fā)明的烏司他丁具有以下特性-濃度為5萬單位/ml時(shí)，在405nm處的光吸收值不超過0.03，人尿激肽原酶的含量不超過0.0002PNAU；-采用十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠(PAGE)電泳，即SDS-PAGE法測(cè)定的分子量為40,000±3,000Da或采用高效液相色譜法(HPLC)測(cè)定的分子量為67,000±5,000Da；-抑制胰蛋白酶的活性不低于3500單位/mg蛋白(采用凱氏定氮法測(cè)定蛋白含量)。
在本文中，烏司他丁單位被定義為2μg胰蛋白酶活性50％被抑制時(shí)烏司他丁的量為1個(gè)單位。
在本文中，“PNAU”被定義為在37℃ pH8.0的條件下，1分鐘水解1μmolVal-Leu-Arg-PNA的人尿激肽原酶量為1PNA單位。
本發(fā)明還涉及一種以本發(fā)明高純度烏司他丁為活性成分的藥物組合物，其包含有效量的烏司他丁和醫(yī)學(xué)上可接受的藥用輔料。這里所述的醫(yī)學(xué)上可接受的藥用輔料包括甘露醇、甘氨酸或右旋糖酐等。該藥物組合物可以是冷凍干燥的形式或無菌液體形式，通過生理鹽水溶解稀釋后進(jìn)行靜脈注射給藥。每單位劑量可含2～100萬烏司他丁單位。
本發(fā)明所述的烏司他丁是通過以下工藝步驟制備得到的a.將尿泵入攪拌池中，調(diào)節(jié)pH至4.5～6，加入甲殼素吸附，用硫酸銨溶液洗脫，洗脫液進(jìn)行抽濾，抽干產(chǎn)品為烏司他丁粗制品；b.取烏司他丁粗制品加2～3倍水溶解后，過濾，取上清液，調(diào)節(jié)pH為6-7.5后用乙醇沉淀，將沉淀用水溶解過濾，所得濾液上陰離子交換柱，用含有0.1-2mol/L NaCl及0.1-0.5mol/L磷酸鹽的緩沖液洗脫，收集洗脫液；c.調(diào)節(jié)該洗脫液pH至7.0～9.0，然后上金屬螯合柱，用含有0.1-2mol/L NaCl及0.1-0.5mol/L磷酸鹽的緩沖液洗脫，收集洗脫液；d.調(diào)節(jié)該洗脫液pH至7.0～9.0，然后上親和層析柱，用含0.1-2mol/L NaCl及0.1-0.5mol/L的磷酸鹽緩沖液沖洗，收集沖洗液，加入0.05-0.5g EDTA-Na/L，用超濾膜超濾；e.調(diào)節(jié)超濾液pH至4.0～6.0，上疏水柱吸附，用含有0.1-2mol/L NaCl及0.1-0.5mol/L醋酸鈉的緩沖液進(jìn)行梯度洗脫，收集洗脫液；f.調(diào)整洗脫液pH至5.0-6.0，上陰離子交換柱，用含有0.1-2mol/L NaCl及0.1-0.5mol/L磷酸鹽緩沖液洗脫，洗脫液用超濾膜超濾，即得高純度的烏司他丁。
本發(fā)明制備工藝中使用的陰離子交換柱包括強(qiáng)陰離子交換柱Q Sepharose H.P，QSepharose F.F，Q Sepharose 4 F.F，Q Sepharose XL，QAE Sephadex A-25，QAESephadex A-50，STREAMLINE Q XL；弱陰離子交換柱DEAE Sepharose F.F，DEAESephadex A-25，DEAE Sephadex A-50，STREAMLINE DEAE。陰離子交換柱的作用，是用于處理凈電荷為負(fù)的蛋白質(zhì)。上述陰離子交換柱使用的填料可購自美國AmershamBioscience公司。優(yōu)選，QAE Sephadex A-25和QAE Sephadex A-50。
本發(fā)明制備工藝中使用的金屬螯合柱包括金屬螯合柱Chelating Sepharose FastFlow，Co Sepharose FF，Ni Sepharose FF，Cu Sepharose FF。金屬螯合柱可反復(fù)螯合不同金屬，用以結(jié)合金屬依賴的蛋白以去除這類雜蛋白。金屬螯合柱使用的填料可購自美國Amersham Bioscience公司，優(yōu)選Co Sepharose FF。
本發(fā)明制備工藝中使用的親和層析柱包括以苯基-載體-苯扎嘧啶交聯(lián)復(fù)合物作為層析材料的親和層析柱，親和層析柱NHS activated Sepharose 4FF、CNBr activatedSepharose 4FF、CNBr activated Sepharose 4B、CNBr activated Sepharose 6MB、ActivatedCH Sepharose 4B、Arginine Sepharose 4B、Benzamidine Sepharose 6B、BenzamidineSepharose 4FF。本工藝使用的親和層析填料可購自美國Amersham Bioscience公司。本發(fā)明親和層析柱中采用的親和層析材料能與烏司他丁溶液中的激肽原酶物質(zhì)發(fā)生親和吸附，未被吸附的烏司他丁成分被緩沖液沖洗下來，從而達(dá)到有效去除激肽原酶物質(zhì)的目的。優(yōu)選的親和層析材料為苯基-載體-苯扎嘧啶交聯(lián)復(fù)合物、Benzamidine Sepharose 6B和Benzamidine Sepharose 4FF。
本發(fā)明制備工藝中使用的疏水柱包括Butyl Sepharose 4 Fast Flow，OctylSepharose 4 Fast Flow，Phenyl Sepharose 6 Fast Flow，Butyl-S Sepharose 6 Fast Flow，Butyl Sepharose 4B，Octyl Sepharose CL-4B，Phenyl Sepharose CL-4B。疏水柱的作用，是利用烏司他丁分子表面疏水區(qū)域，在一定的實(shí)驗(yàn)條件下與疏水柱介質(zhì)產(chǎn)生結(jié)合力。本發(fā)明工藝中使用的疏水柱填料可以從美國Amersham Bioscience公司購買，優(yōu)選ButylSepharose 4 Fast Flow和Phenyl Sepharose 6 Fast Flow。
本發(fā)明制備工藝中使用的超濾膜包括分子量為5000-3萬的超濾膜。這里所使用的超濾膜可按分子量大小不同濃縮和保留目的蛋白烏司他丁，同時(shí)除去分子量比烏司他丁較小的雜質(zhì)分子。優(yōu)選，分子量為1萬和分子量為3萬的超濾膜。
本發(fā)明制備的烏司他丁純度不低于98.0％(采用高效液相色譜法)，在濃度為5萬單位/ml時(shí)為無色或幾乎無色，其對(duì)多種水解酶活性具有有效的抑制作用。
本發(fā)明烏司他丁產(chǎn)品的顏色測(cè)定方法為將烏司他丁樣品加水制成每1ml中含5萬單位的溶液，以水為空白，照紫外分光光度法測(cè)定溶液在405nm處的光吸收值。
本發(fā)明烏司他丁產(chǎn)品中所含的人尿激肽原酶物質(zhì)的測(cè)定方法為將烏司他丁產(chǎn)品加水制成1ml中約含50,000單位的溶液作為樣品溶液。取試管2支，各精密加入樣品溶液0.4ml，再分別加入0.2mol/L Tris-HCL緩沖液0.5ml，混勻，置37±0.5℃水浴中保溫5分鐘，再于第1管中加入50％醋酸溶液0.1ml，第2管中加入底物溶液(取S-2266[相當(dāng)于H-D-Val-Leu-Arg-PNA·2HCl]25mg，加水制成0.0015mol/L)溶液0.1ml，立即搖勻，同時(shí)計(jì)時(shí)，置37±0.5℃水浴中準(zhǔn)確反應(yīng)30分鐘，然后在第1管中加入底物溶液(取S-2266[相當(dāng)于H-D-Val-Leu-Arg-PNA·2HCl]25mg，加水制成0.0015mol/L溶液)0.1ml，第2管中加入50％醋酸溶液0.1ml，照紫外分光光度法，在405nm波長處測(cè)定，以第1管為空白，測(cè)定第2管的吸收值A(chǔ)，按公式9.55×A/1000計(jì)算人尿激肽原酶的含量(PNAU)。
本發(fā)明烏司他丁制備工藝中，經(jīng)所述的工藝步驟得到了高純度、無色澄清的烏司他丁，尤其是經(jīng)疏水柱吸附和親和層析柱純化，能有效去除雜蛋白和人尿激肽原酶物質(zhì)，而其理化性質(zhì)和生理活性不發(fā)生改變。本發(fā)明還利用金屬螯合柱和金屬蛋白結(jié)合，通過磷酸鹽緩沖液進(jìn)行洗脫，去除烏司他丁溶液中的雜蛋白及一些有色基團(tuán)。
本發(fā)明的烏司他丁純度高，穩(wěn)定性好，幾乎不含人尿激肽原酶，因此，其在臨床使用中安全性更高，幾乎沒有任何副作用。
具體實(shí)施方案下列實(shí)施例是為了進(jìn)一步舉例描述本發(fā)明，而不是以任何方式限制本發(fā)明。
實(shí)施例1 一種高純度烏司他丁，其由以下步驟制備得到(a)將1.1噸尿泵入攪拌池中，調(diào)節(jié)pH至5.5，加入500g甲殼素吸附，用濃度為10％的硫酸銨溶液(pH7.0)洗脫，洗脫液用硅藻土作過濾介質(zhì)，進(jìn)行抽濾，抽干出烏司他丁粗制品100g；(b)取烏司他丁粗制品100g，加300ml水?dāng)嚢枞芙?，板框過濾，濾液循環(huán)5～10分鐘，澄清后過濾取上清液，用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH6.5±0.2，加入1.1倍95％乙醇進(jìn)行第一次沉淀，取上清液，加2.5倍95％乙醇進(jìn)行第二次沉淀，取沉淀，加入5倍水充分溶解，過濾；取濾液，按400cm/h的流速上陰離子交換柱QAE Sephadex A-25，用含0.5mol/L NaCl及0.1mol/L磷酸鹽的緩沖液沖洗柱子至流出液OD280＜0.2，用含0.5mol/L NaCl及0.1mol/L磷酸鹽的緩沖液洗脫柱子，收集OD280＞0.2的洗脫峰，從中取樣作為樣品A；(c)調(diào)節(jié)洗脫液pH至7.0，上金屬螯合吸附柱Co Sepharose FF，用含0.5mol/L NaCl及0.1mol/L磷酸鹽的緩沖液進(jìn)行洗脫，收集洗脫液，從中取樣作為樣品B；(d)調(diào)洗脫液pH至7.0，然后上以苯基-載體-苯扎嘧啶交聯(lián)復(fù)合物為層析材料的親和層析柱，用含0.1mol/L NaCl及0.1mol/L的磷酸鹽緩沖液沖洗，收集沖洗液，加入0.3gEDTA-Na/升，用分子量為3萬的超濾膜超濾，從中取樣作為樣品C；(e)調(diào)節(jié)超濾液pH至4.0，上疏水柱Octyl Sepharose CL-4B吸附，用含0.5mol/L NaCl及0.1mol/L醋酸鈉的緩沖液進(jìn)行梯度洗脫，收集洗脫液；(f)調(diào)整洗脫液pH至5.0后，60℃加熱10小時(shí)，上陰離子交換柱DEAE Sephadex A-25，，用含0.5mol/L NaCl及0.1mol/L磷酸鹽的緩沖液進(jìn)行洗脫，洗脫液用分子量1萬的超濾膜超濾，即得高純度烏司他丁，從中取樣作為樣品D。
將樣品液A、B、C、D稀釋至每毫升5萬單位的烏司他丁進(jìn)行顏色和激肽原酶分析，并將烏司他丁產(chǎn)品進(jìn)行其它理化指標(biāo)的檢查，結(jié)果見表1和表2。
表1

表2烏司他丁溶液測(cè)定結(jié)果

表1結(jié)果證明，烏司他丁溶液經(jīng)疏水吸附和親和層析，得到高純度的烏司他丁，濃度為5萬單位/ml的溶液，在405nm處的光吸收值為0.012；烏司他丁產(chǎn)品中幾乎不含有人尿激肽原酶物質(zhì)，即濃度為5萬單位/ml的溶液中人尿激肽原酶物質(zhì)的含量僅為0.0001PNA單位。烏司他丁溶液經(jīng)疏水吸附和親和層析工藝不會(huì)引起其理化指標(biāo)的改變。
實(shí)施例2 一種高純度烏司他丁，其由以下步驟制備得到(a)將1.1噸尿泵入攪拌池中，調(diào)節(jié)pH至6.0，加入500g甲殼素吸附，用濃度為10％的硫酸銨溶液(pH9.0)洗脫，洗脫液用硅藻土作過濾介質(zhì)，進(jìn)行抽濾，抽干出烏司他丁粗制品100g；(b)取烏司他丁粗制品100g，加200ml水?dāng)嚢枞芙?，板框過濾，濾液循環(huán)5～10分鐘，澄清后過濾取上清液，用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH6.5±0.2，加入1.1倍95％乙醇進(jìn)行第一次沉淀，取上清液，加2.5倍95％乙醇進(jìn)行第二次沉淀，取沉淀，加入6倍水充分溶解，過濾；取濾液，按100cm/h的流速上陰離子交換柱Q Sepharose H.P，用含0.5mol/L NaCl及0.5mol/L磷酸鹽的緩沖液沖洗柱子至流出液OD280＜0.2，用含0.5mol/L NaCl及0.5mol/L磷酸鹽緩沖液洗脫柱子，收集OD280＞0.2的洗脫峰，從中取樣作為樣品A；(c)調(diào)節(jié)洗脫液pH至9.0，上金屬螯合吸附柱Co Sepharose FF，用含0.5mol/L NaCl及0.5mol/L磷酸鹽的緩沖液進(jìn)行洗脫，收集洗脫液，從中取樣作為樣品B；(d)調(diào)洗脫液pH至9.0，然后上親和層析柱NHS activated Sepharose 4FF，用含0.5mol/L NaCl及0.1mol/L的磷酸鹽的緩沖液沖洗，收集沖洗液，加入0.3gEDTA-Na/升，用分子量為3萬的超濾膜超濾，從中取樣作為樣品C；(e)調(diào)節(jié)超濾液pH至6.0，上疏水柱Butyl Sepharose 4 Fast Flow吸附，用含0.5mol/LNaCl及0.1mol/L醋酸鈉的緩沖液進(jìn)行梯度洗脫，收集洗脫液；(f)調(diào)整洗脫液pH至6.0，60℃加熱10小時(shí)，上陰離子交換柱Q Sepharose F.F，用含0.5mol/L NaCl及0.1mol/L磷酸鹽的緩沖液進(jìn)行洗脫，洗脫液用分子量1萬的超濾膜超濾，即得高純度烏司他丁，從中取樣作為樣品D；將樣品液A、B、C、D稀釋至每毫升5萬單位的烏司他丁進(jìn)行顏色和激肽原酶分析，并將烏司他丁產(chǎn)品進(jìn)行其它理化指標(biāo)的檢查，結(jié)果見表1和表2。
表1

表2烏司他丁溶液測(cè)定結(jié)果


表1結(jié)果證明，烏司他丁溶液經(jīng)疏水吸附和親和層析，得到高純度的烏司他丁，濃度為5萬單位/ml的溶液，在405nm處的光吸收值為0.040；烏司他丁產(chǎn)品中幾乎不含有人尿激肽原酶物質(zhì)，即濃度為5萬單位/ml的溶液中人尿激肽原酶物質(zhì)的含量僅為0.0003PNA單位。烏司他丁溶液經(jīng)疏水吸附和親和層析工藝不會(huì)引起其理化指標(biāo)的改變。
實(shí)施例3一種含烏司他丁的藥物組合物每劑量單位的烏司他丁藥物組合物中含有實(shí)施例2中制備的高純度烏司他丁 10萬單位甘露醇 30mg制備方法取實(shí)施例2中制備的高純度烏司他丁1億單位，稱取甘露醇30g，加500ml注射用水溶解，混合后調(diào)節(jié)PH值至6～7，再添加注射用水至2000毫升，濾膜無菌過濾，分裝于1000個(gè)西林瓶中，凍干扎蓋即成。
以下通過臨床實(shí)驗(yàn)說明本發(fā)明烏司他丁的安全性選擇健康人為受試者，受試藥為本發(fā)明實(shí)施例3的烏司他丁藥物，分別進(jìn)行了單次給藥耐受性和多次給藥耐受性試驗(yàn)。單次給藥試驗(yàn)中，將受試者隨機(jī)分成7個(gè)劑量組，每次只做一個(gè)劑量，試驗(yàn)從初試劑量至高劑量逐個(gè)劑量組依次進(jìn)行，每組分別給以10萬、20萬、40萬、60萬、80萬、100萬和120萬單位的烏司他丁，每天靜脈滴注一次，用藥1天。單次用藥組于0.5、1、2、4、8、12、24小時(shí)觀察記錄一般情況、臨床癥狀和體征，第24小時(shí)進(jìn)行各項(xiàng)理化檢查，如出現(xiàn)不良反應(yīng)，隨時(shí)作相應(yīng)的理化檢查。多次給藥試驗(yàn)中，將受試者隨機(jī)分成2個(gè)劑量組，每次只做一個(gè)劑量，試驗(yàn)從初試劑量至高劑量逐個(gè)劑量組依次進(jìn)行，每組分別給以90萬和120萬單位的烏司他丁，每天靜脈滴注3次，連續(xù)用藥7天。多次用藥組用藥后每天觀察記錄一般情況、臨床癥狀和體征，停藥后24小時(shí)進(jìn)行各項(xiàng)理化檢查。無不良反應(yīng)者，停藥后隨訪3天，觀察有無不良反應(yīng)出現(xiàn)，同時(shí)觀察一般情況、臨床癥狀和體征。
臨床研究證明，單次給藥安全劑量最大為120萬單位；多次給藥安全劑量最大為90萬單位，單次給藥和多次給藥各劑量組均無中度不良反應(yīng)發(fā)生，且血壓無明顯變化。由此看出本發(fā)明的高純度的烏司他丁臨床應(yīng)用是安全的。
權(quán)利要求
1.一種高純度烏司他丁，其特征在于該烏司他丁具有以下特性-濃度為5萬單位/ml時(shí)，在405nm處的光吸收值不超過0.05，人尿激肽原酶的含量不超過0.0003PNAU。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的高純度烏司他丁，其特征在于該烏司他丁具有以下特性-濃度為5萬單位/ml時(shí)，在405nm處的光吸收值不超過0.03，人尿激肽原酶的含量不超過0.0002PNAU；-采用十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠(PAGE)電泳，即SDS-PAGE法測(cè)定的分子量為40,000±3,000Da或采用高效液相色譜法測(cè)定的分子量為67,000±5,000Da；-抑制胰蛋白酶的活性不低于3500單位/mg蛋白(采用凱氏定氮法測(cè)定蛋白含量)。
3.制備根據(jù)權(quán)利要求1-2的高純度烏司他丁的方法，其包括以下步驟a.將尿泵入攪拌池中，調(diào)節(jié)pH至4.5～6，加入甲殼素吸附，用硫酸銨溶液洗脫，洗脫液進(jìn)行抽濾，抽干產(chǎn)品為烏司他丁粗制品；b.取烏司他丁粗制品加2～3倍水溶解后，過濾，取上清液，調(diào)節(jié)pH為6-7.5后用乙醇沉淀，將沉淀用水溶解過濾，所得濾液上陰離子交換柱，用含有0.1-2mol/L NaCl及0.1-0.5mol/L磷酸鹽的緩沖液洗脫，收集洗脫液；c.調(diào)節(jié)該洗脫液pH至7.0～9.0，然后上金屬螯合柱，用含有0.1-2mol/L NaCl及0.1-0.5mol/L磷酸鹽的緩沖液洗脫，收集洗脫液；d.調(diào)節(jié)該洗脫液pH至7.0～9.0，然后上親和層析柱，用含0.1-0.5mol/LnaCl及0.1-0.5mol/L的磷酸鹽緩沖液沖洗，收集沖洗液，加入0.05-0.5g EDTA-Na/L，用超濾膜超濾；e.調(diào)節(jié)超濾液pH至4.0～6.0，上疏水柱吸附，用含有0.1-2mol/L NaCl及0.1-0.5mol/L醋酸鈉的緩沖液進(jìn)行梯度洗脫，收集洗脫液；f.調(diào)整洗脫液pH至5.0-6.0，上陰離子交換柱，用含有0.1-2mol/L NaCl及0.1-0.5mol/L磷酸鹽緩沖液洗脫，洗脫液用超濾膜超濾，即得高純度的烏司他丁。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的制備方法，其中所述的陰離子交換柱包括強(qiáng)陰離子交換柱Q SepharoseH.P，Q Sepharose F.F，Q Sepharose 4 F.F，Q Sepharose XL，QAE Sephadex A-25，QAE Sephadex A-50，STREAMLINE Q XL；弱陰離子交換柱DEAE Sepharose F.F，DEAESephadex A-25，DEAE Sephadex A-50，STREAMLINE DEAE。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的制備方法，其中所述的金屬螯合柱包括金屬螯合柱ChelatingSepharose Fast Flow，Co Sepharose FF，Ni Sepharose FF，Cu Sepharose FF。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的制備方法，其中所述的親和層析柱包括以苯基-載體-苯扎嘧啶交聯(lián)復(fù)合物作為層析材料的親和層析柱，親和層析柱NHS activated Sepharose 4FF、CNBractivated Sepharose 4FF、CNBr activated Sepharose 4B、CNBr activated Sepharose 6MB、Activated CH Sepharose 4B、Arginine Sepharose 4B、Benzamidine Sepharose 6B、Benzamidine Sepharose 4FF。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的制備方法，其中所述的疏水柱包括Butyl Sepharose 4 Fast Flow，Octyl Sepharose 4 Fast Flow，Phenyl Sepharose 6 Fast Flow，Butyl-S Sepharose 6 FastFlow，Butyl Sepharose 4B，Octyl Sepharose CL-4B，Phenyl Sepharose CL-4B。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的制備方法，其中所述的超濾膜包括分子量為5000-3萬的超濾膜。
9.根據(jù)權(quán)利要求3-8的方法制備得到的高純度烏司他丁。
10.一種藥物組合物，其含有根據(jù)權(quán)利要求1，2，9的高純度烏司他丁作為活性成分。
全文摘要
本發(fā)明涉及高純度烏司他丁和含有該烏司他丁的藥物組合物，以及它們的制備方法。更具體地，本發(fā)明的高純度烏司他丁在濃度為5萬單位/ml時(shí)，在405nm處的光吸收值不超過0.05，人尿激肽原酶的含量不超過0.0003PNAU；本發(fā)明是經(jīng)疏水柱吸附和親和層析柱純化，以及利用金屬螯合柱和金屬蛋白結(jié)合，通過磷酸鹽緩沖液進(jìn)行洗脫，使烏司他丁得以純化。
文檔編號(hào)C07K1/00GK1931875SQ20061000060
公開日2007年3月21日 申請(qǐng)日期2006年1月9日 優(yōu)先權(quán)日2006年1月9日
發(fā)明者傅和亮, 王曉巖, 苗丕渠, 鄭少亮, 許文勤, 侯永敏 申請(qǐng)人:廣東天普生化醫(yī)藥股份有限公司