一種親和層析純化烏司他丁的方法及提高烏司他丁穩(wěn)定性的藥物組合物的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地說(shuō)涉及一種應(yīng)用親和層析法制備收率高、效價(jià)穩(wěn)定的烏司他丁的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]烏司他丁(ULinastatin)系從健康成年男性新鮮尿液中分離純化出來(lái)的一種酸性糖蛋白，是一種廣譜的蛋白酶抑制劑，主要在肝臟中合成，由腎臟代謝隨尿液排出，且其分解形成的低分子量成分也具有很強(qiáng)的抑制水解酶的作用。烏司他丁由143個(gè)氨基酸組成，相對(duì)分子質(zhì)量約37000~43000，屬于蛋白酶抑制劑，對(duì)胰蛋白酶、α -糜蛋白酶等絲氨酸蛋白酶及粒細(xì)胞彈性蛋白酶、透明質(zhì)酸酶、巰基酶、纖溶酶等多種酶有抑制作用，還具有穩(wěn)定溶酶體膜、抑制溶酶體酶的釋放、抑制心肌抑制因子(MDF)產(chǎn)生、清除氧自由基及抑制炎癥介質(zhì)釋放的作用。烏司他丁還可改善手術(shù)刺激引起的免疫功能下降、蛋白代謝異常和腎功能降低，防止手術(shù)刺激引起的對(duì)內(nèi)臟器官與細(xì)胞的損傷以及改善休克時(shí)的循環(huán)狀態(tài)等。
[0003]1909年歐洲首先報(bào)道人體尿液存在著胰蛋白酶抑制劑，隨后人們發(fā)現(xiàn)，當(dāng)人體受到感染、發(fā)熱、腫瘤、妊娠、休克、手術(shù)、給予糖皮質(zhì)激素等刺激時(shí)，人體尿液中UTI活性升高。1985年由日本首先開(kāi)發(fā)上市，在日本已作為急性胰腺炎、急性循環(huán)衰竭的治療藥物被廣泛應(yīng)用于臨床。
[0004]本發(fā)明人自2008年開(kāi)始對(duì)UTI的生產(chǎn)工藝進(jìn)行試驗(yàn)研究，采用現(xiàn)代蛋白質(zhì)高端生化分離技術(shù)進(jìn)行生產(chǎn)，使UTI的總收率提高到70%以上，總效價(jià)不低于5000iu/mg，生產(chǎn)工藝穩(wěn)定，質(zhì)s;可控。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明提供了一種親和層析純化烏司他丁的方法及提高烏司他丁穩(wěn)定性的藥物組合物，是為了攻克高嶺土吸附、耐酸性混合模式吸附等傳統(tǒng)方法提取烏司他丁收率過(guò)低、效價(jià)不高不穩(wěn)定的缺點(diǎn)，采用親和層析來(lái)純化烏司他丁，從而提高了烏司他丁的收率，保證了效價(jià)的穩(wěn)定。
[0006]為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn):
一種親和層析純化烏司他丁的方法及提高烏司他丁穩(wěn)定性的藥物組合物，其特征在于:選用特異樹(shù)脂的親和層析來(lái)純化烏司他丁，可以使總收率提高到70%以上，總效價(jià)不低于 5000iu/mgo
[0007]該技術(shù)方案中，還具有以下技術(shù)特征:所述親和層析法包括如下步驟:
1)烏司他丁粗加工
稱取IT pH小于6.5的澄清尿液，不斷攪拌，緩慢加入16.5kg甲殼質(zhì)吸附完全后用氨水洗脫，再經(jīng)過(guò)3.5kg硫酸銨鹽析，過(guò)夜沉淀、離心后置于用五氧化二磷作吸水劑的真空干燥器中真空干燥，干燥后即得烏司他丁粗品。
[0008]2)吸附柱層析(以0.25L柱體為例)
2.1)稱取烏司他丁粗品1kg，用洗脫液A溶解，攪拌30分鐘，離心20分鐘，留取離心液；
2.2)陰離子交換柱用洗脫液B平衡，將上述離心液流經(jīng)平衡好的陰離子交換柱，流速控制在120~130mL/min左右；
2.3)用洗脫液B溶液洗脫，流速控制在120~130mL/min，得洗脫液；
2.4)將洗脫液經(jīng)超濾膜，超濾至其體積的二十分之一，得超濾液約1.65L。
[0009]3)親和層析(以0.25L柱體為例)
3.1)用洗脫液C平衡親和層析柱，將超濾液流經(jīng)平衡過(guò)的樹(shù)脂柱，流速控制在120~130mL/min ；
3.2)上樣結(jié)束后，用洗脫液C洗脫，流速120~130mL/min左右，收集洗脫液；
3.3)柱中的親和樹(shù)脂經(jīng)洗脫液C洗脫后，用洗脫液D洗滌去除吸附在上面的雜質(zhì)，流速控制在120~130mL/min，密封待用；
3.4)洗脫液經(jīng)超濾膜超濾至一定體積，超濾液中加入一定量磷酸氫二鈉溶液，繼續(xù)超濾至同一體積，然后再加入等量磷酸氫二鈉溶液，再經(jīng)超濾膜超濾至相同體積。
[0010]4)沉淀
超濾液中按1:6的比例加入不低95%的乙醇沉淀12小時(shí)，離心，固體再用無(wú)水乙醇脫水兩次，離心，棄去上清液，留取沉淀物。
[0011]5)凍干
將沉淀物裝入盤(pán)進(jìn)凍干機(jī)，凍干即得烏司他丁。
[0012]經(jīng)核算，所得烏司他丁總收率高達(dá)70%以上，按中國(guó)藥典所示方法測(cè)定，總效價(jià)高達(dá) 5000iu/mg 以上。
[0013]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和積極效果是:
選用親和層析純化烏司他丁，可以更有效的去除烏司他丁中的多種雜蛋白，并且使其理化性質(zhì)和生物活性保持穩(wěn)定，從而使產(chǎn)品的各項(xiàng)指標(biāo)均符合中國(guó)藥典標(biāo)準(zhǔn)。更重要的是，通過(guò)工藝的不斷改進(jìn)和完善，使得烏司他丁總收率達(dá)到70%以上，總效價(jià)不低于5000iu/mg，創(chuàng)造了巨大的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。
【具體實(shí)施方式】
[0014]下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明，而不以任何方式限制。
[0015]實(shí)施例1
1)烏司他丁粗加工
稱取IT pH小于6.5的澄清尿液，不斷攪拌，緩慢加入16.5kg甲殼質(zhì)，并用精密pH試紙測(cè)定，調(diào)節(jié)尿液pH到6.0 ;吸附完全后用氨水洗脫lh，再經(jīng)過(guò)3.5kg硫酸銨鹽析，過(guò)夜沉淀、離心后置于用五氧化二磷作吸水劑的真空干燥器中真空干燥，干燥后即得烏司他丁粗品Ο
[0016]2)吸附柱層析(以0.25L柱體為例)
2.1)稱取烏司他丁粗品1kg，用8.5L的洗脫液A溶解，攪拌30分鐘，離心20分鐘，留取離心液； 2.2)陰離子交換柱用2.5L的洗脫液A平衡，將上述離心液流經(jīng)平衡好的陰離子交換柱，流速控制在120mL/min左右；
2.3)用33L的洗脫液B溶液洗脫，流速控制在120mL/min，得洗脫液；
2.4)將洗脫液經(jīng)超濾膜，超濾至其體積的二十分之一，得超濾液約1.65L。
[0017]3)親和層析(以0.25L柱體為例)
3.1)用3.0L的洗脫液C平衡親和層析柱，將超濾液流經(jīng)平衡過(guò)的樹(shù)脂柱，流速控制在120mL/min ；
3.2)上樣結(jié)束后，用10L的洗脫液C洗脫，流速120mL/min左右，收集洗脫液；
3.3)柱中的親和樹(shù)脂經(jīng)洗脫液C洗脫后，用5.0L的洗脫液D洗滌去除吸附在上面的雜質(zhì)，流速控制在120mL/min，密封待用；
3.4)洗脫液經(jīng)超濾膜超濾至170mL，超濾液中加入磷酸氫二鈉溶液830mL，繼續(xù)超濾至170mL，然后再加入830mL磷酸氫二鈉溶液，再經(jīng)超濾膜超濾至170mL。
[0018]4)沉淀
超濾液中按1:6的比例加入不低95%的乙醇沉淀12小時(shí)，離心，固體再用無(wú)水乙醇脫水兩次，離心，棄去上清液，留取沉淀物。