一種樹脂再生提高柱效純化烏司他丁的方法及提高烏司他丁復(fù)溶性的藥物組合物的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地說涉及一種特異性樹脂處理再生提高柱效制備收率高、效價(jià)穩(wěn)定的烏司他丁的方法及提高烏司他丁復(fù)溶性的藥物組合物。
【背景技術(shù)】
[0002]烏司他丁(ULinastatin)系從健康成年男性新鮮尿液中分離純化出來的一種酸性糖蛋白，是一種廣譜的蛋白酶抑制劑，主要在肝臟中合成，由腎臟代謝隨尿液排出，且其分解形成的低分子量成分也具有很強(qiáng)的抑制水解酶的作用。烏司他丁由143個(gè)氨基酸組成，相對(duì)分子質(zhì)量約37000~43000，屬于蛋白酶抑制劑，對(duì)胰蛋白酶、α -糜蛋白酶等絲氨酸蛋白酶及粒細(xì)胞彈性蛋白酶、透明質(zhì)酸酶、巰基酶、纖溶酶等多種酶有抑制作用，還具有穩(wěn)定溶酶體膜、抑制溶酶體酶的釋放、抑制心肌抑制因子(MDF)產(chǎn)生、清除氧自由基及抑制炎癥介質(zhì)釋放的作用。烏司他丁還可改善手術(shù)刺激引起的免疫功能下降、蛋白代謝異常和腎功能降低，防止手術(shù)刺激引起的對(duì)內(nèi)臟器官與細(xì)胞的損傷以及改善休克時(shí)的循環(huán)狀態(tài)等。
[0003]1909年歐洲首先報(bào)道人體尿液存在著胰蛋白酶抑制劑，隨后人們發(fā)現(xiàn)，當(dāng)人體受到感染、發(fā)熱、腫瘤、妊娠、休克、手術(shù)、給予糖皮質(zhì)激素等刺激時(shí)，人體尿液中UTI活性升高。1985年由日本首先開發(fā)上市，在日本已作為急性胰腺炎、急性循環(huán)衰竭的治療藥物被廣泛應(yīng)用于臨床。
[0004]本發(fā)明人自2008年開始對(duì)UTI的生產(chǎn)工藝進(jìn)行試驗(yàn)研究，采用現(xiàn)代蛋白質(zhì)高端生化分離技術(shù)進(jìn)行生產(chǎn)，使UTI的總收率提高到70%以上，總效價(jià)不低于5000iu/mg，柱效提高約50%，生產(chǎn)工藝穩(wěn)定，質(zhì)量可控。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明提供了一種樹脂再生提高柱效純化烏司他丁的方法及提高烏司他丁復(fù)溶性的藥物組合物，是為了攻克高嶺土吸附、耐酸性混合模式吸附等傳統(tǒng)方法提取烏司他丁收率過低、效價(jià)不高不穩(wěn)定的缺點(diǎn)，采用特異性樹脂處理再生提高柱效法來純化烏司他丁，從而提高了烏司他丁的收率，保證了效價(jià)的穩(wěn)定。
[0006]為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn):
一種樹脂再生提高柱效純化烏司他丁的方法及提高烏司他丁復(fù)溶性的藥物組合物，其特征在于:選用特異性樹脂處理再生法來純化烏司他丁，可以使總收率提高到70%以上，總效價(jià)不低于5000iu/mg，柱效提高約50%。
[0007]該技術(shù)方案中，其技術(shù)特征還在于所述方法包括如下步驟:
1)烏司他丁粗加工
稱取IT pH小于6.5的澄清尿液，不斷攪拌，緩慢加入16.5kg甲殼質(zhì)吸附完全后用氨水洗脫，再經(jīng)過3.5kg硫酸銨鹽析，過夜沉淀、離心后置于用五氧化二磷作吸水劑的真空干燥器中真空干燥，干燥后即得烏司他丁粗品。
[0008]2)吸附柱層析(以0.25L DEAE樹脂柱為例)
2.1)將柱中的DEAE樹脂用純化水反沖下來，裝入桶中，用純化水浸沒攪勻，靜置，反復(fù)多次，純化水浸沒過夜；
2.2)將DEAE樹脂濾干，用少量純化水洗滌，再次濾干后裝入桶中，用0.5 mol/L鹽酸浸沒，攪拌，過濾，用純化水洗至中性，再用0.5 mol/L NaOH溶液浸泡，攪拌，過濾，再用純化水洗至中性；
2.3)將上述經(jīng)處理過的DEAE樹脂加洗脫液A反復(fù)平衡到pH6.5后，再用洗脫液A浸泡待用；
2.4)將上述平衡好的樹脂裝入柱內(nèi)，柱裝好后，再用洗脫液A走柱；
2.5)稱取烏司他丁粗品1kg，用洗脫液A溶解，攪拌30分鐘，離心20分鐘，留取離心液，在60 °C水浴攪拌加熱10小時(shí)；
2.6)將上述離心液流經(jīng)平衡好的DEAE樹脂柱，流速控制在120~130mL/min左右；
2.7)用洗脫液B溶液洗脫，流速控制在120~130mL/min，得洗脫液；
2.8)將洗脫液經(jīng)超濾膜，超濾至其體積的二十分之一，得超濾液約1.65L。
[0009]3)親和層析(以0.25L柱體為例)
3.1)用洗脫液C平衡親和層析柱，將超濾液流經(jīng)平衡過的樹脂柱，流速控制在120~130mL/min ；
3.2)上樣結(jié)束后，用洗脫液C洗脫，流速120~130mL/min左右，收集洗脫液；
3.3)柱中的親和樹脂經(jīng)洗脫液C洗脫后，用洗脫液D洗滌去除吸附在上面的雜質(zhì)，流速控制在120~130mL/min，密封待用；
3.4)洗脫液經(jīng)超濾膜超濾至一定體積，超濾液中加入一定量磷酸氫二鈉溶液，繼續(xù)超濾至同一體積，然后再加入等量磷酸氫二鈉溶液，再經(jīng)超濾膜超濾至相同體積。
[0010]4)沉淀
超濾液中按1:6的比例加入不低95%的乙醇沉淀12小時(shí)，離心，固體再用無水乙醇脫水兩次，離心，棄去上清液，留取沉淀物。
[0011]5)凍干
將沉淀物裝入盤進(jìn)凍干機(jī)，凍干即得烏司他丁。
[0012]經(jīng)核算，所得烏司他丁總收率高達(dá)70%以上，按中國藥典所示方法測(cè)定，總效價(jià)高達(dá)5000iu/mg以上，柱效提高約50%。
[0013]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和積極效果是:
選用樹脂再生提高柱效法純化烏司他丁，可以更有效的去除烏司他丁中的多種雜蛋白，并且使其理化性質(zhì)和生物活性保持穩(wěn)定，從而使產(chǎn)品的各項(xiàng)指標(biāo)均符合中國藥典標(biāo)準(zhǔn)。更重要的是，通過工藝的不斷改進(jìn)和完善，使得烏司他丁總收率達(dá)到70%以上，總效價(jià)不低于5000iu/mg，柱效提高約50%，節(jié)約了成本，創(chuàng)造了巨大的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。
【具體實(shí)施方式】
[0014]下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明，而不以任何方式限制。
[0015]實(shí)施例1
1)烏司他丁粗加工稱取IT pH小于6.5的澄清尿液，不斷攪拌，緩慢加入16.5kg甲殼質(zhì)吸附完全后用氨水洗脫，再經(jīng)過3.5kg硫酸銨鹽析，過夜沉淀、離心后置于用五氧化二磷作吸水劑的真空干燥器中真空干燥，干燥后即得烏司他丁粗品。
[0016]2)吸附柱層析(以0.25L DEAE樹脂柱為例)
2.1)將柱中的DEAE樹脂用純化水反沖下來，裝入桶中，用純化水浸沒攪勻，靜置1小時(shí)，傾去上清液及細(xì)小顆粒，反復(fù)三次，純化水浸沒過夜；
2.2)將DEAE樹脂濾干，用少量純化水洗滌，再次濾干后裝入桶中，用0.5 mol/L鹽酸浸沒，攪拌1小時(shí)，過濾，用純化水洗至中性，再用0.5 mol/L NaOH溶液浸泡，攪拌1小時(shí)，過濾，再用純化水洗至中性；
2.3)將上述經(jīng)處理過的DEAE樹脂加洗脫液A反復(fù)平衡到pH6.5后，再用洗脫液A浸泡待用；
2.4)將上述平衡好的樹脂裝入柱內(nèi)，柱裝好后，再用洗脫液A走柱；
2.5)稱取烏司他丁粗品1kg，用洗脫液A溶解，攪拌30分鐘，離心20分鐘，留取離心液，在60 °C水浴攪拌加熱10小時(shí)；
2.6)將上述離心液流經(jīng)平衡好的DEAE樹脂柱，流速控制在120~130mL/min左右；
2.7)用33L的洗脫液B溶液洗脫，流速控制在120mL/min，得洗脫液；
2.8)將洗脫液經(jīng)超濾膜，超濾至其體積的二十分之一，得超濾液約1.65L。
[0017]3)親和層析(以0.25L柱體為例)
3.1)用3.0L的洗脫液C平衡親和層析柱，將超濾液流經(jīng)平衡過的樹脂柱，流速控制在120mL/min ；
3.2)上樣結(jié)束后，用10L的洗脫液C洗脫，流速120mL/min左右，收集洗脫液；
3.3)柱中的親和樹脂經(jīng)洗脫液C洗脫后，用5.0L的洗脫液D洗滌去除吸附在上面的雜質(zhì)，流速控制在120mL/min，密封待用；
3.4)洗脫液經(jīng)超濾膜超濾至170mL，超濾液中加入磷酸氫二鈉溶液830mL，繼續(xù)超濾至170mL，然后再加入830mL磷酸氫二鈉溶液，再經(jīng)超濾膜超濾