一種應(yīng)用免疫親和柱純化人血清前白蛋白多克隆抗體的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)，具體涉及一種生物分離、純化裝置，尤其涉及一種高效應(yīng)用 免疫親和柱純化人血清前白蛋白多克隆抗體的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 前白蛋白（Prea化umin,PA)是肝臟細胞合成的一種血清蛋白質(zhì)，由4個相同的亞 基組成，分子量約55邸，消光系數(shù)（E280皿)13. 6,半衰期1. 9天，電泳時遷移在白蛋白之前， 故稱為前白蛋白。血清中前白蛋白的測定結(jié)果在臨床上是反映肝功能和機體營養(yǎng)狀態(tài)的重 要指標之一，常見于營養(yǎng)不良者。由于前白蛋白半衰期很短，可W顯示肝臟合成和分解代謝 的輕微改變，其血清濃度降低的幅度與肝實質(zhì)損害的程度密切相關(guān)，因此在臨床上也常見 于肝功能損傷、肝硬化、外傷及感染患者。臨床上，把檢測前白蛋白含量的變化作為衡量肝 功能損害和營養(yǎng)不良的一種敏感可靠的指標。
[0003] 現(xiàn)有技術(shù)中最常用的檢測方法是免疫透射比濁法，其基本原理是；抗原抗體在特 殊緩沖液中快速形成抗原抗體復(fù)合物，反應(yīng)液出現(xiàn)濁度。當反應(yīng)液中保持抗體過量時，形成 的濁度會隨抗原量增加而增加，與一系列濃度的標準品對照，即可計算出待檢測物的含量。
[0004] 免疫透射比濁法檢測臨床樣本效果的決定因素之一是能夠獲得抗干擾能力強的 前白蛋白抗體純品，即盡量去除抗血清中除有效抗體之外的其他組分W消除偽濁度的影 響，因此分離純化、富集前白蛋白抗體的技術(shù)越來越顯示其重要性。從成份復(fù)雜的抗血清中 富集、純化出目標抗體而又盡可能保持其活性和含量是一項艱巨而繁重的任務(wù)。而親和層 析法是目前最有效的分離純化、富集目標抗體的技術(shù)之一，擬進一步研究。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于克服上述不足之處，研究設(shè)計一種通過該免疫親 和柱從血清中簡便、高效、特異性分離純化前白蛋白多克隆抗體的方法。
[0006] 本發(fā)明提供了一種應(yīng)用免疫親和柱純化人血清前白蛋白多克隆抗體的方法，該方 法包括下列步驟：
[0007] 1)瓊脂糖凝膠Se地arose6B的活化：用漠化氯法活化Se地arose她凝膠，活化 [000引過程如下：
[0009] a)取10mlSe地arose她放在布氏漏斗中抽干，用30ml去離子水分兩次洗涂后抽 干，再加入少量0.1mol/LP服.3的NaHC〇3洗涂，立即轉(zhuǎn)入100ml燒杯中，冰浴下緩慢攬拌；
[0010] b)在通風樞內(nèi)稱取Ig漠化氯，加去離子水10ml溶解，然后分批加入Se地aroseSB 中，邊加邊攬拌，同時測抑值，通過滴加2mol/L化0H，使得抑維持在10.5,待漠化氯溶液 滴加完畢，繼續(xù)攬拌30分鐘，抑保持不變，停止攬拌；
[0011] C)將活化的Se地arose她加入小冰塊，迅速導(dǎo)入布氏漏斗中，W冰水抽洗成抑7， 再迅速W150ml冷的0.Imol/LP服.3的NaHC〇3溶液抽洗備用；
[0012] 2)人血清前白蛋白多克隆抗體免疫親和柱的制備：
[0013] 人血清前白蛋白與瓊脂糖凝膠Se地aroseSB偶聯(lián)得到親和吸附填料，填入玻璃柱 中制得人前白蛋白多克隆抗體免疫親和柱，操作步驟如下：
[0014] d)偶聯(lián)
[001引 W純化制備獲得的PA蛋白純品作為配基，采用GE AKTA?快速蛋白層析儀 purifierlOO系統(tǒng)化Trap? Desalting脫鹽柱置換成親和偶聯(lián)緩沖液體系；P服.3的內(nèi)含有 0. 5M化C1的0.1mol/L Na肥03偶聯(lián)緩沖液；
[0016] 將上述步驟l)c)活化好的Se地arose她置于砂芯漏斗中用偶聯(lián)緩沖液快速抽洗， 然后迅速倒入PA蛋白溶液中進行偶聯(lián)，蛋白檢測儀監(jiān)控偶聯(lián)過程；用10倍體積W上的偶聯(lián) 緩沖液洗去未偶聯(lián)的PA蛋白溶液，得到Se地arose6B-PA蛋白偶聯(lián)復(fù)合物；收集全部洗脫 液，通過測定其蛋白質(zhì)含量計算偶聯(lián)率；
[0017] e)封閉活性基團
[001引將Se地arose她-PA蛋白偶聯(lián)復(fù)合物轉(zhuǎn)入5倍偶聯(lián)復(fù)合物體積的抑8. 0的內(nèi)含有 0. 5M化C1的0.Imol/LH輕甲基氨基甲焼-鹽酸（Tris-HCl)緩沖液中，旋轉(zhuǎn)震蕩化，W封 閉瓊脂糖凝膠中多余的活性基團；
[001引 f)洗涂
[0020] 步驟e)得到的Se地arose6B-PA蛋白偶聯(lián)復(fù)合物依次用10倍偶聯(lián)復(fù)合物體積的 pH4. 0的內(nèi)含有0. 5M化C1的0.1mol/L醋酸-醋酸軸緩沖液和5倍體積的抑8. 0的內(nèi)含 有0. 5M化C1的0.1mol/L Tris-HCl緩沖液中洗涂，此洗涂過程重復(fù)H次；然后用10倍偶 聯(lián)復(fù)合物體積的磯酸鹽緩沖液（PBS)洗涂2次；
[0021] g)裝柱
[0022] 將步驟e)得到的Se地arose她-PA蛋白偶聯(lián)復(fù)合物填充5ml或10ml固相萃取空 柱管中，在負壓下用PBS將凝膠壓緊，制成Se地arose6B-PA蛋白免疫親和柱；
[0023] 用本發(fā)明方法制備的Se地arose6B-PA蛋白偶聯(lián)復(fù)合物如需放置一段時間，應(yīng)使 用含有萬分之二疊氮軸的PBS緩沖液浸泡，2-8 C密封保存。
[0024] 本發(fā)明方法制成的Se地arose6B-PA蛋白免疫親和柱，在使用后通過W下方法再 生：
[002引 Se地arose6B-PA蛋白免疫親和柱用5-10個柱床體積抑8. 5的內(nèi)含有0. 5M化C1 的0.1mol/L Tris-肥1緩沖液和5-10個柱床體積抑4. 0的內(nèi)含有0. 5M NaCl的0.1mol/L 醋酸-醋酸軸緩沖液清洗親和柱2次，再用PBS緩沖液充分平衡后保存2-8C待用。
[0026] 3)純化羊抗人血清前白蛋白多克隆抗體：
[0027] 取免疫后羊抗人血清前白蛋白抗血清200ml，依次用0. 8um、0. 45um微孔濾膜過 濾，濾液過制備的Se地arose6B-PA蛋白親和柱(柱子用含50ml的PBS預(yù)處理)。分別用50ml 含0. 5M化Cl的PBS淋洗雜質(zhì)組分，紫外檢測器檢測吸光度平衡后，用抑4. 0的內(nèi)含有0. 5M 化C1的0.1mol/L Tris-巧樣酸緩沖液洗脫，洗脫液經(jīng)化Trap? Desalting脫鹽柱置換成 PBS緩沖液后，自動生化儀（OLYMPUS AU400)上機，標準品定標測試，觀察定標曲線的線性。
[0028] 本發(fā)明人血清前白蛋白多克隆抗體免疫親和柱的制備方法，所述步驟2) d)偶聯(lián) 過程中使用單蛋白配基偶聯(lián)緩沖液的置換采用的脫鹽柱體系選自化Trap?Desalting或 Hipr巧26/lODesalting 優(yōu)選 HiTrap? Desalting ;
[0029] 所述步驟2) d)偶聯(lián)過程中使用單蛋白配基偶聯(lián)緩沖液的置換脫鹽層析條件為： 層析液；P服.3的內(nèi)含有0. 5M化C1的0.1mol/L NaHC〇3偶聯(lián)緩沖液；上樣量為柱床體積的 10%~50%，優(yōu)選但不限于25% ;流速為1~3毫升/分鐘，優(yōu)選但不限于3毫升/分鐘；洗 脫體積為1~2個柱床體積，優(yōu)選但不限于1. 5個柱床體積。
[0030] 所述步驟2)d)偶聯(lián)過程中配基PA蛋白偶聯(lián)的量為1~lOmg/ml填料，優(yōu)選5mg/ ml填料。
[0031] 所述步驟2) d)偶聯(lián)過程中配基與填料的偶聯(lián)時間為1~化，優(yōu)選但不限于化； [003引偶聯(lián)溫度為20~4(TC，優(yōu)選但不限于25C ;
[0033] 本發(fā)明的人血清前白蛋白多克隆抗體免疫親和柱，通過一次性純化即可去除絕大 部分雜質(zhì)，有效的消除了免疫比濁試劑中的偽濁度問題，可W簡便、高效、特異性地從血清 中分離純化前白蛋白多克隆抗體，有較大的應(yīng)用價值。
【附圖說明】
[0034] 圖IHiTrapTM Desalting脫鹽柱置換配基蛋白為偶聯(lián)緩沖液；
[00巧]收集蛋白A1~A4管；其中實線峰為蛋白峰；虛線峰為離子峰。
[0036] 圖2Se地arose6B-PA蛋白親和柱純化PA多克隆抗體圖譜；
[0037] 峰1 ;未吸附的雜質(zhì)峰；峰2 ;PA多克隆蛋白洗脫峰。
[0038] 圖3自動生化儀標準品定標測試；親和純化前；
[0039] 回歸方程；y=0. 0008X+0. 1166 ;線性相關(guān)系數(shù)；R2=0. 8649
[0040] 圖4自動生化儀標準品定標測試；親和純化后；
[0041] 回歸方程；y=0. 0006X+0. 0052 ;線性相關(guān)系數(shù)；R2=0. 992
【具體實施方式】
[0042] 下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，該些實施例僅用于說明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人 員可W對本發(fā)明作各種改動或修改，該些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定 的范圍。
[0043] W下實施例原料市售得到。
[0044] 實施例1 ;瓊脂糖凝膠Se地arose6B的活化
[0045] 取10ml Se地arose她放在布氏漏斗中抽干，用30ml去離子水分兩次洗涂后抽干， 再加入50ml0.1mol/L P服.3的Na肥化洗涂，立即轉(zhuǎn)入100ml燒杯中，冰浴下緩慢攬拌；在 通風樞內(nèi)稱取Ig漠化氯，加去離子水10ml溶解，然后逐滴加入Se地arose6B中，邊加邊攬 拌，同時測抑值，通過滴加2mol/L化0H，使得抑維持在10. 5,待漠化氯溶液滴加完畢，繼 續(xù)攬拌30分鐘，抑保持不變，停止攬拌；將活化的Se地arose6B加入小冰塊，迅速導(dǎo)入布氏 漏斗中，W冰水抽洗成抑7,再迅速W 150ml冷的0.1mol/L P服.3的NaHC〇3溶液抽洗后備 用；
[0046] 實施例2 ;配基；人血清前白蛋白溶液的置換
[0047] 采用GE AKTA?快速蛋白層析儀purifierlOO系統(tǒng)HiTrap? Desalting脫鹽柱置 換成親和偶聯(lián)緩沖液體系；首先用抑8. 3的內(nèi)含有0. 5M化C1的0.1mol/LNaHC^偶聯(lián)緩沖 液沖洗脫鹽柱5~10個柱床體積，流速3毫升/分鐘；上樣量5ml ;流速為3毫升/分鐘； 洗脫體積為1. 5個柱床體積；部分收集器收集蛋白溶液1ml/管，詳見圖1 ;
[0048] 實施例3 ;人血清前白蛋白多克隆抗體免疫親和柱的