快速純化富集西馬特羅的免疫親和柱及其制備方法和用途
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種快速純化富集西馬特羅的免疫親和柱，由抗西馬特羅免疫親和填料裝載入空柱管所得，所述抗西馬特羅免疫親和填料由固相載體和與其偶聯(lián)的西馬特羅特異性多克隆抗體組成；所述的西馬特羅特異性多克隆抗體是由西馬特羅經(jīng)重氮法重氮化后與載體蛋白偶聯(lián)所得的偶聯(lián)物為免疫原制備抗血清，再用免疫親和法從抗血清中提純得到的。本發(fā)明還公開了該免疫親和柱的制備方法和用途。本發(fā)明的免疫親和柱所用抗體特異性高，使用本發(fā)明的免疫親和柱對(duì)樣品進(jìn)行前處理，再與色譜法、膠體金試紙條聯(lián)合使用，可高效、準(zhǔn)確檢測(cè)西馬特羅的含量。
【專利說明】快速純化富集西馬特羅的免疫親和柱及其制備方法和用途
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于免疫學(xué)分離、純化富集【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種快速純化富集西馬特羅的免疫親和柱及其制備方法和用途。
【背景技術(shù)】
[0002]西馬特羅(CM)屬于苯乙胺類藥物的一種，屬于β_興奮劑，在醫(yī)學(xué)和獸醫(yī)臨床上主要用于擴(kuò)張氣管和增加肺通氣量，可以用于哮喘、阻塞性肺炎、平滑肌痙攣和休克等癥。研究顯示，CM可以提高瘦肉率、促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)。因其經(jīng)濟(jì)效益明顯，利益驅(qū)使養(yǎng)殖戶或養(yǎng)殖企業(yè)大量使用，導(dǎo)致畜產(chǎn)品中西馬特羅大量殘留，人食用這類畜產(chǎn)品后，可引發(fā)肌肉震顫、心悸、神經(jīng)過敏、頭痛、目眩、惡心等中毒癥狀，特別是對(duì)血壓、心臟病患者危害更大，長(zhǎng)期使用可能導(dǎo)致染色體畸變，誘發(fā)惡性腫瘤。西馬特羅在許多國(guó)家，特別是歐盟和中國(guó)，被禁止用做家畜促生長(zhǎng)劑。所以，對(duì)動(dòng)物來源的食品中西馬特羅殘留進(jìn)行嚴(yán)格地檢測(cè)是非常重要。
[0003]由于生物樣本成分復(fù)雜，待測(cè)物濃度低，大多數(shù)取樣量少，而我國(guó)明確規(guī)定禁止西馬特羅及其衍生物在動(dòng)物的飼養(yǎng)過程中使用，這就對(duì)分析方法的靈敏度、準(zhǔn)確度有更高的要求。目前檢測(cè)西馬特羅的方法主要有高效液相色譜(HPLC-UV)、液相串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)、氣-質(zhì)聯(lián)機(jī)法(GC-MS)，這些方法的樣品前處理都在不同程度上存在過程繁瑣、費(fèi)時(shí)長(zhǎng)、有機(jī)溶劑浪費(fèi)多等缺點(diǎn)。
[0004]免疫親和色譜是一種將免疫反應(yīng)和色譜分析方法相結(jié)合的分析方法。采用高特異性抗體偶聯(lián)于瓊脂糖上制成的抗體免疫親和填料，再裝載成親和柱。樣品流過該親和柱可以快速特異性純化富集樣品中的抗原待檢物，樣品經(jīng)過這樣的前處理，可以消除基體干擾，提高檢測(cè)方法的準(zhǔn)確度、精密度、選擇性和靈敏度，經(jīng)處理后的樣品再經(jīng)高效液相色譜法(HPLC-UV)、液相串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS )、氣-質(zhì)聯(lián)機(jī)法(GC-MS )、膠體金法檢測(cè)，達(dá)到快速、靈敏、準(zhǔn)確檢測(cè)樣品的目的。目前用免疫親和色譜技術(shù)檢測(cè)西馬特羅未見報(bào)道，因此，急需開發(fā)一種西馬特羅的免疫親和色譜檢測(cè)檢測(cè)技術(shù)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]針對(duì)上述技術(shù)問題，本發(fā)明公開了一種快速純化富集西馬特羅的免疫親和柱，本發(fā)明還公開了該免疫親和柱的制備方法和用途。
[0006]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是:
[0007]—種快速純化富集西馬特羅的免疫親和柱，由抗西馬特羅免疫親和填料裝載入空柱管所得，所述抗西馬特羅免疫親和填料由固相載體和與其偶聯(lián)的經(jīng)免疫親和純化的西馬特羅特異性多克隆抗體組成；所述的經(jīng)免疫親和純化的西馬特羅特異性多克隆抗體是由西馬特羅經(jīng)重氮法重氮化后與載體蛋白偶聯(lián)所得的偶聯(lián)物為免疫原制備抗血清，再用免疫親和法從抗血清中提純得到的。
[0008]其中，所述固相載體為瓊脂糖珠，優(yōu)選地，所述瓊脂糖珠為經(jīng)過過碘酸鈉氧化的瓊脂糖珠。[0009]其中，所述載體蛋白為牛血清白蛋白或血藍(lán)蛋白；優(yōu)選地，所述載體蛋白為牛血清白蛋白。
[0010]制備上述快速純化富集西馬特羅的免疫親和柱的方法，包括以下步驟:
[0011](I)將西馬特羅采用重氮法重氮化后偶聯(lián)于載體蛋白上，制得免疫原，將免疫原免疫動(dòng)物產(chǎn)生抗血清；
[0012](2)將西馬特羅偶聯(lián)到固相載體上制得西馬特羅免疫親和柱，用于從抗血清中純化提取西馬特羅特異性多克隆抗體；
[0013](3)將經(jīng)免疫親和純化的西馬特羅特異性多克隆抗體與固相載體偶聯(lián)，制得抗西馬特羅免疫親和填料，將抗西馬特羅免疫親和填料裝載入空柱管，即得快速純化富集西馬特羅的免疫親和柱。
[0014]其中，步驟(2)中所述的固相載體為瓊脂糖瓊脂糖珠，所述西馬特羅免疫親和柱的制備方法為:將被過碘酸鈉氧化后的瓊脂糖珠懸浮于碳酸鈉溶液中，再將西馬特羅溶解后快速與氧化后的瓊脂糖珠混勻，室溫反應(yīng)過夜后，加入硼氫化鈉穩(wěn)定過夜，即得西馬特羅偶聯(lián)到瓊脂糖珠上的填料，將填料裝柱，洗去雜質(zhì)，得到西馬特羅免疫親和柱。
[0015]其中，步驟(3)中所述的固相載體為瓊脂糖珠，所述快速純化富集西馬特羅的免疫親和柱的制備方法為:將經(jīng)免疫親和純化的西馬特羅特異性多克隆抗體和被過碘酸氧化的瓊脂糖珠混勻，在室溫反應(yīng)30分鐘，然后加入硼氫化鈉在4°C靜置30分鐘后，得到西馬特羅特異性多克隆抗體與瓊脂糖珠偶聯(lián)的填料，用蒸餾水清洗未結(jié)合的抗體，用磷酸緩沖液清洗填料，清洗4次，每次使用10倍填料體積的磷酸緩沖液，滴干磷酸緩沖液后加入等體積甘油，混勻，得到抗西馬特羅免疫親和填料，將抗西馬特羅免疫親和填料裝載入空柱管，每即得快速純化富集西馬特羅的免疫親和柱。
[0016]通過以上技術(shù)方案，本發(fā)明的有益效果如下:
[0017](I)本發(fā)明所用西馬特羅特異性多克隆抗體為經(jīng)過免疫親和一步法提純的，抗體特異性高；采用高密度、大容量將特異性抗體偶聯(lián)于活化的瓊脂糖填料，使得特異性抗體和填料結(jié)合穩(wěn)定，柱容量、回收率明顯優(yōu)于當(dāng)前同類產(chǎn)品，達(dá)到排除雜質(zhì)干擾、提高檢測(cè)準(zhǔn)確性和可靠性；
[0018](2)本親和純化富集柱裝載填料的微型化，填料裝柱體積僅需25 μ L/柱，能使洗脫體積縮小，非常明顯地提高檢測(cè)的靈敏度；
[0019](3)在使用本發(fā)明的免疫親和柱檢測(cè)西馬特羅時(shí)，檢測(cè)過程步驟簡(jiǎn)單，且檢測(cè)準(zhǔn)確性高。
【具體實(shí)施方式】
[0020]以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。在不背離本發(fā)明精神和本質(zhì)的情況下，對(duì)本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。
[0021]實(shí)施例中使用的瓊脂糖珠購(gòu)自Sigma-Aldrich，型號(hào)為:含氨基瓊脂糖(G Bios,786-066);其余試劑和儀器均可從市場(chǎng)上購(gòu)買得到。
[0022]實(shí)施例快速純化富集西馬特羅的免疫親和柱的制備
[0023]1.將西馬特羅采用重氮法重氮化后偶聯(lián)于載體蛋白上，制得免疫原，將免疫原免疫動(dòng)物產(chǎn)生抗血清；具體步驟如下:[0024](I)西馬特羅免疫原的制備
[0025]①稱取IOmg西馬特羅標(biāo)準(zhǔn)品，溶于IOOuL四氫呋喃中，加入900 μ Llmol/LHCl，冷凍5分鐘；加入50mg固體亞硝酸鈉，冷凍2分鐘后再搖勻，4°C繼續(xù)反應(yīng)30分鐘，得到重氮化后的西馬特羅；
[0026]②稱取IOOmg牛血清白蛋白，溶于5mL0.1mo I/LNa2CO3中，冷凍2分鐘后再加入
0.5mL 飽和 Na2CO3 ；
[0027]③將步驟①得到的西馬特羅加到步驟②的牛血清蛋白溶液中室溫?fù)u床反應(yīng)過夜；經(jīng)SephadeXG25脫鹽得到西馬特羅免疫原，分裝保存待用；
[0028](2)西馬特羅多克隆抗血清制備
[0029]用新西蘭大白兔為免疫動(dòng)物，西馬特羅免疫原濃度為lmg/mL，首次免疫用0.5mL,西馬特羅免疫原加0.5mL磷酸緩沖液加ImL完全佐劑混勻多點(diǎn)注射，加強(qiáng)免疫用0.25mL疫苗加0.75mL磷酸緩沖液加ImL不完全佐劑混勻分2點(diǎn)注射，首次免疫后，每間隔2周加強(qiáng)免疫一次，35?40天采集0.5mL血清檢測(cè)滴度，用配對(duì)檢測(cè)抗原包被做血清的間接ELISA檢測(cè)，血清滴度達(dá)到1:6400后進(jìn)行大量血清制備。
[0030]2.將西馬特羅偶聯(lián)到固相載體上制得西馬特羅免疫親和柱，用于從抗血清中純化提取西馬特羅特異性多克隆抗體；
[0031](I)西馬特羅免疫親和填料和西馬特羅免疫親和柱的制備:
[0032]將IOOmg西馬特羅溶于IOmL四氫呋喃，和50mL被過碘酸鈉氧化的瓊脂糖珠混合，加入2ml飽和碳酸鈉溶液反應(yīng),再加入IOOmg蹦氫化鈉穩(wěn)定過夜,清洗后置4°C冰箱,用前將填料裝柱，洗去雜質(zhì)，得到西馬特羅免疫親和柱。
[0033](2)西馬特羅特異性多克隆抗體制備:
[0034]將150mL的抗血清流過步驟(I)所制的親和柱。依次用10倍填料體積的PBSt(含
0.05%吐溫20的磷酸緩沖液)、10倍填料體積的lmol/L氯化鈉清洗掉雜質(zhì)后，柱上的特異性抗西馬特羅抗體用2%乙酸洗脫。洗脫的抗體用透析袋透析或SephadeXG25脫鹽去掉乙酸，得到西馬特羅特異性抗體，凍干備用。
[0035]3.將經(jīng)免疫親和純化的西馬特羅特異性多克隆抗體與固相載體偶聯(lián)，制得抗西馬特羅免疫親和填料，將抗西馬特羅免疫親和填料裝載入空柱管，即得快速純化富集西馬特羅的免疫親和柱，具體步驟如下:
[0036](I)取經(jīng)過碘酸鈉活化的瓊脂糖珠12mL轉(zhuǎn)入空柱子中，用400mL蒸餾水洗，滴干，再過瓊脂糖珠2倍體積的0.1moVLNa2CO3，滴干備用；
[0037](2)將1200mg經(jīng)免疫親和純化的西馬特羅特異性多克隆抗體用0.lmol/LNa2C03溶解使?jié)舛冗_(dá)20mg/mL，完全溶解后離心取上清；
[0038](3)將步驟(2)所得的上清加入步驟(I)的柱中，收集流出液再次過柱，反復(fù)3?5次；用80mL蒸餾水把未結(jié)合的抗體洗出來，收集在一起；
[0039](4)用蒸餾水配制濃度為10mg/mL的硼氫化鈉溶液4.8mL，加入柱子中，振蕩混勻，4V反應(yīng)30分鐘；
[0040](5)用10倍填料體積的磷酸緩沖液洗填料，滴干磷酸緩沖液，將填料移入干凈的試管中，加入與填料體積相等的甘油，即得西抗馬特羅免疫親和填料。
[0041](6)在空柱管內(nèi)下端裝上過濾膜，將抗馬特羅免疫親和填料裝載入柱中，25μ I/柱，然后填料上層蓋上過濾膜，即得快速純化富集西馬特羅的免疫親和柱，該免疫親和純化富集柱保存條件為:-20°C。
[0042]在使用該快速純化富集西馬特羅的免疫親和柱檢測(cè)西馬特羅時(shí)，可將待測(cè)樣品過柱、洗脫，純化富集樣品中的抗原待檢物，再用膠體金法檢測(cè)富集樣品，可大大提高檢測(cè)的準(zhǔn)確度，并且整個(gè)檢測(cè)過程步驟簡(jiǎn)單，易于在實(shí)驗(yàn)條件簡(jiǎn)單的地區(qū)廣泛推廣應(yīng)用。
【權(quán)利要求】
1.一種快速純化富集西馬特羅的免疫親和柱，由抗西馬特羅免疫親和填料裝載入空柱管所得，其特征在于:所述抗西馬特羅免疫親和填料由固相載體和與其偶聯(lián)的西馬特羅特異性多克隆抗體組成；所述的西馬特羅特異性多克隆抗體是由西馬特羅經(jīng)重氮法重氮化后與載體蛋白偶聯(lián)所得的偶聯(lián)物為免疫原制備抗血清，再用免疫親和法從抗血清中提純得到的。
2.按照權(quán)利要求1所述的免疫親和柱，其特征在于:所述固相載體為瓊脂糖珠。
3.按照權(quán)利要求2所述的免疫親和柱，其特征在于:所述瓊脂糖珠為經(jīng)過過碘酸鈉氧化的瓊脂糖珠。
4.按照權(quán)利要求1所述的免疫親和柱，其特征在于:所述載體蛋白為牛血清白蛋白或血藍(lán)蛋白。
5.按照權(quán)利要求1所述的免疫親和柱，其特征在于:所述載體蛋白為牛血清白蛋白。
6.制備權(quán)利要求1?5任一項(xiàng)所述的快速純化富集西馬特羅的免疫親和柱的方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)將西馬特羅采用重氮法重氮化后偶聯(lián)于載體蛋白上，制得免疫原，將免疫原免疫動(dòng)物產(chǎn)生抗血清； (2)將西馬特羅偶聯(lián)到固相載體上制得西馬特羅免疫親和柱，用于從抗血清中純化提取西馬特羅特異性多克隆抗體； (3)將經(jīng)免疫親和純化的西馬特羅特異性多克隆抗體與固相載體偶聯(lián)，制得抗西馬特羅免疫親和填料，將抗西馬特羅免疫親和填料裝載入空柱管，即得快速純化富集西馬特羅的免疫親和柱。
7.按照權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，步驟(2)中所述的固相載體為瓊脂糖珠，所述西馬特羅免疫親和柱的制備方法為:將被過碘酸鈉氧化后的瓊脂糖珠懸浮于碳酸鈉溶液中，再將西馬特羅溶解后快速與氧化后的瓊脂糖珠混勻，室溫反應(yīng)過夜后，再加入硼氫化鈉穩(wěn)定過夜，即得西馬特羅偶聯(lián)到瓊脂糖珠上的填料，將填料裝柱，洗去雜質(zhì)，得到西馬特羅免疫親和柱。
8.按照權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，步驟(3)中所述的固相載體為瓊脂糖珠，所述快速純化富集西馬特羅的免疫親和柱的制備方法為:將西馬特羅特異性多克隆抗體溶解后和被過碘酸氧化的瓊脂糖珠混勻，在室溫反應(yīng)30分鐘，然后加入硼氫化鈉混勻，在4°C靜置30分鐘，得到西馬特羅特異性多克隆抗體與瓊脂糖珠偶聯(lián)的填料，用蒸餾水清洗未結(jié)合的抗體，用磷酸緩沖液清洗填料，清洗4次，每次使用10倍填料體積的磷酸緩沖液，滴干磷酸緩沖液后加入等體積甘油，混勻，得到抗西馬特羅免疫親和填料，將抗西馬特羅免疫親和填料裝載入空柱管，每即得快速純化富集西馬特羅的免疫親和柱。
9.權(quán)利要求1?5任一項(xiàng)所述的快速純化富集西馬特羅的免疫親和柱的用途，用于從生物樣本中純化富集西馬特羅。
【文檔編號(hào)】B01J20/30GK103706331SQ201310731559
【公開日】2014年4月9日 申請(qǐng)日期:2013年12月26日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月26日
【發(fā)明者】謝體三, 潘麗金, 寧歡歡, 劉曉松, 呂春秋, 張?zhí)m, 葉開富, 蕭潔 申請(qǐng)人:南寧市藍(lán)光生物技術(shù)有限公司, 廣西出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心, 廣西壯族自治區(qū)分析測(cè)試研究中心