一種羅氏沼蝦野田病毒衣殼蛋白卵黃抗體及其應(yīng)用
【專利說明】-種羅氏沼郵野田病毒衣亮蛋白卵黃抗體及其應(yīng)用 發(fā)明領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種羅氏沼郵野田病毒衣殼蛋白卵黃抗體及 其應(yīng)用。 技術(shù)背景
[0002] 羅氏沼郵原產(chǎn)于印度太平洋地區(qū)，生活在各種類型的淡水或咸淡水水域。1976年 自我國首次引進該品種，目前主要在南方10多個?。ㄊ小^(qū)）推廣養(yǎng)殖。其生長速度快， 食譜廣，營養(yǎng)豐富，是一種重要經(jīng)濟郵類；至2000年，我國羅氏沼郵苗種產(chǎn)量己達近200億 尾，產(chǎn)值20多億元。由于養(yǎng)殖密度不斷提高、養(yǎng)殖水體污染日益嚴重及養(yǎng)殖品種種質(zhì)退化， 羅氏沼郵在育苗和養(yǎng)殖過程中疾病日益流行。90年代后期，羅氏沼郵肌肉壞死病相繼在我 國南方各省暴發(fā)，并于20001年大面積流行。該病毒的感染對象為羅氏沼郵幼苗，主要發(fā)病 時期為郵苗淡化后1-2周內(nèi)，死亡率高達60 %W上，嚴重時可達100%。造成嚴重的經(jīng)濟 損失，至今仍沒有可W有效控制此病的方法。研究表明，該病病原為野田村病毒，命名為羅 氏沼郵野田病毒（Macrobranchiumrosenbergiinodavirus，MrNV)。病毒粒子呈廿面體， 無囊膜，直徑為23-25nm，病毒核酸為單鏈RNA，由2個片段組成，分別為RNA1 (3. 20化）和 RNA2 (1. 2化）。其中RNA2編碼衣殼蛋白，是病毒感染與致病力的重要蛋白，也是重要抗原。 由于郵類無法自行產(chǎn)生抗體，因此普通的疫苗無法有效防治該疾病。卵黃抗體具有穩(wěn)定性 和高效性的特點，是防治此類疾病的重要手段。
[000引 目前關(guān)于羅氏沼郵野田病毒的相關(guān)的專利，主要有下列報道；羅氏沼郵肌肉白濁 病病毒酶聯(lián)免疫診斷試劑盒及其檢測方法（申請公布號；CN1603830 ;申請?zhí)枺?31434282 申請公布號；CN1603830);羅氏沼郵野田村病毒檢測試劑盒及檢測方法（申請公布號： CN103122393A;申請?zhí)枺?012105024179);羅氏沼郵諾達病毒核酸點雜交檢測的方法（申請 公布號；CN1438330 ;申請?zhí)枺?31187331);羅氏沼郵病毒復(fù)合反轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)檢測的 方法（申請公布號；CN1451764 ;申請?zhí)枺?31190898)。W上專利都是關(guān)于病毒的檢測，沒有 設(shè)及卵黃抗體的制備。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供一種羅氏沼郵野田病毒衣殼蛋白卵黃抗體及其應(yīng)用。
[0005] 為解決W上技術(shù)問題，本發(fā)明采用W下技術(shù)方案：
[0006] 一種羅氏沼郵野田病毒衣殼蛋白卵黃抗體，由下述方法制備得到：
[0007] (1)通過RT-PCR方法克隆羅氏沼郵野田病毒衣殼蛋白基因的DNA，然后重組到谷 脫甘膚S-轉(zhuǎn)移酶佑ST)融合基因表達載體pGEX-5x-l中，構(gòu)建成pGEX-5x-l-MrNV-CP重組 質(zhì)粒，所述pGEX-5x-l-MrNV-CP重組質(zhì)粒中含有谷脫甘膚S-轉(zhuǎn)移酶和羅氏沼郵野田病毒衣 殼蛋白的融合基因；
[000引 （2)重組質(zhì)粒pGEX-5x-l-MrNV-CP在大腸桿菌中的表達：將pGEX-5x-l-MrNV-CP重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌，次日挑選轉(zhuǎn)化平板上的大腸桿菌單菌落于含有卡那霉素的培養(yǎng)基 中擴大培養(yǎng)，利用IPTG誘導(dǎo)谷脫甘膚S-轉(zhuǎn)移酶和羅氏沼郵野田病毒衣殼蛋白的融合基因 在大腸桿菌中表達；收集菌體，采用包涵體提純技術(shù)提取并純化得到GST-MrNV-CP重組蛋 白；
[0009] (3)用GST-MrNV-CP重組蛋白免疫產(chǎn)蛋母雞，收集免疫母雞所產(chǎn)雞蛋，從所收集的 雞蛋中提取并純化卵黃抗體。
[0010] 按上述方案，所述GST-MrNV-CP重組蛋白的分子量為66kDa~68kDa。
[0011] 按上述方案，所述RT-PCR方法為；W羅氏沼郵野田病毒為模板，采用特異性引物 將羅氏沼郵野田病毒衣殼蛋白基因反轉(zhuǎn)錄成第一鏈cDNA，再PCR擴增得到雙鏈cDNA。
[0012] 按上述方案，所述pGEX-5x-1-MrNV-CP重組質(zhì)粒的構(gòu)建方法為：將cDNA和 PGEX-5X-1載體分別進行雙酶切，再進行連接反應(yīng)得到含有谷脫甘膚S-轉(zhuǎn)移酶和羅氏沼郵 野田病毒衣殼蛋白的融合基因的pGEX-5x-1-MrNV-CP重組質(zhì)粒。
[001引按上述方案，所述重組質(zhì)粒pGEX-5x-l-MrNV-CP在大腸桿菌中的表達為；pGEX-5x-l-MrNV-CP重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌，次日挑選轉(zhuǎn)化平板上的單菌落于含有卡那霉 素的LB液體培養(yǎng)基中，于37°C、200轉(zhuǎn)/分鐘進行恒溫搖床培養(yǎng)，當大腸桿菌的OD值達到 0. 4-0. 6時，加入終濃度為Immol/L的IPTG，在25-37°C誘導(dǎo)4-8小時。
[0014] 按上述方案，所述免疫為兩翅及兩側(cè)胸肌注射。
[0015] 按上述方案，所述免疫的次數(shù)為3次，每次免疫的時間間隔為2周。
[0016] 按上述方案，所述免疫方式為；首次免疫注射由GST-MrNV-CP重組蛋白與等體積 完全弗氏佐劑乳化成的疫苗，第二次及第S次免疫注射由GST-MrNV-CP重組蛋白與不完全 弗氏佐劑乳化成的疫苗。
[0017] 按上述方案，步驟（3)所述從雞蛋中提取并純化卵黃抗體的方法為；將所收集雞 蛋的蛋清和蛋黃分離，取蛋黃，去掉卵黃膜，然后加入滅菌蒸饋水，充分搖勻、置于4°C條件 下過夜后，收集上清即為卵黃抗體。
[001引上述羅氏沼郵野田病毒卵黃抗體在制備郵用抗羅氏沼郵野田病毒疫苗制品中的 應(yīng)用。
[0019] 本發(fā)明的有益效果；本發(fā)明方法制備得到的卵黃抗體表達量持續(xù)穩(wěn)定，經(jīng)羅氏沼 郵苗免疫保護試驗證實，所制備的卵黃抗體能夠有效抑制羅氏沼郵野田病毒，效價高，具有 良好的免疫保護效力，可W在郵類的郵苗期，將其作為羅氏沼郵野田病毒疫苗添加到羅氏 沼郵飼料中，為羅氏沼郵野田病毒疫苗的商品化推廣提供了可能性，具有廣闊的應(yīng)用前景。
【具體實施方式】
[0020] 為了更好地理解本發(fā)明，下面結(jié)合實施例進一步闡明本發(fā)明的內(nèi)容，但本發(fā)明的 內(nèi)容不僅僅局限于下面的實施例。
[002U 實施例1 ;羅氏沼郵野田病毒衣殼蛋白基因pGEX-5x-1-MrNV-CP重組質(zhì)粒的構(gòu)建
[0022] W羅氏沼郵野田病毒感染的沼郵肌肉提取的總RNA為模板，采用下游引物 MrNV-Notl-BW ;5' -ATAGCGGCCGCCTAATTATTGCCGACGATAG-3'，將羅氏沼郵野田病毒衣殼蛋白 基因進行RT-PCR反應(yīng)生成第一鏈cDNA，RT-PCR反應(yīng)的試劑為：反轉(zhuǎn)錄酶、dNTP、緩沖液；條 件為；75°C，5min;42°C，1小時；80°C，lOmin。隨后，將獲得的cDNA作為模板，使用上游引 物 MrNV-SalI-FW:5' -CATGTCGACATGGCTAGAGGT AAACAA AA-3' 和下游引物 MrNV-Notl-BW; 5' -TAGCGGCCGCCTAATTATTGCCGACGATAG-3'，PCR擴增得到雙鏈DM。PCR反應(yīng)的試劑為：高 保真DM聚合酶、dNTP、緩沖液；PCR擴增反應(yīng)條件為；預(yù)變性95°C5min;隨后95°C，40s; 6rC，40s;72°C，lmin;共35個循環(huán)，隨后在72°C延伸5min，4°C保存。將反應(yīng)產(chǎn)物在1% 的瓊脂糖上電泳分離，提純目的DNA片段。隨后將提純的DNA片段和PGEX-5X-1載體分別 用Sail和Notl雙酶切，用T4DNA連接酶將酶切的DNA片段連接到酶切的pGEX-5x-l載體 上，獲得到含有GST和羅氏沼郵野田病毒衣殼蛋白融合基因的pGEX-5x-l-化NV-CP重組 質(zhì)粒。所述連接反應(yīng)體系為；DNA2y1，pGEX-5x-16y1，10X連接緩沖液2y1，T4DNA連接 酶lyl，16°C30 分鐘。
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