一種鴨坦布蘇病毒精制卵黃抗體的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物制藥領(lǐng)域，具體涉及一種鴨坦布蘇病毒精制卵黃抗體的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002 ] 2010年以來，國內(nèi)部分地區(qū)鴨流行一種以臨床癥狀為腳麻痹、采食量下降、拉黃綠色稀便、產(chǎn)蛋驟降和神經(jīng)癥狀，剖檢癥狀為心肌壞死、肝臟萎縮、脾臟腫大出血、腸道輕微出血和出血性卵巢炎等為特征的疾病，病原鑒定為鴨坦布蘇病毒(臨床通稱為黃病毒)，屬于黃病毒科黃病毒屬蚊媒病毒類恩塔亞病毒群，是單股正鏈RNA病毒。該病毒對(duì)各種品系的鴨均致病，雛鴨最早發(fā)病日齡為7日齡、20?40日齡及產(chǎn)蛋期高發(fā)，該病用常規(guī)抗病毒及抗菌治療療效不佳，死淘率5?15%，繼發(fā)細(xì)菌感染時(shí)死淘率更高，恢復(fù)采食量需15天以上，商品鴨、產(chǎn)蛋鴨愈后發(fā)育不良及產(chǎn)蛋率恢復(fù)差，該病目前無疫苗用于預(yù)防，對(duì)鴨養(yǎng)殖業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]針對(duì)以上現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種安全性好，治療鴨坦布蘇病毒病效果顯著的鴨坦布蘇病毒精制卵黃抗體的制備方法。
[0004]本發(fā)明還提供了所述鴨坦布蘇病毒精制卵黃抗體在治療鴨坦布蘇病毒病方面的應(yīng)用。
[0005]實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的技術(shù)方案為:一種鴨坦布蘇病毒精制卵黃抗體的制備方法，包括如下步驟:
[0006](I)抗原制備:鴨坦布蘇病毒用生理鹽水10000倍稀釋，經(jīng)尿囊腔接種11日齡易感鴨胚，收集接種48?120小時(shí)死亡鴨胚尿囊液，無菌檢驗(yàn)合格，即為抗原；
[0007](2)鴨坦布蘇病毒轉(zhuǎn)移因子-白細(xì)胞介素2佐劑滅活疫苗的制備:抗原加終濃度為
0.1%甲醛，37°C滅活24小時(shí)，期間振搖;于4°C離心30分鐘;收集上清液，將所述上清液濃縮15倍，然后將濃縮液轉(zhuǎn)入滅菌容器，于4°C保存;往濃縮抗原中加入轉(zhuǎn)移因子和鴨白細(xì)胞介素2，使轉(zhuǎn)移因子(按多肽計(jì)算)終濃度為2mg/ml，鴨白細(xì)胞介素2終濃度為4yg/ml，即為鴨坦布蘇病毒轉(zhuǎn)移因子-白細(xì)胞介素2佐劑滅活疫苗；
[0008](3)高免雞蛋的生產(chǎn):選擇健康的產(chǎn)蛋雞，用步驟(2)中所述鴨坦布蘇病毒轉(zhuǎn)移因子-白細(xì)胞介素2佐劑滅活疫苗對(duì)雞群進(jìn)行產(chǎn)蛋前免疫，當(dāng)鴨坦布蘇病毒卵黃中和抗體效價(jià)應(yīng)2 1:640為合格，然后收集高免雞蛋；
[0009 ] (4)消毒:將所述高免雞蛋浸入40 °C,0.1%新潔爾滅水溶液中消毒15?20分鐘，然后再將所述高免雞蛋用福爾馬林密閉熏蒸消毒30分鐘；
[0010](5)分離卵黃:除去蛋清、胚盤和系帶、收集卵黃；
[0011 ] (6)抗體萃取:攪拌使卵黃呈均勻膏狀，裝入攪拌罐中，按體積比1:1加入25°C的滅菌注射用水，調(diào)節(jié)pH至4.3;于轉(zhuǎn)速為200轉(zhuǎn)/分鐘，攪拌30分鐘；
[0012]將卵黃液轉(zhuǎn)入不銹鋼桶中，加入終濃度為4%正辛酸，攪拌30分鐘，室溫放置12?24小時(shí)；用40目濾網(wǎng)撇去漂浮在上層的蛋黃，用80目濾布過濾，收集濾液，濾出液和下層液體合并，用板框過濾器加濾板和0.4微米濾膜過濾，即為抗體半成品；
[0013]將抗體半成品轉(zhuǎn)入用0.2%甲醛溶液消毒的冰柜中，4°C冷藏5小時(shí)，使殘留的辛酸結(jié)晶凝結(jié)析出，用80目濾網(wǎng)撇去浮在上層的辛酸結(jié)晶，液調(diào)pH至7.0，再后用磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液調(diào)節(jié)PH至6.9，即為抗體半成品；
[0014](7)過濾:抗體半成品用過濾精度0.2μπι的筒式濾芯過濾除菌，無菌操作分裝，即得到鴨坦布蘇病毒精制卵黃抗體。
[0015]優(yōu)選地，所述步驟(7)中鴨坦布蘇病毒卵黃中和抗體效價(jià)21:512。
[0016]優(yōu)選地，所述步驟(I)中，鴨胚接種為0.1ml/胚。
[0017]優(yōu)選地，所述步驟(2)中振搖次數(shù)為4次，每次3分鐘。
[0018]作為優(yōu)選，所述步驟(2)中離心轉(zhuǎn)速為4000轉(zhuǎn)/分鐘。
[0019]優(yōu)選地，所述步驟(2)中濃縮是用截留分子量為6000道爾頓的中空纖維超濾器。
[0020]優(yōu)選地，所述步驟(3)的免疫程序如下:接種100?110日齡商品蛋雞，依次進(jìn)行:[0021 ] 基礎(chǔ)免疫:每只雞腿部肌肉注射0.5ml;
[0022]加強(qiáng)免疫:在基礎(chǔ)免疫后21日進(jìn)行第2次接種，每只雞胸部肌肉注射1.5ml;
[0023]強(qiáng)化免疫:在加強(qiáng)免疫后15日進(jìn)行第3次接種，每只雞頸背部皮下注射2.0ml;
[0024]維持免疫:當(dāng)卵黃中鴨坦布蘇病毒卵黃中和抗體效價(jià)臨界1:640時(shí)，維持接種I次，每只雞頸背部皮下注射疫苗2.0ml。
[0025]本發(fā)明還提供了所述鴨坦布蘇病毒精制卵黃抗體在治療鴨坦布蘇病毒病方面的應(yīng)用。
[0026]優(yōu)選地，所述鴨坦布蘇病毒精制卵黃抗體在治療鴨坦布蘇病毒病方面的應(yīng)用，包括:皮下或肌肉注射，8日齡以內(nèi)雛鴨按0.5?0.8ml/只；9?15日齡雛鴨按1.0ml/只；16日齡以上按1.0ml/kg體重。
[0027]優(yōu)選地，所述鴨坦布蘇病毒精制卵黃抗體在治療鴨坦布蘇病毒病方面的應(yīng)用，還包括配合抗生素來控制細(xì)菌繼發(fā)感染。
[0028]與現(xiàn)有技術(shù)相比本發(fā)明的有益效果在于:目前鴨坦布蘇病毒病無疫苗用于預(yù)防，臨床發(fā)病后，按常規(guī)抗病毒結(jié)合抗菌的治療方案，效果不佳，治愈率低于40 %，鴨群呈持續(xù)發(fā)病狀態(tài)，每天死亡率1_2%，采食量低于正常量的1/2，商品肉鴨發(fā)育受阻，與正常鴨比較，料肉比高20%以上，出欄時(shí)間延長15天以上，發(fā)育不整齊，品相不佳;商品蛋鴨和種鴨產(chǎn)蛋期發(fā)病時(shí)，常規(guī)治療不佳時(shí)導(dǎo)致病程較長，卵泡和輸卵管受損嚴(yán)重，種公鴨生殖器萎縮，產(chǎn)蛋率和種蛋受精率銳減，當(dāng)因?yàn)殚L期維持低采食量時(shí)，蛋鴨會(huì)換羽，導(dǎo)致整群鴨大部分停產(chǎn)，嚴(yán)重影響經(jīng)濟(jì)效益。
[0029]本發(fā)明制備的鴨坦布蘇病毒精制卵黃抗體，用于治療，按照使用說明劑量，用藥I次，2天后可控制死亡、采食量恢復(fù)正常量的90%，3天后病鴨即可恢復(fù)正常采食量，臨床發(fā)病癥狀消失，配合抗生素來控制細(xì)菌繼發(fā)感染效果更佳。商品雛鴨愈后發(fā)育良好，不影響經(jīng)濟(jì)價(jià)值;商品蛋鴨和種鴨及時(shí)治療時(shí)，采食量恢復(fù)正常7天后的產(chǎn)蛋率平均回升5?13%。
【具體實(shí)施方式】
[0030]下面對(duì)本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述。基于本發(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。
[0031]本發(fā)明抗原用種病毒屬于黃病毒科黃病毒屬蚊媒病毒的恩塔亞病毒群，和坦布蘇病毒親緣關(guān)系最近，暫定為該病毒的一個(gè)分離株，故該病又稱為鴨坦布蘇病毒病。來源:《中國家禽》2012年第02期一例蛋鴨黃病毒病的診治，作者:唐維國；施少華;傅光華;韋啟鵬;劉林秀;季華員;林建生;黃瑜。
[0032]本實(shí)施例鴨坦布蘇病毒精制卵黃抗體的制備方法包括如下步驟:
[0033]1.鴨坦布蘇病毒轉(zhuǎn)移因子-白細(xì)胞介素2佐劑滅活疫苗制備
[0034]1.1抗原制備
[0035]鴨坦布蘇病毒用生理鹽水10000倍稀釋，經(jīng)尿囊腔接種11日齡易感鴨胚，0.1ml/胚，收集接種48?120小時(shí)死亡鴨胚尿囊液，無菌檢驗(yàn)合格，即為抗原，于-40°C保存，同時(shí)取樣用于鑒定。
[0036]1.2抗原鑒定
[0037]1.2.1病毒含量
[0038]抗原用生理鹽水10倍系列稀釋，取10—4、10—5、10—6和10—74個(gè)稀釋度接種9日齡易感鴨胚，每個(gè)稀釋度各接種5枚，0.1ml/胚，用蠟封孔，于37.5°C靜置孵化，24小時(shí)以前死亡的鴨胚棄去不計(jì)，收集24?168小時(shí)死亡鴨胚，按Reed-Muench法計(jì)算病毒含量為10—6'5()ELD50/
0.1mlo
[0039]1.2.2 純凈性
[0040]抗原按照現(xiàn)行《中華人民共和國獸藥典》進(jìn)行細(xì)菌、支原體和外源病毒檢驗(yàn)合格。[0041 ] 1.2.3 特異性
[0042]抗原用生理鹽水稀釋至200ELD5Q/0.1ml，與等量抗鴨坦布蘇病毒特異性血清混合，37 0C水浴中和I小時(shí)，尿囊腔接種9日齡易感鴨胚1枚，0.1ml /胚；同時(shí)設(shè)病毒對(duì)照1枚，接種同條件處理的病毒與生理鹽水混合液0.1ml/枚，上述鴨胚用蠟封孔，于37°C靜置孵育，觀察至168小時(shí)，中和組鴨胚全部健活，對(duì)照組鴨胚全部死亡，說明抗原能被抗鴨坦布蘇病毒特異性血清中和。
[0043]1.2.4免疫原性
[0044]1.2.4.1 抗原滅活
[0045]抗原加終濃度為0.1 %甲醛，37 °C滅活24小時(shí)，期間振搖4次，每次3分鐘。
[0046]1.2.4.2 滅活檢驗(yàn)
[0047]1.2.4.2.1無菌按照現(xiàn)行《中華人民共和國獸藥典》檢驗(yàn)，無細(xì)菌生長。
[0048]1.2.4.2.2安全檢驗(yàn)滅活抗原皮下或肌肉注射4?5周齡商品蛋雞10只，2.0ml/每只，飼養(yǎng)觀察14日，不出現(xiàn)由疫苗引起的任何局部和全身不良反應(yīng)。
[0049]1.2.4.2.3 免疫接種
[0050]滅活抗原按如下免疫程序接種100?110日齡商品蛋雞5只，同時(shí)設(shè)5只對(duì)照，不做任何處理，免疫程序如下:
[0051 ] 基礎(chǔ)免疫每只雞腿部肌肉注射0.5ml;
[0052]加強(qiáng)免疫在基礎(chǔ)免疫后21日進(jìn)行第2次接種，每只雞胸部肌肉注射1.5ml;
[0053]強(qiáng)化免疫在加強(qiáng)免疫后15日進(jìn)行第3次接種，每只雞頸背部皮下注射2.0ml;
[0054]1.2.4.2.4抗體效價(jià)檢測
[0055]強(qiáng)化免疫后14日宰殺試驗(yàn)組和對(duì)照組的雞，分別分離血清，按組混合，按現(xiàn)行《中華人民共和國獸藥典》的中和試驗(yàn)法檢測血清中鴨坦布蘇病毒特異性抗體效價(jià)。結(jié)果為:試驗(yàn)組中和抗體效價(jià)為1:320，對(duì)照組中和抗體效價(jià)<1:4，結(jié)果說明抗原的免疫原性良好。
[0056]1.3鴨坦布蘇病毒轉(zhuǎn)移因子-白細(xì)胞介素2佐劑滅活疫苗制備
[0057]抗原加終濃度為0.1 %甲醛，37 °C滅活24小時(shí)(期間振搖4次，每次3分鐘)。于4°C經(jīng)4000轉(zhuǎn)/分鐘離心30分鐘，收集上清液，上清液用截留分子量為6000道爾頓的中空纖維超濾器濃縮15倍，濃縮液轉(zhuǎn)入滅菌容器，于4°C保存。
[0058]濃縮抗原加入轉(zhuǎn)移因子和鴨白細(xì)胞介素2，使轉(zhuǎn)移因子(按多肽計(jì)算)終濃度為2mg/ml，鴨白細(xì)胞介素2終濃度為4yg/ml，即為鴨坦布蘇病毒轉(zhuǎn)移因子-白細(xì)胞介素2佐劑滅活疫苗，無菌操作分裝，于2?8 °C保存。取樣按1.2.4.2進(jìn)行無菌和安全性檢驗(yàn)合格。
[0059]2.鴨坦布蘇病毒精制卵黃抗體制造及檢驗(yàn)
[0060]2.1高免雞蛋的生產(chǎn)
[0061]2.1.1產(chǎn)蛋雞應(yīng)具有商品蛋雞的生產(chǎn)性能。
[0062]2.1