專(zhuān)利名稱(chēng)：超強(qiáng)毒傳染性法氏囊病毒高免蛋黃抗體制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于病毒學(xué)和免疫學(xué)的領(lǐng)域，是利用分離到的超強(qiáng)毒制備傳染性法氏囊高免蛋黃抗體，尤其涉及一種超強(qiáng)毒傳染性法氏囊病毒(vvIBDV)高免蛋黃抗體制備方法。
背景技術(shù)：
傳染性法氏囊病毒是由雙鏈RNA病毒科的傳染性法氏囊病病毒(IBDV)所引起的一種雞的急性暴發(fā)性傳染病。表現(xiàn)為法氏囊淋巴組織和淋巴細(xì)胞壞死，發(fā)病率及死亡率均高。而高免蛋黃液是防治IBDV的有效措施。(王志杰，雞傳染性法氏囊病高免卵黃抗體液的研制，西昌農(nóng)業(yè)高等專(zhuān)科學(xué)校學(xué)報(bào)2004年，18卷，2期51-54)針對(duì)目前發(fā)病情況，大多是由于超超強(qiáng)毒株感染引起的，而變異株的抗原性和經(jīng)典疫苗株間有差異，主要引起免疫抑制。因此，傳統(tǒng)的疫苗不足以對(duì)超超強(qiáng)毒株造成的感染提供很好的保護(hù)(蔣靜，孫建和等傳染性法氏囊病毒上海超超強(qiáng)毒株VP2-4-3基因真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建與表達(dá)，華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2004年4月23卷第2期:179-182)，因此很多養(yǎng)殖場(chǎng)免疫過(guò)兩次傳染性法氏囊疫苗，后又發(fā)生傳染性法氏囊病，這與我們從發(fā)病雞場(chǎng)分離到的超超強(qiáng)毒株的情況相吻合，證明了超超強(qiáng)毒株能引起雞群免疫抑制，大量死亡(張存，范坤曉等，雞傳染性法氏囊病超超強(qiáng)毒的感染與防制，畜牧與獸醫(yī)1996，28 (3) =130-132 ;韋平，龍進(jìn)學(xué)等，傳染性法氏囊病病毒快速檢測(cè)與分型技術(shù)的研究，中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2004，24 (4):313-316)，而高免蛋黃液是防治其的有效措施，雖然目前世界不同地區(qū)也有過(guò)研究傳染性法氏囊病的高免蛋黃抗體的報(bào)道。(王志杰，雞傳染性法氏囊病高免卵黃抗體液的研制，西昌農(nóng)業(yè)高等專(zhuān)科學(xué)校學(xué)報(bào)2004年，18卷，2期51-54 ;鄭素琴，李翠云等。雞法氏囊病和法氏囊-新城疫二聯(lián)高免卵黃液制備與應(yīng)用研究吉林畜牧獸醫(yī)3-7 ;俞炳梅。法氏囊高免卵黃抗體在制作和使用中應(yīng)注意的幾個(gè)問(wèn)題，山東家禽1998年，5期:16)。但由于傳染性法氏囊病毒超強(qiáng)毒株的出現(xiàn)造成疫苗控制不力，發(fā)病急，死亡率高等情況，而技術(shù)相對(duì)落后的監(jiān)測(cè)鑒定方法以及制備高免蛋黃液的方法對(duì)防治超 超強(qiáng)毒株傳染性法氏囊病造成很大的困難，而且山西省處于高原多山地帶，養(yǎng)雞戶分散，給采集病料造成一定的困難，因此分離鑒定工作繁瑣復(fù)雜，工作量較大，難于分離?，F(xiàn)有技術(shù)生產(chǎn)高免蛋黃抗體主要是用從發(fā)病養(yǎng)殖場(chǎng)中分離到的傳染性法氏囊病毒經(jīng)過(guò)滅活，接種產(chǎn)蛋雞后取蛋黃來(lái)制作，在制作過(guò)程中并沒(méi)有確定所分離到病原的致病力。這種種傳統(tǒng)方法不能保證制作出來(lái)的高免蛋黃抗體的通用性，只能針對(duì)單個(gè)的養(yǎng)殖場(chǎng)。不能確定其他養(yǎng)殖場(chǎng)的雞群在發(fā)病期的治療效果。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)上述問(wèn)題，本發(fā)明實(shí)施例的目的在于提供一種超強(qiáng)毒傳染性法氏囊病毒高免蛋黃抗體制備方法及應(yīng)用。本發(fā)明實(shí)施例是這樣實(shí)現(xiàn)的，一種超強(qiáng)毒傳染性法氏囊病毒高免蛋黃抗體制備方法，其特征在于，采集不同地區(qū)、不同雞場(chǎng)疑似傳染性法氏囊病雞病料，進(jìn)行病原的分離培養(yǎng)、設(shè)計(jì)一對(duì)引物擴(kuò)增傳染性法氏囊病毒vp2基因序列、由于vp2屬于其特征性保守序列，能擴(kuò)增出這段序列即能對(duì)其鑒定，利用擴(kuò)增出來(lái)的產(chǎn)物經(jīng)過(guò)電泳、觀察，確保擴(kuò)增出與設(shè)計(jì)的目的條帶大小相符的條帶，對(duì)含有擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠回收，測(cè)序，同國(guó)際和國(guó)內(nèi)已發(fā)表的已知序列比對(duì)，即可對(duì)其分型，分為超強(qiáng)毒毒株、強(qiáng)毒毒株、普通毒株等，最終確定本次分離到的傳染性法氏囊病毒毒株屬于超強(qiáng)毒株。進(jìn)一步，該超強(qiáng)毒傳染性法氏囊病毒高免蛋黃抗體制備方法具體包括病料采集處理及病毒純化繁殖，vvIBDV-PCR鑒定，步驟如下:病料的采集處理:從不同地區(qū)疑似法氏囊病雞中采集法氏囊病料；主要選擇法氏囊外觀水腫呈膠凍樣、出血呈紫葡萄狀。將法氏囊反復(fù)凍融三次，充分釋放病毒粒子，增加病毒粒子含量，無(wú)菌研磨，再加等體積加入4000IU青霉素、2000IU鏈霉素/ml的雙抗，放入-20°C保存，備用；用瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)檢測(cè)病毒效價(jià)，被檢病毒與標(biāo)準(zhǔn)法氏囊陽(yáng)性血清出現(xiàn)明顯的沉淀線，證明法氏囊病毒的存在；病毒純化繁殖:法氏囊病毒乳液在雞胚中繁殖:購(gòu)買(mǎi)60枚PFS雞蛋，分三批孵育，每批20枚。將第一批20枚雞蛋放入溫箱中，每日翻蛋2-3次，注意保持濕度。4日后放入第二批，再4日后放入第三批。當(dāng)?shù)谝慌u胚10日齡時(shí)，雞胚絨毛膜接種法氏囊病毒，0.2ml/枚，接種完畢用熔化石蠟封閉兩孔，逐日觀察，24h內(nèi)死亡胚棄去，48h死胚保留，120h死活胚從孵化器中取出，放入4°C冰箱靜置，收獲內(nèi)死、活雞胚絨毛膜和尿囊液；采用瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)方式測(cè)法氏囊病毒效價(jià)，絨毛膜和尿囊液與標(biāo)準(zhǔn)法氏囊陽(yáng)性血清都出現(xiàn)明顯的沉淀線，效價(jià)為21。將胚體和絨毛膜無(wú)菌取出加PBS緩沖液充分研磨，反復(fù)凍融3次后，進(jìn)行第二次接毒，方法同上，絨毛膜和尿囊液與標(biāo)準(zhǔn)法氏囊陽(yáng)性血清都出現(xiàn)明顯的沉淀線，病毒效價(jià)為23 ;同樣進(jìn)行第三次接病毒，絨毛膜和尿囊液與標(biāo)準(zhǔn)法氏囊陽(yáng)性血清都出現(xiàn)明顯的沉淀線，病毒效價(jià)為26;進(jìn)一步，該超強(qiáng)毒傳染性法氏囊病毒高免蛋黃抗體制備方法包括wIBDV-PCR鑒定，步驟如下:引物的設(shè)計(jì)與合成:根據(jù)genbank登錄IBDV vp2基因參考序列和表達(dá)載質(zhì)粒PFastBacHTA表達(dá)閱讀框設(shè)計(jì)vp2基因擴(kuò)增引物:Pl:5/ -CGGAATTCATGACAAACCTGCAAGATCAAACC-3'；P2:5/ ~CCCTCGAGCACCGGCACAGCTATCCTCCTTAT~3/ ；兩頭分別引入EcoRI和XhoI酶切位點(diǎn)；病毒RNA的提取:用Trizol法提取RNA，取250ul病毒液于一普通的1.5mlEP管中，加入750ulTrizol，震 蕩混勻，靜置5min ;加入150ul氯仿，震蕩混勻，4°C離心，12000r/min, 5min ;取上清加入450ul異丙醇,顛倒混勻,4°C離心，12000r/min, 12min ;棄液體,加Iml 75% DEPC乙醇洗漆，4°C離心，12000r/min, 5min ;棄液體,虹吸,干燥沉淀。加9ulDEPC水、，50°C水浴lOmin，開(kāi)始反轉(zhuǎn)錄。反轉(zhuǎn)錄步驟為:10ulRNA、lul隨機(jī)引物和4ul dNTP混勻，65°C水浴8min后迅速冰浴5min。再加入4ulBuffer、Iul反轉(zhuǎn)錄酶和lullul RNaseinhibitor，37°C水浴2_3h ;以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，，Pl和P2為引物進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)體系:5XStar Buffer5ul, dNTP2ul，4ul 模板，Pl 和 P2 各 0.5ul, Primestar0.25ul,ddH2012.75ul ;PCR 反應(yīng)條件:98 °C 預(yù)變性 IOs ;98°C 變性 10s，55 °C 退火 15s，72 °C 延伸100s共30個(gè)循環(huán)，72 °C終延伸IOmin ;凝膠電泳以鑒定分子量大??；將PCR產(chǎn)物按照AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行回收；取4.5ul回收產(chǎn)物加入5ul Sollution I和
0.5ulVenter，混勻，4°C過(guò)夜。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入E.coli DH5 α感受態(tài)細(xì)菌，涂布在用LB配制的1.5%瓊脂平皿上，含氨芐青霉素100mg/L，37°C培養(yǎng)14h ;挑單菌落接種入含氨芐青霉素100mg/L的LB()，振搖培養(yǎng)12h ;按Plasmid Mini kit I(IOO)說(shuō)明書(shū)提取質(zhì)粒。質(zhì)粒用EcoR I和Xho I雙酶切鑒定，陽(yáng)性重組質(zhì)粒命名為T(mén)-VP2 ；分離株VP2序列分析及推導(dǎo)氨基酸序列分析:測(cè)序結(jié)果表明，分離株VP2基因核苷酸長(zhǎng)度為1389bp，推導(dǎo)氨基酸序列含有347個(gè)氨基酸，采用DNAstar軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析，對(duì)照IBDV經(jīng)典強(qiáng)、弱毒株及超超強(qiáng)毒株高變區(qū)氨基酸序列分析分離株VP2分子特征；分離株符合強(qiáng)度株的特征:分離株VP2第328-334位氨基酸序列為S-W-S-A-S-G-S，這與IBDV經(jīng)典超強(qiáng)毒株VP2七肽區(qū)序列相同，超超強(qiáng)毒分子特征為222 A、256 1,294 I和299 S本分離株符合256 1,294 I和299 S三個(gè)特征，證明本毒株為vvIBDV經(jīng)典超強(qiáng)毒株。進(jìn)一步，該超強(qiáng)毒傳染性法氏囊病毒高免蛋黃抗體制備方法具體包括超強(qiáng)毒傳染性法氏囊病毒(vvIBDV)滅活苗的制備，步驟為:取分離鑒定的vvIBDV絨毛膜和尿囊液加4%吐溫為水相；白油加司盤(pán)再加硬脂酸招為油相，水相與油相按一定比例進(jìn)行乳化即為vvIBDV滅活苗。進(jìn)一步，該超強(qiáng)毒傳染性法氏囊病毒高免蛋黃抗體制備方法具體包括超強(qiáng)毒傳染性法氏囊病毒(vvIBDV)高免蛋黃抗體制備，步驟為:選擇產(chǎn)蛋20%左右的健康雞500只；用市場(chǎng)上賣(mài)的法氏囊弱毒苗基礎(chǔ)免疫；基礎(chǔ)免疫10天后，用我們制備的WlBDV滅活苗免疫，1ml% /只，頸部皮下注射；間隔15天后，用我們制備的vvIBDV滅活苗免疫，2ml% /只，頸部皮下注射；免疫30天后采血檢測(cè)IBD抗體，用瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)檢測(cè)IBD抗體，達(dá)到27時(shí)留蛋，即為vvIBDV高免蛋；vvIBDV高免蛋洗干凈，然后放入萬(wàn)分之一的高錳酸鉀水里泡5-10分鐘，取出放入消毒好的容器里，將蛋清與蛋黃分離，蛋黃放入無(wú)菌容器里攪拌1分鐘，倒入500ml的瓶子里，冰箱凍存；用于法氏囊病毒感染的病雞；30日齡以下的雞，1-1.5ml/只；30日齡以上的雞1.5-2.0ml/只。胸部肌肉或皮下注射。進(jìn)一步，采用高免技術(shù)，制備高免蛋黃抗體，接種于傳染性法氏囊病的雞群，使雞群在短時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生傳染性法氏病病毒抗體，在24小內(nèi)中和體內(nèi)的法氏囊病毒，達(dá)到治療的目的。本發(fā)明提供的超強(qiáng)毒傳染性法氏囊病毒高免蛋黃抗體制備方法，采用高免技術(shù)，制備高免蛋黃抗體，接種于傳染性法氏囊病的雞群，使雞群在短時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生傳染性法氏病病毒抗體，在24小內(nèi)中和體內(nèi)的法氏囊病毒，達(dá)到治療的目的。
具體實(shí)施例方式為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。
采集不同地區(qū)、不同雞場(chǎng)疑擬傳染性法氏囊病雞病料，進(jìn)行病原的分離培養(yǎng)、設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增vp2基因序列、以及鑒定、分型、回收、測(cè)序等基因工程的方法和技術(shù)，將擴(kuò)增產(chǎn)物與國(guó)際上超強(qiáng)毒株固有特征進(jìn)行比對(duì)，確定其屬于超超強(qiáng)毒株。利用我們分離的超強(qiáng)毒傳染性法氏囊病毒株，研制高免蛋黃抗體治療劑，來(lái)治療雞群感染超強(qiáng)毒傳染性法氏囊病。傳染性法氏囊病在我國(guó)被發(fā)現(xiàn)以后一直不停的變異，專(zhuān)家學(xué)者研究其發(fā)展趨勢(shì)是毒力變?nèi)酰谧罱鼛啄晖蝗怀霈F(xiàn)超超強(qiáng)毒株，導(dǎo)致養(yǎng)禽業(yè)的失敗和大批量雞的死亡，雖然大多數(shù)養(yǎng)殖戶都免疫過(guò)傳染性法氏囊病疫苗兩次，但這些疫苗產(chǎn)生的抗體不能抵抗超強(qiáng)毒株的感染，造成大量養(yǎng)雞場(chǎng)雞群的發(fā)病死亡，而本發(fā)明應(yīng)用法氏囊超強(qiáng)毒株制作的高免蛋黃抗體能夠治療雞群感染超強(qiáng)毒傳染性法氏囊病。本發(fā)明實(shí)施例提供的超強(qiáng)毒傳染性法氏囊病毒(vvIBDV)高免蛋黃抗體制備方法，具體包括如下步驟:1.1、病料采集處理及病毒純化繁殖。1.1.1.病料的采集處理從全省不同地區(qū)疑似法氏囊病雞中采集法氏囊病料。主要選擇法氏囊外觀水腫呈膠凍樣、出血呈紫葡萄狀。將法氏囊反復(fù)凍融三次，充分釋放病毒粒子，增加病毒粒子含量，無(wú)菌研磨，再加等體積加入4000IU青霉素、2000IU鏈霉素/ml的雙抗，放入_20°C保存，備用。用瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)檢測(cè)病毒效價(jià)，被檢病毒與標(biāo)準(zhǔn)法氏囊陽(yáng)性血清出現(xiàn)明顯的沉淀線，基本證明法氏囊病毒的存在。1.1.2、病毒純化繁殖法氏囊病毒乳液在雞胚中繁殖。購(gòu)買(mǎi)60枚PFS雞蛋，分三批孵育，每批20枚。將第一批20枚雞蛋放入溫箱中，每日翻蛋2-3次，注意保持濕度。4日后放入第二批，再4日后放入第三批。當(dāng)?shù)谝慌u胚10日齡時(shí)，雞胚絨毛膜接種法氏囊病毒，0.2ml/枚，接種完畢用熔化石蠟封閉兩孔，逐日觀察，24h內(nèi)死亡胚棄去，48h死胚保留，120h死活胚從孵化器中取出，放入4°C冰箱靜置，收獲內(nèi)死、活雞胚絨毛膜和尿囊液；采用瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)方式測(cè)法氏囊病毒效價(jià)，絨毛膜和尿囊液與標(biāo)準(zhǔn)法氏囊陽(yáng)性血清都出現(xiàn)明顯的沉淀線，效價(jià)為21。將胚體和絨毛膜無(wú)菌取出加PBS緩沖液充分研磨，反復(fù)凍融3次后，進(jìn)行第二次接毒，方法同上，絨毛膜和尿囊液與標(biāo)準(zhǔn)法氏囊陽(yáng)性血清都出現(xiàn)明顯的沉淀線，病毒效價(jià)為23。同樣進(jìn)行第三次接病毒，絨毛膜和尿囊液與標(biāo)準(zhǔn)法氏囊陽(yáng)性血清都出現(xiàn)明顯的沉淀線，病毒效價(jià)為26。1.2vvIBDV-PCR 鑒定:1.2.1引物的設(shè)計(jì)與合成根據(jù)genbank登錄IBDV vp2基因參考序列和表達(dá)載質(zhì)粒pFastBacHTA表達(dá)閱讀框設(shè)計(jì)vp2基因擴(kuò)增引物:Pl:5/ ~CGGAATTCATGACAAACCTGCAAGATCAAACC~3/ ；P2:5/ -CCCTCGAGCACCGGCACAGCTATCCTCCTTAT-3';兩頭分別弓I入 EcoRI 和 XhoI酶切位點(diǎn)。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2.2病毒RNA的提取用Trizol法提取RNA，具體步驟為:取250ul病毒液于一普通的1.5mlEP管中，加入750ulTrizol,震蕩混勻，靜置5min。加入150ul氯仿，震蕩混勻，4°C離心，12000r/min,5min。取上清加入450ul異丙醇,顛倒混勻,4°C離心，12000r/min, 12min。棄液體，力口lml75% DEPC乙醇洗漆,4°C離心，12000r/min, 5min。棄液體,虹吸,干燥沉淀。加9ulDEPC水、，50°C水浴I Omin，開(kāi)始反轉(zhuǎn)錄。反轉(zhuǎn)錄步驟為:10ulRNA、lul隨機(jī)引物和4uldNTP混勻，65 °C水浴8min后迅速冰浴5min。再加入4ulBuffer、Iul反轉(zhuǎn)錄酶和IullulRNaseinhibitor，37°C水浴2-3h。以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，，Pl和P2為引物進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)體系:5XStar Buffer 5ul, dNTP 2ul，4ul 模板，Pl 和 P2 各 0.5ul, Primestar 0.25ul,ddH20 12.75ul。PCR 反應(yīng)條件:98 °C 預(yù)變性 IOs ;98°C 變性 10s，55 °C 退火 15s，72。。延伸100s共30個(gè)循環(huán)，72°C終延伸lOmin。凝膠電泳以鑒定分子量大小。將PCR產(chǎn)物按照AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行回收。取4.5ul回收產(chǎn)物加入5ul Sollution I和0.5ulVenter，混勻，4°C過(guò)夜。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入E.coliDH5 α感受態(tài)細(xì)菌，涂布在用LB配制的1.5%瓊脂平皿上(含氨芐青霉素100mg/L)，37°C培養(yǎng)14h。挑單菌落接種入LB (含氨節(jié)青霉素100mg/L),振搖培養(yǎng)12h。按Plasmid Mini kit I (100)說(shuō)明書(shū)提取質(zhì)粒。質(zhì)粒用EcoR I和Xho I雙酶切鑒定，陽(yáng)性重組質(zhì)粒命名為T(mén)-VP2。測(cè)序結(jié)果見(jiàn)序列表。1.2.3分離株VP2序列分析及推導(dǎo)氨基酸序列分析測(cè)序結(jié)果表明，分離株VP2基因核苷酸長(zhǎng)度為1389bp，推導(dǎo)氨基酸序列含有347個(gè)氨基酸，采用DNAstar軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析，對(duì)照IBDV經(jīng)典強(qiáng)、弱毒株及超超強(qiáng)毒株聞變區(qū)氨基酸序列分析分尚株VP2分子特征。分尚株符合強(qiáng)度株的特征:分尚株VP2第328-334位氨基酸序列為S-W-S-A-S-G-S，這與IBDV經(jīng)典超強(qiáng)毒株VP2七肽區(qū)序列相同，超超強(qiáng)毒分子特征為222 A、256 1,294 I和299 S本分離株符合222 A、256 1,294 I和299S四個(gè)特征。證明本 毒株為vvIBDV經(jīng)典超強(qiáng)毒株。1.2、超強(qiáng)毒傳染性法氏囊病毒(vvIBDV)滅活苗的制備:取分離鑒定的wIBDV絨毛膜和尿囊液加4%吐溫為水相；優(yōu)質(zhì)白油加司盤(pán)再加硬脂酸鋁為油相，水相與油相按一定比例進(jìn)行乳化即為wIBDV滅活苗。注射。
1.3、超強(qiáng)毒傳染性法氏囊病毒(vvIBDV)高免蛋黃抗體制備:
1.3.1選擇產(chǎn)蛋20%左右的健康雞500只。
1.3.2用市場(chǎng)上賣(mài)的法氏囊弱毒苗基礎(chǔ)免疫。
1.3.3基礎(chǔ)免疫10天后，用我們制備的vvIBDV滅活苗免疫，Iml % /只，頸部皮下
1.3.4間隔15天后，用我們制備的vvIBDV滅活苗免疫，2ml%/只，頸部皮下注射。1.3.5免疫30天后采血檢測(cè)IBD抗體，用瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)檢測(cè)IBD抗體，達(dá)到27時(shí)留蛋，即為vvIBDV高免蛋。1.3.6vvIBDV高免蛋洗干凈，然后放入萬(wàn)分之一的高錳酸鉀水里泡5_10分鐘，取出放入消毒好的容器里，將蛋清與蛋黃分離，蛋黃放入無(wú)菌容器里攪拌I分鐘，倒入500ml的瓶子里，冰箱凍存。1.3.6用于法氏囊病毒感染的病雞。30日齡以下的雞，1_1.5ml/只；30日齡以上的雞1.5-2.0ml/只。胸部肌肉或皮下注射。2、如權(quán)利要求1所述的超強(qiáng)毒傳染性法氏囊病毒高免蛋黃抗體制備方法，其特征在于，采用高免技術(shù)，制備高免蛋黃抗體，接種于傳染性法氏囊使雞群在短時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生傳染性法氏病病毒抗體，在2 4小內(nèi)中和體內(nèi)的法氏囊病毒，達(dá)到治療的目的。
以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均`應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.超強(qiáng)毒傳染性法氏囊病毒vvIBDV高免蛋黃抗體制備方法，其特征在于，采集不同地區(qū)、不同雞場(chǎng)疑似傳染性法氏囊病雞病料，進(jìn)行病原的分離培養(yǎng)、設(shè)計(jì)一對(duì)引物擴(kuò)增傳染性法氏囊病毒vp2基因序列、由于vp2屬于其特征性保守序列，能擴(kuò)增出這段序列即能對(duì)其鑒定，利用擴(kuò)增出來(lái)的產(chǎn)物經(jīng)過(guò)電泳、觀察，確保擴(kuò)增出與設(shè)計(jì)的目的條帶大小相符的條帶，對(duì)含有擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠回收，測(cè)序，同國(guó)際和國(guó)內(nèi)已發(fā)表的已知序列比對(duì)，即可對(duì)其分型，分為超強(qiáng)毒毒株、強(qiáng)毒毒株、普通毒株等，最終確定本次分離到的傳染性法氏囊病毒毒株屬于超超強(qiáng)毒株。
2.如權(quán)利要求1所述的超強(qiáng)毒傳染性法氏囊病毒高免蛋黃抗體制備方法，其特征在于，該超強(qiáng)毒傳染性法氏囊病毒高免蛋黃抗體制備方法具體包括病料采集處理及病毒純化繁殖，vvIBDV-PCR鑒定，步驟如下: 病料的采集處理:從不同地區(qū)疑似法氏囊病雞中采集法氏囊病料；主要選擇法氏囊外觀水腫呈膠凍樣、出血呈紫葡萄狀；將法氏囊反復(fù)凍融三次，充分釋放病毒粒子，增加病毒粒子含量，無(wú)菌研磨，再加等體積加入4000IU青霉素、2000IU鏈霉素/ml的雙抗，放入_20°C保存，備用；用瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)檢測(cè)病毒效價(jià)，被檢病毒與標(biāo)準(zhǔn)法氏囊陽(yáng)性血清出現(xiàn)明顯的沉淀線，證明法氏囊病毒的存在； 病毒純化繁殖:法氏囊病毒乳液在雞胚中繁殖:購(gòu)買(mǎi)60枚PFS雞蛋，分三批孵育，每批20枚；將第一批20枚雞蛋放入溫箱中，每日翻蛋2-3次，注意保持濕度；4日后放入第二批，再4日后放入第三批；當(dāng)?shù)谝慌u胚10日齡時(shí)，雞胚絨毛膜接種法氏囊病毒，0.2ml/枚，接種完畢用熔化石蠟封閉兩孔，逐日觀察，24h內(nèi)死亡胚棄去，48h死胚保留，120h死活胚從孵化器中取出，放入4°C冰箱靜置，收獲內(nèi)死、活雞胚絨毛膜和尿囊液；采用瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)方式測(cè)法氏囊病毒效 價(jià)，絨毛膜和尿囊液與標(biāo)準(zhǔn)法氏囊陽(yáng)性血清都出現(xiàn)明顯的沉淀線，效價(jià)為21 ;將胚體和絨毛膜無(wú)菌取出加PBS緩沖液充分研磨，反復(fù)凍融3次后，進(jìn)行第二次接毒，方法同上，絨毛膜和尿囊液與標(biāo)準(zhǔn)法氏囊陽(yáng)性血清都出現(xiàn)明顯的沉淀線，病毒效價(jià)為23 ;同樣進(jìn)行第三次接病毒，絨毛膜和尿囊液與標(biāo)準(zhǔn)法氏囊陽(yáng)性血清都出現(xiàn)明顯的沉淀線，病毒效價(jià)為26。
3.如權(quán)利要求1所述的超強(qiáng)毒傳染性法氏囊病毒高免蛋黃抗體制備方法，其特征在于，該超強(qiáng)毒傳染性法氏囊病毒高免蛋黃抗體制備方法包括vvIBDV-PCR鑒定，步驟如下: 引物的設(shè)計(jì)與合成:根據(jù)genbank登錄IBDV vp2基因參考序列和表達(dá)載質(zhì)粒PFastBacHTA表達(dá)閱讀框設(shè)計(jì)vp2基因擴(kuò)增引物:Pl:5/ ~CGGAATTCATGACAAACCTGCAAGATCAAACC~3/ ；P2:5/ ~CCCTCGAGCACCGGCACAGCTATCCTCCTTAT~3/ ； 兩頭分別引入EcoRI和XhoI酶切位點(diǎn)； 病毒RNA的提取:用Trizol法提取RNA，取250ul病毒液于一普通的1.5ml EP管中，加入750ul Trizol，震蕩混勻，靜置5min ;加入150ul氯仿，震蕩混勻，4°C離心，12000r/min, 5min ;取上清加入450ul異丙醇，顛倒混勻,4°C離心，12000r/min, 12min ;棄液體，力口lml75 % DEPC乙醇洗漆,4°C離心，12000r/min, 5min ;棄液體，虹吸，干燥沉淀；加9ulDEPC水、，50°C水浴lOmin，開(kāi)始反轉(zhuǎn)錄；反轉(zhuǎn)錄步驟為:10ulRNA、lul隨機(jī)引物和4uldNTP混勻，65°C水浴8min后迅速冰浴5min ;再加入4ul Buffer、Iul反轉(zhuǎn)錄酶和Iul IulRNaseinhibitor，37°C水浴2-3h ;以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，，Pl和P2為引物進(jìn)行PCR反應(yīng)；PCR反應(yīng)體系:5XStar Buffer5ul, dNTP2ul，4ul 模板，Pl 和 P2 各 0.5ul, Primestar0.25ul,ddH2012.75ul ;PCR 反應(yīng)條件:98 °C 預(yù)變性 IOs ;98°C 變性 10s，55 °C 退火 15s，72 °C 延伸100s共30個(gè)循環(huán)，72 °C終延伸IOmin ;凝膠電泳以鑒定分子量大??；將PCR產(chǎn)物按照AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行回收；取4.5ul回收產(chǎn)物加入5ul Sollution I和`0.5ulVenter，混勻，4°C過(guò)夜；將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入E.coliDH5 α感受態(tài)細(xì)菌，涂布在用LB配制的1.5%瓊脂平皿上，含氨芐青霉素100mg/L，37°C培養(yǎng)14h ;挑單菌落接種入含氨芐青霉素100mg/L的LBO，振搖培養(yǎng)12h ;提取質(zhì)粒；質(zhì)粒用EcoR I和Xho I雙酶切鑒定，陽(yáng)性重組質(zhì)粒命名為T(mén)-VP2 ； 分離株VP2序列分析及推導(dǎo)氨基酸序列分析:測(cè)序結(jié)果表明，分離株VP2基因核苷酸長(zhǎng)度為1389bp，推導(dǎo)氨基酸序列含有347個(gè)氨基酸，采用DNAs tar軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析，對(duì)照IBDV經(jīng)典強(qiáng)、弱毒株及超超強(qiáng)毒株高變區(qū)氨基酸序列分析分離株VP2分子特征；分離株符合強(qiáng)度株的特征:分離株VP2第328-334位氨基酸序列為S-W-S-A-S-G-S，這與IBDV經(jīng)典超強(qiáng)毒株VP2七肽區(qū)序列相同，超超強(qiáng)毒分子特征為222A、2561、294I和299S本分離株符合2561、2941和299S三個(gè)特征，證明本毒株為vvIBDV經(jīng)典超強(qiáng)毒株。
4.如權(quán)利要求1所述的超強(qiáng)毒傳染性法氏囊病毒高免蛋黃抗體制備方法，其特征在于，該超強(qiáng)毒傳染性法氏囊病毒高免蛋黃抗體制備方法具體包括超強(qiáng)毒傳染性法氏囊病毒(vvIBDV)滅活苗的制備，步驟為: 取分離鑒定的vvIBDV絨毛膜和尿囊液加4%吐溫為水相；白油加司盤(pán)再加硬脂酸鋁為油相，水相與油相按一定比例進(jìn)行乳化即為vvIBDV滅活苗。
5.如權(quán)利要求1所述的超強(qiáng)毒傳染性法氏囊病毒高免蛋黃抗體制備方法，其特征在于，該超強(qiáng)毒傳染性法氏囊病毒高免蛋黃抗體制備方法具體包括超強(qiáng)毒傳染性法氏囊病毒(vvIBDV)高免蛋黃抗體制備，步驟為:` 選擇產(chǎn)蛋20%左右的健康雞500只； 用市場(chǎng)上賣(mài)的法氏囊弱毒苗基礎(chǔ)免疫； 基礎(chǔ)免疫10天后，用我們制備的vvIBDV滅活苗免疫，Iml% /只，頸部皮下注射； 間隔15天后，用我們制備的vvIBDV滅活苗免疫，2ml% /只，頸部皮下注射； 免疫30天后采血檢測(cè)IBD抗體，用瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)檢測(cè)IBD抗體，達(dá)到27時(shí)留蛋，即為vvIBDV高免蛋； VVIBDV高免蛋洗干凈，然后放入萬(wàn)分之一的高錳酸鉀水里泡5-10分鐘，取出放入消毒好的容器里，將蛋清與蛋黃分離，蛋黃放入無(wú)菌容器里攪拌I分鐘，倒入500ml的瓶子里，冰箱凍存； 用法以:用于法氏囊病毒感染的病雞；30日齡以下的雞，1-1.5ml/只；30日齡以上的雞1.5-2.0ml/只；胸部肌肉或皮下注射。
6.如權(quán)利要求1所述的超強(qiáng)毒傳染`性法氏囊病毒高免蛋黃抗體制備方法，其特征在于，采用高免技術(shù)，制備高免蛋黃抗體，接種于傳染性法氏囊病的雞群，使雞群在短時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生傳染性法氏病病毒抗體，在24小內(nèi)中和體內(nèi)的法氏囊病毒，達(dá)到治療的目的。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種超強(qiáng)毒傳染性法氏囊病毒(vvIBDV)高免蛋黃抗體制備方法，通過(guò)走訪不同地區(qū)養(yǎng)殖場(chǎng)，對(duì)發(fā)病雞群采樣、病原的分離培養(yǎng)、設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增vp2基因序列、利用鑒定、分型、回收、測(cè)序方法和技術(shù)將擴(kuò)增產(chǎn)物與國(guó)際上超強(qiáng)毒株固有特征進(jìn)行比對(duì)，確定其屬于超超強(qiáng)毒株。利用我們分離的超強(qiáng)毒傳染性法氏囊病毒株，研制高免蛋黃抗體治療劑，來(lái)治療雞群感染超強(qiáng)毒傳染性法氏囊病。本發(fā)明提供的超強(qiáng)毒傳染性法氏囊病毒高免蛋黃抗體制備方法，采用高免技術(shù)制備高免蛋黃抗體，接種于傳染性法氏囊病的雞群，使雞群在短時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生傳染性法氏病病毒抗體，在24小內(nèi)中和體內(nèi)的法氏囊病毒，達(dá)到治療的目的。
文檔編號(hào)C07K16/02GK103172733SQ20131004200
公開(kāi)日2013年6月26日 申請(qǐng)日期2013年1月27日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月27日
發(fā)明者詹麗娥, 劉華棟, 陸冰洋, 王采先, 唐娟, 詹海杰 申請(qǐng)人:山西省農(nóng)科院畜牧獸醫(yī)研究所