一種用于治療仔豬流行性腹瀉的卵黃抗體口服劑及其制備方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物工程領域，設及一種獸醫(yī)生物制品，具體來說是一種用于治療仔 豬流行性腹瀉的卵黃抗體口服劑的制備方法。
【背景技術】
[0002] 豬流行性腹瀉（P邸）是由豬流行性腹瀉病毒（porcine巧idemicdiarrhea virus,陽DV)所引起的豬的一種急性高度接觸性傳染病，各年齡段的豬均可發(fā)病，但對哺 乳仔豬的危害最為嚴重。感染PEDV的仔豬常會因急性腸炎及致命性水瀉而導致脫水死亡， 20日齡W內(nèi)仔豬死亡率可達95%W上，給養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大經(jīng)濟損失。
[0003] 疫苗接種是預防疾病發(fā)生的主要途徑之一，然而在此次國內(nèi)的P邸流行中，此方 法并沒有有效遏制PED的發(fā)生與流行。卵黃抗體作為一種有較強免疫功能的蛋白質(zhì)，目前 已有報道將其用于豬某些腸道疾病的防治，效果較好。而且PEDV主要通過腸道感染豬，具 有明顯的腸道組織嗜性，卵黃抗體經(jīng)口服后在腸道內(nèi)與PEDV作用，可阻止病毒的吸附和感 染，同時病毒排出體外后失去感染力，對該病流行也有一定的抑制作用。除此之外，卵黃抗 體還是一種高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)的多克隆抗體，產(chǎn)量高，價格低廉，對腸道正常菌群無副作用，不存在 抗藥性和藥物殘留問題。因此，發(fā)展特異、安全、高效的卵黃抗體口服制劑，具有重要的臨床 和現(xiàn)實意義，應用前景廣闊。
[0004] 目前為止，尚沒有WPEDV中和表位C0E蛋白制備卵黃抗體的研究和應用的文獻報 道。
[0005]S蛋白是PEDV的主要結構蛋白，在介導宿主產(chǎn)生中和抗體的過程中發(fā)揮著重要作 用，如識別祀細胞、促進病毒和細胞膜的融合等，所WS蛋白被認為是有效抵抗PEDV的主要 祀抗原。近年來，國內(nèi)外許多學者對S蛋白進行了廣泛研究。化ang等根據(jù)TGEVS基因的 中和表位序列，推測出了陽DVS基因的一個抗原表位區(qū)（499-638aa)，并命名為C0E，隨后 也被很多研究人員用于基因工程疫苗的制備。Kang等已將PEDV化1/87株的C0E基因在 煙草中表達，并通過動物試驗證實其具有良好的抗原性。BaeJL等人將C0E基因轉(zhuǎn)入煙 草中，給小鼠注射轉(zhuǎn)基因植物蛋白，結果證明煙草表達的該疫苗具有免疫原性。此外，在使 用ELISA檢測PEDV抗體時，抗S蛋白的抗體較N蛋白抗體更容易被檢出，而且抗S蛋白抗 體比抗N蛋白抗體更為持久。因此，S蛋白在PEDV新型疫苗研究W及PEDV血清學診斷方 面具有重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 針對現(xiàn)有技術中的上述技術問題，本發(fā)明提供了一種用于治療仔豬流行性腹瀉的 卵黃抗體口服劑的制備方法，所述的運種用于治療仔豬流行性腹瀉的卵黃抗體口服劑的制 備方法解決了現(xiàn)有技術中沒有很好的藥物治療仔豬流行性腹瀉的技術問題。
[0007] 本發(fā)明提供了一種用于治療仔豬流行性腹瀉的卵黃抗體口服劑，含有WPEDV流 行毒株保護性抗原基因COE蛋白免疫非免疫產(chǎn)蛋雞后收集的雞蛋卵黃中提取的卵黃抗體。
[0008] 進一步的，所述的一種用于治療仔豬流行性腹瀉的卵黃抗體口服劑，由植物油、卵 黃、山梨酸鐘、乙氧基哇嘟、維生素、礦物質(zhì)和益生菌，在所述的口服劑中，所述的植物油的 質(zhì)量百分比濃度為57%-60%，所述的的卵黃的質(zhì)量百分比濃度為37%-40%，所述的山梨酸鐘 的質(zhì)量百分比濃度為0. 25%，所述的乙氧基哇嘟的質(zhì)量百分比濃度為0. 25%，余量為所述的 維生素、礦物質(zhì)和益生菌，所述的維生素、礦物質(zhì)和益生菌的質(zhì)量比為1:1: 1，所述的卵黃是 WPEDV流行毒株保護性抗原基因C0E蛋白免疫非免疫產(chǎn)蛋雞后收集的雞蛋卵黃。
[0009] 本發(fā)明還提供了上述的一種用于治療仔豬流行性腹瀉的卵黃抗體口服劑的制備 方法，包括W下步驟： 1) 采用豬流行性腹瀉病毒陽性病料，使用RT-PCR方法擴增保護性抗原基因C0E，連接 到原核表達載體，對C0E蛋白進行表達、純化，使用弗氏佐劑對蛋白進行乳化，制備成免疫 原； 2) 利用制備的免疫原免疫非免疫蛋雞； 3) 免疫后收集雞蛋，在無菌條件下收集卵黃，然后提取卵黃中的卵黃抗體； 4) 運用蝕斑減數(shù)試驗測定卵黃抗體對PEDV病毒的中和抗體效價； 5) 收集卵黃抗體效價在1:64W上的雞蛋，用75%酒精浸泡消毒20min-30min，驚干，打 開雞蛋，分離蛋黃，將蛋黃制備成卵黃抗體口服劑。
[0010] 進一步的，在步驟5)中，用蛋黃分離器將蛋黃分離開后，按照質(zhì)量百分比稱取植物 油、卵黃、山梨酸鐘、乙氧基哇嘟、維生素、礦物質(zhì)和益生菌，先將山梨酸鐘溶于卵黃中，攬拌 均勾；將植物油水浴加熱到65~75°C，在植物油中添加乙氧基哇嘟，然后將添加了乙氧基哇 嘟的植物油加入到卵黃液中，邊加入邊攬拌，完全乳化后加入維生素、礦物質(zhì)和益生菌，直 至形成膏狀液體即可。
[0011] 進一步的，步驟1)中，C0E蛋白，其純度不低于85%，濃度不低于Img/ml。
[0012] 進一步的，步驟2)中，免疫程序如下：首次免疫劑量為1ml/羽，首次免疫后2周、 4周、8周分別進行Ξ次加強免疫，免疫劑量為2ml/羽。
[0013] 本發(fā)明的卵黃抗體口服劑W當前流行毒株為基礎，對豬流行性腹瀉病毒（P邸V)的 保護性抗原基因C0E進行原核表達、純化，獲得目的蛋白，用弗氏佐劑制備成免疫原接種非 免疫蛋雞，免疫后收集雞蛋，從蛋黃中提取出卵黃抗體并將其制備成安全、高效的卵黃抗體 口服劑。
[0014] 本發(fā)明中制備的卵黃抗體口服劑為雞的免疫球蛋白，能夠特異性的中和PEDV病 毒，同時，添加的微生物、礦物質(zhì)和益生菌對仔豬消化系統(tǒng)有營養(yǎng)和修復作用；可用于治療 臨床上由PEDV病毒感染導致的仔豬腹瀉，對于未感染的仔豬可W起到預防作用；臨床試驗 表明，使用本發(fā)明制備的產(chǎn)品可W減少仔豬腹瀉的發(fā)生率，提高豬場的經(jīng)濟效益；本發(fā)明制 備成本低，無殘留，適合大規(guī)模生產(chǎn)和推廣。
[0015] 本發(fā)明和已有技術相比，其技術進步是顯著的。通過本發(fā)明的制備方法獲得的抗 仔豬腹瀉高免卵黃抗體口服劑可減少仔豬的腹瀉發(fā)生率，而且不會對仔豬帶來應激等不良 影響。同時也可運用該口服劑對同群未感染的仔豬進行預防，本發(fā)明的口服劑制備工藝簡 單，適合規(guī)?；a(chǎn)及臨床應用。
【具體實施方式】
[0016] 實施例1陽DVCOE蛋白的表達和純化 1.C0E蛋白的表達 1) 采集疑似PEDV發(fā)病豬腸道，取適量放入研鉢中，加入適量PBS進行研磨。將研磨液 300化pm離屯、10分鐘，取100μ1上清，使用RNA提取試劑盒提取RNA。采用PrimerPremier 5. 0軟件設計了一對引物，用于COE基因的擴增。上游引物Ml:5>-CGGGATCCACTTCTTTTGTTA CTTTGCCATC-3 ' ；下游引物M2 :5 ' -CGGAATTCAACACCTTCAAGTGGTTTAGG-3 '。在克隆引物 5 ' 端 和3'端分別設計了BamHI、EcoRI限制性酶切位點，擴增大小為43化P，咖SEQIDN0:3 所示)。氨基酸序列為(如SEQIDNO:4所示） 2) PCR產(chǎn)物膠回收純化后，經(jīng)限制性內(nèi)切酶消化，回收的片段定向克隆于pMDlS-T載 體中，轉(zhuǎn)化D冊α感受態(tài)細胞，經(jīng)藍白斑篩選、PCR鑒定獲得陽性菌落，并送公司測序設日SEQ IDΝ0:5所示)。將測序正確的陽性菌落擴大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，經(jīng)限制性內(nèi)切酶消化，電泳觀 察，將目的片段切膠并回收，定向克隆于pColdII載體，轉(zhuǎn)化化aperoneCompetentCell pG-Tf2/BL21，經(jīng)PCR鑒定篩選獲得陽性菌落。
[0017] 3)將陽性菌株接種于氨節(jié)青霉素(終濃度50μg/ml)和氯霉素（20μg/ml)抗性LB 培養(yǎng)液中，37°C250rpm搖床培養(yǎng)過夜。第二日，按照1 :100的比例將過夜培養(yǎng)物接種于氨 節(jié)青霉素(終濃度50μg/ml)，氯霉素(終濃度50μg/ml)和四環(huán)素(終濃度5ng/ml)抗性LB 培養(yǎng)液中，37°C25化pm搖床培養(yǎng)化，待0D600 > 0. 8時，加入IPTG使其終濃度為ImM，30°C 250巧m誘導表達化。4°C8000巧m離屯、收集菌體。
[001引 離屯、收集的菌體加入40ml50mMPB、0. 3M化ClUOmM咪挫、5%甘油抑8. 0的 buffer重懸(每100ml培養(yǎng)液收集的菌體，加入10ml的buffer),置于冰上，使用超聲波破 碎儀破碎。然后4°C1300化pm離屯、30min。分別取未誘導全菌、誘導后全菌、破碎上清、破 碎沉淀進行SDS-PAGE電泳檢測。該蛋白為非可溶性表達。
[0019] 蛋白的純化 1)?。?00ml)菌體破碎后收集