一種豬源口蹄疫病毒非結(jié)構(gòu)蛋白3abc的單鏈抗體及其制備方法和用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)一種豬源口蹄疫病毒非結(jié)構(gòu)蛋白3ABC的單鏈抗體及其制法。生物醫(yī)藥技 術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 口蹄疫病毒(Foot and Mouth Disease Virus,FMDV)屬于小RNA病毒科，基因組為 8.5化的單鏈正向RNA，編碼單一的多聚蛋白。多聚蛋白在體內(nèi)酶解成不同的結(jié)構(gòu)蛋白（SP) 和非結(jié)構(gòu)蛋白（NSP)，結(jié)構(gòu)蛋白￥口1、￥口2、￥口3、￥口4組成病毒的衣殼，非結(jié)構(gòu)蛋白171^9、24、28、 2(：、34、38、3(：、30負責(zé)病毒復(fù)制和蛋白酶解剪切。
[0003] 口蹄疫是一種影響全球經(jīng)濟、動物貿(mào)易和肉類食品安全的重要的偶蹄類動物傳染 病，疫苗免疫可經(jīng)濟、高效防控口蹄疫。根據(jù)流行國家FMD疫情，F(xiàn)MD的控制主要依賴將FMDV 流行株經(jīng)化學(xué)滅活后制備成滅活疫苗用于動物免疫W及持續(xù)不斷的監(jiān)測。疫苗免疫防控口 蹄疫爆發(fā)，取決于能否準(zhǔn)確、可靠區(qū)分感染動物中已經(jīng)免疫的動物(discriminate between infected and vaccinated animals，DIVA) JMDV疫苗經(jīng)滅活、純化除去了大部分的非結(jié)構(gòu) 蛋白。動物對疫苗的反應(yīng)主要針對病毒結(jié)構(gòu)蛋白，因此，通過血清學(xué)方法檢測非結(jié)構(gòu)蛋白， 特別是多聚蛋白3ABC，來區(qū)別感染的動物和疫苗免疫的動物。非結(jié)構(gòu)蛋白的存在意味動物 體內(nèi)存在活病毒的復(fù)制，即說明動物遭受了病毒感染。
[0004] 區(qū)別動物免疫化IVA)和感染診斷是控制和根除口蹄疫最重要的手段。目前DIVA的 檢測所用抗體多為單克隆或多克隆抗體，其制備、質(zhì)量保證困難，在疾病暴發(fā)后的疾病檢測 難W定量分析。重組抗體用抗體工程技術(shù)生產(chǎn)且能保證抗體批次穩(wěn)定一致、試劑性質(zhì)成份 明確，其生產(chǎn)不依賴動物免疫、也不需要不同骨髓瘤細胞的培養(yǎng)、維持。
[0005] 可識別和區(qū)別非結(jié)構(gòu)蛋白和結(jié)構(gòu)蛋白的抗體血清學(xué)方法的建立是FMDV診斷方面 重要的一環(huán)節(jié)，已經(jīng)發(fā)展了許多人工合成、大腸桿菌、酵母、昆蟲桿狀病毒系統(tǒng)表達的重組 抗原W及多克隆、單克隆抗體，用間接或直接競爭化ISA方法作為DIVA診斷。
[0006] 抗體工程生產(chǎn)制備重組抗體相對常規(guī)抗體制備方法具有經(jīng)濟、可大規(guī)模生產(chǎn)的優(yōu) 點?？贵w基因片段文庫可克隆到表達載體，在絲狀嗜菌體表面呈現(xiàn)單鏈抗體片段或單鏈可 變區(qū)片段，因此可利用隧菌體展示技術(shù)篩選重組抗體基因和其表達的融合蛋白產(chǎn)物，通過 篩選不同文庫或體外突變，進行抗體生物學(xué)活性如親和性、特異性的富集。
[0007] 重組抗體可來源于不同的動物種屬，豬由于特異免疫球蛋白基因多樣性，建立多 樣性文庫較其他種屬動物容易。豬的免疫球蛋白有重鏈可變區(qū)、輕鏈可變區(qū)，使用功能基因 上游的無功能假性基因，通過免疫球蛋白基因的重排?？蒞產(chǎn)生重組多樣性。假基因缺乏功 能元件如啟動子區(qū)、但含功能基因的保守序列。因此通過設(shè)計針對獨特功能可變基因二側(cè) 保守區(qū)的引物，用PCR擴增重排可變片段的完整譜可克隆得到具有高度多樣性的豬免疫球 蛋白膽存庫。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種抗口蹄疫病毒非結(jié)構(gòu)蛋白3ABC的單鏈抗 體，該單鏈抗體能夠用于區(qū)分口蹄疫病毒自然感染動物W及口蹄疫疫苗免疫動物。
[0009] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是通過W下技術(shù)手段實現(xiàn)的：
[0010] 本發(fā)明通過使用口蹄疫病毒重組非結(jié)構(gòu)蛋白3ABC免疫豬，建立了抗口蹄疫病毒非 結(jié)構(gòu)蛋白3ABC單鏈可變區(qū)片段（single chain variable fragments,scFv)隧菌體展示文 庫，經(jīng)過進一步篩選獲得了3條重組單鏈抗體，分別命名為PRAb-scFv-2Al、PRAb-scFv-3B2 W及PRAb-scFv-4Hl，序列測定結(jié)果表明：S者具有相同的重鏈序列，但輕鏈序列明顯差異。 重鏈決定抗原結(jié)合特異性，實驗發(fā)現(xiàn)，該=條重組單鏈抗體均能夠與口蹄疫病毒非結(jié)構(gòu)蛋 白3ABCW及3C區(qū)片段特異性結(jié)合。
[0011] 進一步研究發(fā)現(xiàn)：PRAb-scFv-2Al、PRAb-scFv-3B2、PRAb-scFv-4H13 抗體中，PRAb-scFv-4m和 PRAb-scFv-2Al、PRAb-scFv-3B2 比較，有較高的非特異結(jié)合性。PRAb-scFv-2Al、 PRAb-scFv-3B2在競爭化ISA中都能有效區(qū)別感染和未感染豬血清，但PRAb-scFv-3B2更能 明顯區(qū)分感染豬和未感染豬血清，且對陽性血清阻抑水平高、對陰性血清的背景低。且 PRAb-scFv-3B2對ABC蛋白有較高的親和性，PRAb-scFv-2Al必須稀釋1:80才能達到PRAb-SCFV-3B2稀釋1:1600所對應(yīng)的OD值，但巧巾抗體在大腸桿菌的表達水平一樣。
[0012] 使用口蹄疫病毒重組非結(jié)構(gòu)蛋白3ABC作為包被抗原，WPRAb-scFv-SAUPRAb-scFv-SBS 或 PRAb-scFv-4Hl 作為競爭抗體通過競爭化 ISA 法 (C-ELISA) 測試 W 上 S條單鏈抗 體對口蹄疫病毒非結(jié)構(gòu)蛋白3ABC、3A、3BW及3C抗體的阻抑率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PRAb-scFv-3B2特 異結(jié)合3C與3ABCe3ABC/PRAb-scFv-3B2和3C/PRAb-scFv-3B2組合競爭化ISA結(jié)果有明顯區(qū) 分，3ABC/PRAb-scFv-3B2優(yōu)于3C/PRAb-scFv-3B2，說明檢測抗體由于位阻效應(yīng)而不是由于 對相同結(jié)合位點直接競爭而使待檢血清抗體結(jié)合的3A或3B表位完全阻斷。
[0013] 對大量豬血清用C-化ISA檢測顯示對陰性血清低阻抑百分比，而對陽性血清較高 水平的阻抑率。
[0014] PRAb-scFv-3B2作為競爭抗體和3ABC作為抗原的C-HJSA中，可區(qū)分豬、牛、羊的感 染、未感染血清和疫苗免疫血清。不同的動物檢測有顯著區(qū)別，羊疫苗免疫血清背景較深。 檢測結(jié)果顯示PRAb-scFv-3B2比較適合檢測豬和牛血清。
[0015] 在上述研究基礎(chǔ)上，本發(fā)明提出了一種豬源口蹄疫病毒非結(jié)構(gòu)蛋白3ABC的單鏈抗 體，命名為PRAb-scFv-3B2,其氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示。
[0016] 編碼所述的單鏈抗體的核巧酸序列也在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
[0017] 進一步的，本發(fā)明還提出了所述的單鏈抗體在制備檢測口蹄疫病毒非結(jié)構(gòu)蛋白 3ABC或3C蛋白試劑中的用途。
[0018] 其中，優(yōu)選的，所述的試劑可用于區(qū)分口蹄疫病毒自然感染動物W及口蹄疫疫苗 免疫動物。
[0019] FMD爆發(fā)或流行，疫苗免疫對疾病防控起到重要作用。對免疫動物和自然感染的區(qū) 別是建立無口蹄疫地區(qū)最重要的考量。需要大量爆發(fā)或流行后口蹄疫病毒非結(jié)構(gòu)蛋白抗體 的檢測。運種方法應(yīng)有高敏感性、高特異性且適合大規(guī)模的篩選。
[0020] 為使口蹄疫病毒非結(jié)構(gòu)蛋白抗體檢測方法標(biāo)準(zhǔn)化和優(yōu)化，檢測試劑應(yīng)批與批質(zhì)量 穩(wěn)定、能經(jīng)濟和簡單生產(chǎn)，重組抗原和重組抗體生產(chǎn)技術(shù)滿足W上的生產(chǎn)要求。
[0021] 本發(fā)明進一步使用重組口蹄疫病毒非結(jié)構(gòu)蛋白3ABC單鏈抗體，建立了區(qū)別動物感 染與免疫（differentiate infected 打om vaccinated animals ,DIVA)的檢測方法。
[0022] 更進一步的，本發(fā)明提出了一種用于區(qū)分口蹄疫病毒自然感染動物W及口蹄疫疫 苗免疫動物（differentiate infected from vaccinated animals,DIVA)的口蹄疫病毒 3ABC抗體競爭ELISA檢測試劑盒，包括包被口蹄疫病毒非結(jié)構(gòu)蛋白3ABC的酶標(biāo)板W及本發(fā) 明所述的單鏈抗體PRAb-S CFV-3B2。
[0023] 其中，優(yōu)選的，所述試劑盒還包括陰性對照、陽性對照、封閉液、顯色液和洗涂液。
[0024] 其中，優(yōu)選的，用于區(qū)分口蹄疫病毒自然感染動物W及口蹄疫疫苗免疫動物時，按 照W下方法進行：
[0025] (1)取出包被口蹄疫病毒非結(jié)構(gòu)蛋白3ABC的酶標(biāo)板，W洗涂液洗板；
[0026] (2)向酶標(biāo)板中加入封閉液稀釋的待測動物血清，37°C解育30分鐘，并不斷搖動， 加入所述的單鏈抗體PRAb-scFv-3B2，37 °C解化60分鐘并不斷搖動，W洗涂液洗板；同時加 入陰性血清和陽性血清作對照；
[0027] (3)然后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔抗3ABC單鏈抗體的I gG抗體；
[00%] (4)得到的加酶標(biāo)記抗體后的酶標(biāo)板中加入TMB溶液，振蕩混合后37°C顯色，2M硫 酸溶液終止反應(yīng)；
[0029] (5)檢測在0D4日日皿處的吸光值A(chǔ)450nm。
[0030] 其中，優(yōu)選的，所述陰性對照為未感染口蹄疫病毒也未接種口蹄疫疫苗的陰性血 清；陽性對照為口蹄疫病毒陽性血清;所述封閉液為含有1 %牛血清白蛋白的PBST緩沖液； 所述洗涂液為PBST緩沖液。
[0031 ] 使用本發(fā)明的試劑盒，可從免疫動物中區(qū)別感染動物(differentiate infected from vaccinated animals ,DIVA)。該試劑盒的優(yōu)點是檢測抗體和包被抗原都來自大腸桿 菌系統(tǒng)，包含完整3ABC，無需傳染性FMDV病毒、安全、經(jīng)濟，無需傳統(tǒng)抗體生產(chǎn)中大量多種骨 髓瘤細胞培養(yǎng)W及試驗動物飼養(yǎng)。
【附圖說明】
[0032] 圖1為WPRAb-scFv-3B2作為檢測抗體檢測不同F(xiàn)MDV血清樣本的競爭化ISA結(jié)果；
[0033] 圖2為WPRAb-scFv-2Al作為檢測抗體檢測不同F(xiàn)MDV血清樣本的競爭化ISA結(jié)果。
【具體實施方式】
[0034] 下面結(jié)合具體實施例來進一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點和特點將會隨著描述而 更為清楚。但實施例僅是范例性的，并不對本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng) 該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可W對本發(fā)明技術(shù)方案的細節(jié)和形式進行修 改或替換，但運些修改和替換均落入本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。
[0035] 實施例1.3ABC重組單鏈抗體基因的構(gòu)建、篩選
[0036] 1.1 材料：
[0037] 中國主要流行的口蹄疫病毒有A型、亞洲1型W及0型。采集感