NCoR/SMRT蛋白復(fù)合體在調(diào)節(jié)細(xì)胞命運(yùn)轉(zhuǎn)變中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本技術(shù)設(shè)及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其設(shè)及一種通過干擾NCoR/SMRT蛋白復(fù)合體的功能 而實(shí)現(xiàn)細(xì)胞重編程的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] NcoR/SMRT是屬于同一家族的一對具有高度同源性的蛋白因子，在進(jìn)化上非常保 守，存在于從低等生物到人類的所有物種。他們最早是作為激素受體的共抑制因子而被發(fā) 現(xiàn)，可W結(jié)合甲狀腺激素受體和視黃酸受體，在沒有配體的情況下，由受體帶到它們的祀基 因上，抑制運(yùn)些基因的表達(dá)。而當(dāng)激素受體與激素配體相結(jié)合，NcoR/SMRT將從受體上解離 下來，激素受體與轉(zhuǎn)錄共激活因子如P300相結(jié)合，行使轉(zhuǎn)錄激活功能。除了激素受體，很多 其他的轉(zhuǎn)錄因子也可W和NcoR/SMRT相結(jié)合并發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。NcoR/SMRT的生理功能非常廣 泛。在小鼠胚胎中對化oR/SMRT進(jìn)行敲除，絕大多數(shù)胚胎分別在胚胎第15.5天和第16.5天死 亡，前者死于神經(jīng)系統(tǒng)，紅細(xì)胞和胸腺發(fā)育障礙;后者則出現(xiàn)了前腦發(fā)育不正常，最終致死 原因為屯、力衰竭。敲除實(shí)驗顯示了NcoR/SMRT在神經(jīng)、造血、屯、臟的發(fā)育和功能中起到重要 作用。
[0003] 除了發(fā)育中的功能，NcoR/SMRT在表觀遺傳調(diào)控上也起到關(guān)鍵作用。NcoR/SMRT可 W和包括HDAC3在內(nèi)的幾乎所有組蛋白去乙酷化酶化istone deacetylase，皿AC)家族成員 相互作用，調(diào)節(jié)組蛋白的乙酷化修飾，決定染色質(zhì)的開放程度。NcoR/SMRT總是W轉(zhuǎn)錄抑制 復(fù)合體的形式存在并發(fā)揮作用，其核屯、成分包括NcoR或SMRT、組蛋白去乙酷酶HDAC3,運(yùn)兩 個組分總是存在于復(fù)合體中。其他成分如TBLl ,TOLEl，GPS2，ZBTB3等則根據(jù)不同的細(xì)胞環(huán) 境而選擇性存在。作為核屯、成分的HDAC3可W去掉組蛋白的乙酷化修飾，使染色質(zhì)結(jié)構(gòu)變得 更緊湊，抑制基因的表達(dá)。
[0004] 人們長期認(rèn)為，隨著分化過程的進(jìn)行，動物細(xì)胞的多向分化潛能會消失，逐漸限定 為某種特異的功能，運(yùn)種變化是不可逆的。然而最近的研究表明，體細(xì)胞核移植、細(xì)胞融合、 過表達(dá)胚胎干細(xì)胞化mbryonic Stem〔6113)中的^個核屯、轉(zhuǎn)錄因子5〇義2,0(：14,1(^4都可 W把體細(xì)胞重編程為誘導(dǎo)多潛能干細(xì)胞(Pluripotent Stem Cells)。運(yùn)些發(fā)現(xiàn)使人們認(rèn)識 到細(xì)胞內(nèi)存在一些因子可W決定細(xì)胞的命運(yùn)，通過對運(yùn)些因子進(jìn)行調(diào)控，就可W控制細(xì)胞 的命運(yùn)，得到人類想要的細(xì)胞類型。運(yùn)種細(xì)胞命運(yùn)的轉(zhuǎn)化為未來更廣泛的進(jìn)行臨床上的細(xì) 胞替代治療奠定了基礎(chǔ)。人們將來可W通過重編程將體細(xì)胞誘導(dǎo)為多能干細(xì)胞，進(jìn)一步分 化為自己想要的細(xì)胞類型;也可W通過轉(zhuǎn)分化，使一種細(xì)胞直接轉(zhuǎn)變?yōu)榱硪环N細(xì)胞類型，W 此來獲得數(shù)量上足夠，質(zhì)量上安全的臨床級細(xì)胞制品。
[0005] 轉(zhuǎn)分化是人為的對不同細(xì)胞命運(yùn)轉(zhuǎn)變進(jìn)行調(diào)控的一大成功。不同于重編程，轉(zhuǎn)分 化是通過體外操作，直接將一種細(xì)胞類型誘導(dǎo)為其他細(xì)胞類型，運(yùn)種轉(zhuǎn)換既可W是同一胚 層細(xì)胞間的轉(zhuǎn)換，也可W是跨胚層的細(xì)胞命運(yùn)轉(zhuǎn)變。目前已經(jīng)有包括=個胚層在內(nèi)的很多 細(xì)胞類型實(shí)現(xiàn)了轉(zhuǎn)分化。運(yùn)些轉(zhuǎn)分化的實(shí)現(xiàn)多依賴于不同轉(zhuǎn)錄因子的組合，尤其是與目的 細(xì)胞命運(yùn)相關(guān)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子。當(dāng)運(yùn)些關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子被過表達(dá)之后，細(xì)胞從基因表達(dá)到形 態(tài)變化都會經(jīng)歷一個轉(zhuǎn)變的過程，最終成為另一種細(xì)胞類型。轉(zhuǎn)錄因子具有位點(diǎn)識別功能， 它們能特異性的祀定到基因組的某些區(qū)域，并招募一系列共同作用因子來實(shí)現(xiàn)調(diào)控功能。 運(yùn)些共同作用因子經(jīng)常形成大的復(fù)合物，并可W調(diào)控重要的表觀遺傳修飾，如組蛋白甲基 化或乙酷化，DNA甲基化等等，它們在轉(zhuǎn)分化中的重要性還沒有得到很好的研究。
[0006] 除了正常的細(xì)胞命運(yùn)轉(zhuǎn)變過程，癌癥的發(fā)生可W看做是一種非正常的細(xì)胞命運(yùn)轉(zhuǎn) 變。一種說法認(rèn)為，癌細(xì)胞由正常細(xì)胞獲得基因變異，變異積累后成為惡性的癌細(xì)胞。另一 種說法認(rèn)為體內(nèi)存在癌癥干細(xì)胞，該細(xì)胞在正常情況下處于靜息狀態(tài)，不會惡性爆發(fā)。而當(dāng) 環(huán)境發(fā)生變化后，受到細(xì)胞內(nèi)外綜合因素的影響，會無限制的增值，形成腫瘤。運(yùn)兩種說法， 均為從正常狀態(tài)，向非正常狀態(tài)轉(zhuǎn)變，而內(nèi)在的轉(zhuǎn)變因素，是什么原理觸發(fā)了該種轉(zhuǎn)變，尚 不清楚。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種實(shí)現(xiàn)細(xì)胞重編程的方法。
[0008] 本發(fā)明的內(nèi)容包括NColVSMRT蛋白復(fù)合體在調(diào)節(jié)哺乳動物細(xì)胞命運(yùn)轉(zhuǎn)變中的應(yīng) 用，所述哺乳動物細(xì)胞尤其是小鼠細(xì)胞或人類細(xì)胞。
[0009] 進(jìn)一步地，該應(yīng)用是通過調(diào)節(jié)所述NCoR/SMRT蛋白復(fù)合體中NCoR/SMRT蛋白或其他 部分，主要是HDAC3的活性或表達(dá)水平實(shí)現(xiàn)的。
[0010] 進(jìn)一步地，所述細(xì)胞命運(yùn)轉(zhuǎn)變是a)體細(xì)胞到誘導(dǎo)多功能干細(xì)胞的退分化過程或b) 從體細(xì)胞到其他細(xì)胞類型特別是神經(jīng)細(xì)胞、血液細(xì)胞、肝臟細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化過程或C)細(xì)胞癌 變等非正常的細(xì)胞命運(yùn)轉(zhuǎn)變過程。
[0011] 另一方面，本發(fā)明的內(nèi)容還包括NCoR/SMRT蛋白復(fù)合體在促進(jìn)成體細(xì)胞體外成熟 中的應(yīng)用。
[0012] 另一方面，本發(fā)明的內(nèi)容還包括一種實(shí)現(xiàn)細(xì)胞命運(yùn)轉(zhuǎn)變的方法，，通過干擾NCoR/ SMRT蛋白復(fù)合體的功能而實(shí)現(xiàn)。
[0013] 進(jìn)一步地，所述細(xì)胞命運(yùn)轉(zhuǎn)變?yōu)榧?xì)胞重編程。
[0014] 進(jìn)一步地，所述干擾NCoR/SMRT蛋白復(fù)合體的功能的方法包括但不限于基因敲除、 降低其表達(dá)水平、添加化學(xué)小分子或過表達(dá)顯性負(fù)突變體。
[0015] 進(jìn)一步地，所述顯性負(fù)突變體為HDAC3蛋白的顯性負(fù)抑制突變體。
[0016] 進(jìn)一步地，所述化學(xué)小分子包括但不限于降低NColVSMRT的活性的小分子，調(diào)節(jié) HDAC3活性的小分子，和阻斷NCoR/SMRT與HDAC3相互作用的小分子。
[0017] 另一方面，本發(fā)明的內(nèi)容還包括調(diào)節(jié)NCoR/SMRT蛋白復(fù)合體的活性或表達(dá)水平在 癌癥相關(guān)藥物篩選和癌癥治療中的應(yīng)用。
[0018] 進(jìn)一步地，該應(yīng)用是通過調(diào)節(jié)NCoR/SMRT蛋白復(fù)合體被癌基因 C-Myc招募的過程實(shí) 現(xiàn)的。
[0019] 本發(fā)明創(chuàng)造通過對一種蛋白復(fù)合體的調(diào)節(jié)，實(shí)現(xiàn)了更快更高效的細(xì)胞重編程。具 體包括通過降低表達(dá)水平、添加化學(xué)小分子或過表達(dá)顯性負(fù)抑制蛋白突變體來干擾NCoR/ SMRT共抑制復(fù)合體的功能，從而加速體細(xì)胞(somatic cel Is)到誘導(dǎo)多功能干細(xì)胞(iPSCs) 的重編程過程，并極大的提高重編程的效率。運(yùn)種重編程包括小鼠細(xì)胞、人類細(xì)胞、其他物 種細(xì)胞。我們預(yù)期從體細(xì)胞到其他細(xì)胞類型如神經(jīng)細(xì)胞，血液細(xì)胞，肝臟細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化過程 中，NCoR/SMRT復(fù)合體也將發(fā)揮重要功能，通過對其調(diào)節(jié)，可W達(dá)到更快更高效的細(xì)胞命運(yùn) 轉(zhuǎn)變，同時提高目的細(xì)胞的質(zhì)量，如肝臟細(xì)胞的解毒功能的成熟。
[0020] 同時，因為NCoR/SMRT與癌基因 C-Myc有密切的相互作用，他們在正常細(xì)胞向癌細(xì) 胞的非正常轉(zhuǎn)變中也將發(fā)揮重要的作用。通過篩選得到的，能調(diào)節(jié)NCoR/SMRT與C-Myc的相 互作用或調(diào)節(jié)NCoR/SMRT的活性的小分子，有可能會在未來的癌癥治療中發(fā)揮作用。我們也 希望對運(yùn)一方面進(jìn)行保護(hù)。
[0021] 本發(fā)明為再生醫(yī)學(xué)獲得高效、優(yōu)質(zhì)、快捷的細(xì)胞源提供了保障，對于轉(zhuǎn)分化細(xì)胞的 移植應(yīng)用也有重要的幫助。
[0022] 為了更好地理解和實(shí)施，下面結(jié)合附圖詳細(xì)說明本發(fā)明。
【附圖說明】
[0023] 圖1.降低NCoR和SMRT的表達(dá)水平可W極大地促進(jìn)重編程。（A)NCoR和SMRT的ShRNA 引起的重編程效率變化，統(tǒng)計時間為重編程第9天和第16天；（B-C)NCoR和SMRT的ShRNA在血 清加 Vc的條件下對重編程效率的影響；（D)NCoR和SMRT的ShRNA對細(xì)胞增殖的影響。
[0024] 圖2.敲減HDAC3對重編程效率的影響。（A)篩選另外兩個HDAC3的有效shRNA;(B)敲 減皿AC3在一般重編程條件下的作用；（C)敲減HDAC3在添加 Vc重編程條件下的作用；（D)敲 減HDAC3在添加 VPA重編程條件下的作用。
[0025] 圖3.HDAC3及突變體在重編程中的作用。（A)皿AC3及突變體的結(jié)構(gòu)示意圖；（B) HDAC3及突變體在重編程引起的細(xì)胞形態(tài)變化；（C)HDAC3及突變體對重編程效率的影響(D) HDAC3突變體對細(xì)胞增殖的影響；化)皿AC3突變體在各種條件下對重編程效率的影響； control或者Ctrl為空載體，W下若非說明，均為空載體。
[0026] 圖4.皿AC3雙突變體在重編程中的作用。左圖為突變位點(diǎn)示意圖，右圖為重編程效 率統(tǒng)計圖。Mock為空載體。
[0027] 圖5.shNCoR和shSMRT形成的克隆鑒定。（A)shNCoR和shSMRT的iPSCs的細(xì)胞形態(tài)和 免疫巧光分析；（B)外源重編程因子在iPSCs克隆株的沉默檢測；（C)內(nèi)源多能性基因在 iPSCs克隆株的表達(dá)檢測；（D)外源因子在iPSCs克隆株基因組上的整合檢測；化)iPSCs克隆 株的核型分析;（巧iPSCs克隆株形成的嵌合小鼠。
[002引圖6.NCoR/SMRT在重編程過程中于基因組上的結(jié)合位點(diǎn)，圖上顯示了多能性基因