專利名稱：一種用于檢測葉綠素a的化學(xué)發(fā)光方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于檢測葉綠素a的化學(xué)發(fā)光方法。
背景技術(shù)：
葉綠素a主要具有如下特點l.在植物的光合作用中，大多數(shù)葉綠素a和 全部的葉綠素b都是參與吸收和傳遞光能和的葉綠素。而另有一部分葉綠素a 位于光反應(yīng)系統(tǒng)復(fù)合體上，起光反應(yīng)中心的作用，它們吸收從其他天線色素傳 遞過來的能量用于推動光化學(xué)反應(yīng)的進(jìn)行。無論是天線色素或是反應(yīng)中心色素， 葉綠素都是結(jié)合在特定的蛋白質(zhì)上，組成色素蛋白復(fù)合體行使其功能。2.果蔬 的色澤是構(gòu)成產(chǎn)品品質(zhì)的重要因素，也是檢驗果蔬成熟衰老的依據(jù)，色澤不僅 反映果蔬的新鮮度，還可促進(jìn)人們的食欲，美麗天然的食品顏色是優(yōu)質(zhì)果蔬的 一個重要特征，而果蔬的綠色主要來源于葉綠素，葉綠素決定了產(chǎn)品的品質(zhì)特 征。3.無毒副作用，長期食用安全、可靠性高，F(xiàn)A0/WH0 (1985)對葉綠素每人日 允許攝入量未作規(guī)定。目前，葉綠素已廣泛應(yīng)用于口香糖、硬糖、果汁、瓊脂、 糕點等食品(但不能用于酸性或含4丐食品，否則易產(chǎn)生沉淀)，日本已將其作為 綠色色素用在食品添加劑中。4.另外，葉綠素具有改善便秘、降低膽固醇、抗 衰老、排毒消炎、脫臭、抗癌抗突變、抗貧血、保肝等功能，用于治療燙傷， 慢性潰瘍，對皮膚組織有再生作用，能抑制葡萄球菌和鏈球菌生長，對齒齦炎、 口臭、中耳炎等有一定療效。葉綠素含量的測定方法主要有紫外分光光度法、 熒光分析法、活體葉綠素儀法、光聲光譜法和高效液相色譜法。不過目前應(yīng)用 最為廣泛的還是分光光度法。而對植物體外葉綠素活性的檢測還未見報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種快速、靈敏的只能測定葉綠素a方法。 本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的
1. 流動注射化學(xué)發(fā)光分析系統(tǒng)的流路反相流動注射化學(xué)發(fā)光分析系統(tǒng)的 流路，Rl、 R2、 R3三個管道分別泵入鐵氰化鉀、葉綠素a或空白作為檢測液 以及魯米諾溶液。以檢測液與魯米諾溶液為載流，先經(jīng)三通管混合，待基線穩(wěn) 定后，將鐵氰化鉀溶液注入到4企測液與魯米諾溶液充分反應(yīng)后的合并流中，鐵 氰化鉀的進(jìn)樣時間為20s,分別記錄空白信號強度/。，樣品信號強度為/s,相對 發(fā)光強度為J 增敏率用/ %表示，/ % = f/廣/J / /。XM。，以/ f進(jìn) 行定量；
2. 試驗參數(shù)的優(yōu)化以5mg/L的葉綠素a溶液為試驗對象，選4奪NaOH、鐵 氰化鉀和魯米諾為試驗因素，根據(jù)單因素實驗確定NaOH濃度為《Oxio3mg/L ~ 4.0xl04mg/L ( 0. 1 mol/L~ 1 mol/L)，鐵氰化鉀濃度為3. 2925 mg/L ~ 3. 2925 x 102 mg/L ( 1 x 10-5 mol/L ~ 1 x 10_3mol/L ),魯米諾濃度為11. 716 x 10—2mg/L ~ 11.716 mg/L (1x10—6 mol/L~ 1 x 1(Tmol/L);
43.鐵氰化鉀-魯米諾體系測定葉綠素a的流動注射-化學(xué)發(fā)光分析方法的建立
(1) 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制為提高檢測精密度，在優(yōu)化后的最佳試驗因素水平 條件下，以葉綠素a的濃度在0. 5-10. Omg/L范圍繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；
(2) 最低檢測限的確定通過多次樣品空白試驗，求得其背景響應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn) 差，將三倍空白標(biāo)準(zhǔn)差作為檢測限的估計值。然后配制相應(yīng)檢測限濃度的樣品， 實際測試來驗證方法的最低檢測限，最終測定結(jié)果為O. 13 mg /L;
(3) 精密度試驗對5mg/L的葉綠素a標(biāo)準(zhǔn)品溶液重復(fù)測定11次，計算 其測定濃度的RSD為1. 17 %;
(4 )重復(fù)性試驗將1份5mg/L的葉綠素a標(biāo)準(zhǔn)品溶液分為6份，分別測 定其濃度，計算其RSD為3. 74%;
(5) 干擾試驗為了評價所建立分析方法的選擇性，在已優(yōu)化的試驗條件 下，考察了葉綠素a提取液中可能共存的組份對葉綠素a含量測定的干擾。由 于樣品經(jīng)過分離提純，所得葉綠素a提取液中可能共存的組分基本上只有少量 的色素，據(jù)此，考察了葉綠素b、葉黃素和類胡蘿卜素對試驗的干擾，結(jié)果表明 這些物質(zhì)的實際含量均低于允許量，因此可直接測定。
(6) 樣品分析準(zhǔn)確稱取50-100g洗凈晾干的植物葉片，加入體積百分比 濃度為80%的丙酮500mL,超聲震蕩30 min并浸泡過夜，于低溫下抽濾后，量 準(zhǔn)上清液體積，按二氧六環(huán)丙酮抽提液為1 : 7的體積比例加入二氧六環(huán)，然
后再按水丙酮抽提液為l : 6的體積比例，在攪拌的情況下逐滴加入蒸餾水，
直到出現(xiàn)沉淀，放在-2(TC冰箱靜置30min,并以1500 x g離心5min,得到深藍(lán) 黑色的粉末狀葉綠素a和葉綠素b的混合物沉淀，將沉淀溶于60mL無水乙醇， 抽濾，除去難溶物，低溫減壓干燥成粉后溶于30mL體積百分比濃度為80%的丙 酮，測定時取出lmL再定容至100mL作為樣品溶液，按實驗所述方法測定其含 量。測得樣品溶液濃度為7. 93mg/L，RSD。/。為1. 1 %( 6次重復(fù))，計算出從50-100g 的植物葉片中提取出葉綠素a為23. 8mg。同時進(jìn)行加標(biāo)回收率試驗，測得回收 率為97. 63 %~ 98. 32 °/。，表明該方法準(zhǔn)確可靠，共存組份對測定無干擾。
本發(fā)明所基于的原理為化學(xué)發(fā)光是指吸收了化學(xué)反應(yīng)能的分子由激發(fā)態(tài) 回到基態(tài)時所產(chǎn)生的光輻射現(xiàn)象。
一個化學(xué)反應(yīng)要產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光現(xiàn)象，必須滿足以下條件第一是該反應(yīng)能 夠產(chǎn)生足夠的激發(fā)能，并由某一步驟單獨提供，因為前一步反應(yīng)產(chǎn)生的能量將 因振動弛豫而消失在溶液中；第二是要有有利的反應(yīng)過程，使化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生的 能量可以被某種反應(yīng)產(chǎn)物或中間體吸收，使其處于激發(fā)態(tài)；第三是激發(fā)態(tài)分子 必須具有一定的化學(xué)發(fā)光量子產(chǎn)率，或者能夠?qū)⑵淠芰坑行У剞D(zhuǎn)移給某種熒光 物質(zhì)，產(chǎn)生光輻射。
化學(xué)發(fā)光反應(yīng)之所以能夠用于化學(xué)分析，主要是因為化學(xué)發(fā)光強度與被測 物質(zhì)的濃度之間有一定的聯(lián)系，因而可將影響反應(yīng)速度的因素如濃度作為建立 測定方法的依據(jù)。
化學(xué)發(fā)光分析測定的物質(zhì)可以分為三類第一類物質(zhì)是化學(xué)發(fā)光反應(yīng)中的反應(yīng)物；第二類物質(zhì)是化學(xué)發(fā)光反應(yīng)中的催化劑、增敏劑或抑制劑；第三類物 質(zhì)是偶合反應(yīng)中的反應(yīng)物、催化劑、增敏劑等。還可以通過標(biāo)記這三類物質(zhì)的 方法用來測定其他物質(zhì)，這就進(jìn)一步擴(kuò)大了化學(xué)發(fā)光分析的應(yīng)用范圍。在堿性 條件下，魯米諾可被鐵氰化鉀氧化而產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光，而葉綠素a對這一發(fā)光具 有明顯的增敏作用。據(jù)此，建立了流動注射化學(xué)發(fā)光測定葉綠素a的分析方法。
本發(fā)明的方法可快速、靈敏地檢測葉綠素a,對植物的光合作用、環(huán)境污染 監(jiān)測、果蔬存儲、以及色素應(yīng)用和保健品的開發(fā)應(yīng)用都具有重要的理論意義和 實用價值。


圖1為葉綠素a、 b的結(jié)構(gòu)式。
圖2為反相流動注射化學(xué)發(fā)光法測定葉綠素的分析系統(tǒng)流路圖。
圖3為本發(fā)明實施例鐵氰化鉀-魯米諾體系測定葉綠素a的化學(xué)發(fā)光信號強度。
圖4為本發(fā)明實施例葉綠素a、 b和空白的信號強度差異。
具體實施方式
實施例
1. 材料含有葉綠素a的生物體。
2. 儀器設(shè)備萬分之一電子天平；流動注射化學(xué)發(fā)光分析測試系統(tǒng)；
紫外可見分光光度計。
3. 試劑
(1)葉綠素樣品儲備液以甜葉菊葉片為例，取100g洗凈晾干的甜葉菊 葉片，加入體積百分比濃度為80°/。的丙酮500mL，超聲震蕩30min并浸泡過夜， 于低溫下抽濾后，量準(zhǔn)上清液體積，按二氧六環(huán)丙酮抽提液為1 : 7的體積比
例加入二氧六環(huán)，然后再按水丙酮抽提液為l : 6的體積比例，在攪拌的情況
下逐滴加入蒸餾水，直到出現(xiàn)沉淀，放在-2(TC冰箱靜置30min,并以1500 x g 離心5min,得到深藍(lán)黑色的粉末狀葉綠素a和葉綠素b的混合物沉淀，將沉淀 溶于60mL無水乙醇，抽濾，除去難溶物，低溫減壓干燥成粉，再溶于30mL丙 酮，作為測定用樣品儲備液。
(2 )鐵氰化鉀儲備液(1. 0 x 10-2 moi/mL ):準(zhǔn)確稱取0. 3293g鐵氰化鉀(分 析純)用雙蒸水溶解定容至100mL。
(3)魯米諾儲備液(L 0 x 10-3 mol/mL ):準(zhǔn)確稱取0. 0177g魯米諾 (Sigma-Aldrich),用1 x l(T2 mol/L NaOH ;容液;:容解定容至100mL， 4°C ;水箱避 光放置7d后使用。
4. 流動注射化學(xué)發(fā)光分析系統(tǒng)的流路反相流動注射化學(xué)發(fā)光分析系統(tǒng)的 流路，Rl、 R2、 R3三個管道分別泵入鐵氰化鐘、葉綠素a或空白作為檢測液 以及魯米諾溶液。以;險測液與魯米諾溶液為載流，先經(jīng)三通管混合，待基線穩(wěn) 定后，將鐵氰化鉀溶液注入到檢測液與魯米諾溶液充分反應(yīng)后的合并流中，鐵 氰化鉀的進(jìn)樣時間為30s,分別記錄空白信號強度厶，樣品信號強度為"，相對
6發(fā)光強度為Zl 增敏率用/ %表示，/ % =廣A-T^ / /。乂7M,以/ I進(jìn)
行定量。
5. 試驗參數(shù)的優(yōu)化以5mg/L的葉綠素a溶液為試驗對象，選擇NaOH、鐵 氰化鉀和魯米諾為試驗因素，根據(jù)單因素實驗確定NaOH濃度為0.05mol/L， 鐵氰化鉀濃度為lxlO—4mol/L,魯米諾濃度為1x10—6mol/L。
6. 鐵氰化鉀-魯米諾體系測定葉綠素a的流動注射-化學(xué)發(fā)光分析方法的建
立
(1) 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制為提高檢測精密度，在優(yōu)化后的最佳試驗因素水平 條件下，以葉綠素a的濃度在0. 5 ~ 10. Omg/L范圍繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；
(2) 最低檢測限的確定通過多次樣品空白試驗，求得其背景響應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn) 差，將三倍空白標(biāo)準(zhǔn)差作為檢測限的估計值。然后配制相應(yīng)檢測限濃度的樣品， 實際測試來一瞼i正方法的最^f氐;f企測限，最終測定結(jié)果為0.13 mg /L;
(3 )精密度試驗對5mg/L的葉綠素a標(biāo)準(zhǔn)品溶液重復(fù)測定11次，計算 其測定濃度的RSD為1. 17 %;
(4 )重復(fù)性試驗將1份5mg/L的葉綠素a標(biāo)準(zhǔn)品溶液分為6份，分別測 定其濃度，計算其RSD為3. 74%;
(5) 干擾試驗為了評價所建立分析方法的選擇性，在已優(yōu)化的試驗條件 下，考察了葉綠素a提取液中可能共存的組份對葉綠素a含量測定的干擾。由 于樣品經(jīng)過分離提純，所得葉綠素a提取液中可能共存的組分基本上只有少量 的色素，據(jù)此，考察了葉綠素b、葉黃素和類胡蘿卜素對試驗的干擾，結(jié)果表明 這些物質(zhì)的實際含量均低于允許量，因此可直接測定。
(6) 樣品分析(以收獲期的甜葉菊葉片干燥后，制備成粉末為例)準(zhǔn)確 稱取lOOg洗凈晾干的甜葉菊葉片，加入體積百分比濃度為80%丙酮500mL，超 聲震蕩30min并浸泡過夜，于低溫下抽濾后，量準(zhǔn)上清液體積，按二氧六環(huán)
丙酮抽-提液為l : 7的體積比例加入二氧六環(huán)，然后再按水丙酮抽提液為l : 6
的體積比例，在攪拌的情況下逐滴加入蒸餾水，直到出現(xiàn)沉淀，放在-2(TC水箱 靜置30min，并以1500 xg離心5min,得到深藍(lán)黑色的粉末狀葉綠素a和葉綠 素b的混合物沉淀，將沉淀溶于60mL無水乙醇，抽濾，除去難溶物，低溫冷 凍減壓干燥成粉，再溶于30mL體積百分比濃度為80°/。丙酮，測定時取出lmL再 定容至100mL作為樣品溶液，按實驗所述方法測定其含量。測得樣品溶液濃度 為7. 93mg/L， RSD %為1. 1 % (6次重復(fù))，計算出從100g的甜葉菊葉片中提取 出葉綠素a為23. 8mg。同時進(jìn)行加標(biāo)回收率試—瞼，測得回收率為97. 63%~ 98.32%，表明該方法準(zhǔn)確可靠，粉劑中的共存組份對測定無干擾。
(7) 該測定方法的驗證將葉綠素提取樣品稀釋成不同濃度，再將每種濃 度的溶液分為2份，分別用紫外分光光度法和該方法進(jìn)行測定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兩 種方法測定葉綠素a含量相符，證明可以用該方法測定葉綠素a的含量。
權(quán)利要求
1.一種用于檢測葉綠素a的化學(xué)發(fā)光方法，其特征在于具體步驟為(1)流動注射化學(xué)發(fā)光分析系統(tǒng)的流路反相流動注射化學(xué)發(fā)光分析系統(tǒng)的流路，R1、R2、R3三個管道分別泵入鐵氰化鉀、葉綠素a或空白作為檢測液以及魯米諾溶液；以檢測液與魯米諾溶液為載流，先經(jīng)三通管混合，待基線穩(wěn)定后，將鐵氰化鉀溶液注入到檢測液與魯米諾溶液充分反應(yīng)后的合并流中，鐵氰化鉀的進(jìn)樣時間為20s，分別記錄空白信號強度I0，樣品信號強度為Is，相對發(fā)光強度為ΔI＝Is-I0，增敏率用I％表示，I％＝(IS-I0)/I0×100，以I％進(jìn)行定量；(2)試驗參數(shù)的優(yōu)化以5mg/L的葉綠素a溶液為試驗對象，選擇NaOH、鐵氰化鉀和魯米諾為試驗因素，根據(jù)單因素實驗確定NaOH濃度為4.0×103mg/L～4.0×104mg/L即0.1mol/L～1mol/L，鐵氰化鉀濃度為3.2925mg/L～3.2925×102mg/L即1×10-5mol/L～1×10-3mol/L，魯米諾濃度為11.716×10-2mg/L～11.716mg/L即1×10-6mol/L～1×10-4mol/L；(3)鐵氰化鉀-魯米諾體系測定葉綠素a的流動注射-化學(xué)發(fā)光分析方法的建立①標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制為提高檢測精密度，在優(yōu)化后的最佳試驗因素水平條件下，以葉綠素a的濃度在0.5-10.0mg/L范圍繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；②最低檢測限的確定通過多次樣品空白試驗，求得其背景響應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)差，將三倍空白標(biāo)準(zhǔn)差作為檢測限的估計值；然后配制相應(yīng)檢測限濃度的樣品，實際測試來驗證方法的最低檢測限，最終測定結(jié)果為0.13mg/L；③精密度試驗對5mg/L的葉綠素a標(biāo)準(zhǔn)品溶液重復(fù)測定11次，計算其測定濃度的RSD為1.17％；④重復(fù)性試驗將1份5mg/L的葉綠素a標(biāo)準(zhǔn)品溶液分為6份，分別測定其濃度，計算其RSD為3.74％；⑤干擾試驗為了評價所建立分析方法的選擇性，在已優(yōu)化的試驗條件下，考察了葉綠素a提取液中可能共存的組份對葉綠素a含量測定的干擾；由于樣品經(jīng)過分離提純，所得葉綠素a提取液中可能共存的組分基本上只有少量的色素，據(jù)此，考察了葉綠素b、葉黃素和類胡蘿卜素對試驗的干擾，結(jié)果表明這些物質(zhì)的實際含量均低于允許量，因此可直接測定；⑥樣品分析準(zhǔn)確稱取50-100g洗凈晾干的植物葉片，加入體積百分比濃度為80％的丙酮500mL，超聲震蕩30min并浸泡過夜，于低溫下抽濾后，量準(zhǔn)上清液體積，按二氧六環(huán)∶丙酮抽提液為1∶7的體積比例加入二氧六環(huán)，然后再按水∶丙酮抽提液為1∶6的體積比例，在攪拌的情況下逐滴加入蒸餾水，直到出現(xiàn)沉淀，放在-20℃冰箱靜置30min，并以1500×g離心5min，得到深藍(lán)黑色的粉末狀葉綠素a和葉綠素b的混合物沉淀，將沉淀溶于60mL無水乙醇，抽濾，除去難溶物，低溫減壓干燥成粉后溶于30mL體積百分比濃度為80％的丙酮，測定時取出1mL再定容至100mL作為樣品溶液，按實驗所述方法測定其含量；測得樣品溶液濃度為7.93mg/L，RSD％為1.1％，重復(fù)6次，計算出從50-100g的植物葉片中提取出葉綠素a為23.8mg；同時進(jìn)行加標(biāo)回收率試驗，測得回收率為97.63％～98.32％，，共存組份對測定無干擾。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種利用鐵氰化鉀-魯米諾體系流動注射化學(xué)發(fā)光測定葉綠素a的分析方法。它包括流動注射化學(xué)發(fā)光分析系統(tǒng)試驗參數(shù)的優(yōu)化和鐵氰化鉀-魯米諾體系測定葉綠素a的方法建立等過程，利用該方法可以測定葉綠素a，不能測定葉綠素b。葉綠素a質(zhì)量濃度在0.5-10.0mg/L的范圍內(nèi)與增敏率呈良好的線性關(guān)系，其回歸方程為I＝23.244C-4.2218(R²＝0.9991)，方法的檢出限為0.13mg/L。對濃度為5.0mg/L的葉綠素a標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行了11次平行測定的精密度試驗和分為6份進(jìn)行測定的重復(fù)性試驗，其RSD分別為1.17％和3.74％。本發(fā)明可快速、靈敏地檢測葉綠素a。
文檔編號G01N21/76GK101493419SQ20091011390
公開日2009年7月29日 申請日期2009年3月6日 優(yōu)先權(quán)日2009年3月6日
發(fā)明者關(guān)錦毅, 李子院, 李海云, 丹 楊, 郝再彬 申請人:桂林工學(xué)院