0023] 實(shí)施例2 ;重組質(zhì)粒pGEX-5x-l-MrNV-CP在大腸桿菌中的表達(dá)
[0024] 將pGEX-5x-l-MrNV-CP重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌，次日挑選轉(zhuǎn)化平板上的單菌落于 含有50g/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，于37°C、200轉(zhuǎn)/分鐘進(jìn)行恒溫?fù)u床培養(yǎng)，當(dāng)大 腸桿菌的0D值達(dá)到0. 4-0. 6時，加入終濃度為Immol/L的IPTG，在25-37°C誘導(dǎo)4-8小時。 eOOOrpm離屯、lOmin，收集菌體。高壓破碎菌體，菌體破碎后的懸浮液經(jīng)4°C，12, 00化pm離 屯、lOmin，分別收集上清和沉淀。對收集的沉淀采用包涵體提純技術(shù)提取蛋白，具體操作步 驟如下：
[002引 （1)沉淀使用20血bufferA(50mMTris-肥l，5mM邸TA，pH8. 0)充分懸起，混勻， 4°C離屯、10,OOOiDm20min，去除上清；重復(fù)一次；
[0026] (2)沉淀使用 20mUxifferB巧OmMTris-肥l，5mMEDTA，2M脈，抑8. 0)充分懸起， 混勻，4°C冷凍離屯、10,000巧m20min，去除上清；重復(fù)一次；
[0027] (3)沉淀用1 %的曲拉通分別洗漆，4°C冷凍離屯、10, 000巧m20min，去除上清運(yùn) 復(fù)一次；
[002引（4)沉淀使用 20血bufferC(0. 1MTris-肥 1，lOmMDTT，8M脈，P服.0)充分懸起， 混勻，置于37°C恒溫?fù)u床上W200巧m快速震蕩比，4°C離屯、10,OOOiDmlOmin，保留上清，去 除沉淀；
[0029] (5)將上清裝入透析袋中，置于50倍體積透析液（0. 1MTris-肥l，5mM邸TA，5mM 切steins,P服.0)中，4°C透析16hW上；再置于上述透析液（1L)中4°C透析16hW上，4°C 冷凍離屯、10, 000巧mlOmin，保留上清，去除沉淀。然后采用SDS-PAGE檢測提取GST-CP重組 蛋白的濃度、純度W及重組蛋白的分子量，檢測結(jié)果顯示提取的重組蛋白的濃度可W達(dá)到5 毫克/毫升W上，純度達(dá)99%W上，重組蛋白的分子量為68kD。采用包涵體結(jié)合SDS-PAGE 方法提取重組蛋白的方法，可W快速獲得大量純化的重組蛋白，為后續(xù)制備卵黃抗體提供 便利。此外，由于GST分子量比較大（26kD)，比起其它融合小膚（比如化s-tag)具有更好 的免疫源性。
[0030] 實(shí)施例3 ;羅氏沼郵野田病毒卵黃抗體的制備
[0031] 1.抗原的制備；將重組蛋白與等體積佐劑充分乳化（充分乳化后將乳化產(chǎn)物置于 水中，看其是否散開，不散開該說明乳化充分），首次免疫注射由GST-MrNV-CP重組蛋白與 等體積完全弗氏佐劑乳化成的疫苗，第二次及第S次免疫注射由GST-MrNV-CP重組蛋白與 不完全弗氏佐劑乳化成的疫苗。
[0032] 2.免疫；選取健康母雞10羽，取1ml疫苗在母雞兩翅及兩側(cè)胸肌注射，每點(diǎn)注射 0.25ml，每2周免疫一次，具體的免疫程序見下表1，首免后即開始收集雞蛋，4°C保存?zhèn)溆茫?選取免疫前的雞蛋為陰性對照。
[0033] 表1免疫程序
[0034]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種羅氏沼蝦野田病毒衣殼蛋白卵黃抗體，其特征在于，由下述方法制備得到： (1) 通過RT-PCR方法克隆羅氏沼蝦野田病毒衣殼蛋白基因的cDNA，然后重組到谷胱甘 肽S-轉(zhuǎn)移酶融合基因表達(dá)載體pGEX-5x-l中，構(gòu)建成pGEX-5x-l-MrNV-CP重組質(zhì)粒，所述 pGEX-5x-l-MrNV-CP重組質(zhì)粒中含有谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶和羅氏沼蝦野田病毒衣殼蛋白的 融合基因； (2) 重組質(zhì)粒pGEX-5x-l-MrNV-CP在大腸桿菌中的表達(dá)：將pGEX-5x-l-MrNV-CP重組 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌，次日挑選轉(zhuǎn)化平板上的大腸桿菌單菌落于含有卡那霉素的培養(yǎng)基中擴(kuò) 大培養(yǎng)，利用IPTG誘導(dǎo)谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶和羅氏沼蝦野田病毒衣殼蛋白的融合基因在大 腸桿菌中表達(dá)；收集菌體，采用包涵體提純技術(shù)提取并純化得到GST-MrNV-CP重組蛋白； (3) 用GST-MrNV-CP重組蛋白免疫產(chǎn)蛋母雞，收集免疫母雞所產(chǎn)雞蛋，從所收集的雞蛋 中提取并純化卵黃抗體。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的羅氏沼蝦野田病毒衣殼蛋白卵黃抗體，其特征在于，所述 GST-MrNV-CP重組蛋白的分子量為66kDa~68kDa。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的羅氏沼蝦野田病毒衣殼蛋白卵黃抗體，其特征在于，所述 RT-PCR方法為：以羅氏沼蝦野田病毒為模板，將羅氏沼蝦野田病毒衣殼蛋白基因反轉(zhuǎn)錄成 第一鏈cDNA，再用特異性引物擴(kuò)增得到雙鏈DNA。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的羅氏沼蝦野田病毒衣殼蛋白卵黃抗體，其特征在于，所述 pGEX-5x-l-MrNV-CP重組質(zhì)粒的構(gòu)建方法為：將DNA和pGEX-5x-l載體分別進(jìn)行雙酶切， 再進(jìn)行連接反應(yīng)得到含有谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶和羅氏沼蝦野田病毒衣殼蛋白的融合基因的 pGEX-5x-l-MrNV-CP重組質(zhì)粒。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的羅氏沼蝦野田病毒衣殼蛋白卵黃抗體，其特征在于，所述重 組質(zhì)粒pGEX-5x-l-MrNV-CP在大腸桿菌中的表達(dá)為：pGEX-5x-l-MrNV-CP重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大 腸桿菌，次日挑選轉(zhuǎn)化平板上的單菌落于含有卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，于37°C、200轉(zhuǎn) /分鐘進(jìn)行恒溫?fù)u床培養(yǎng)，當(dāng)大腸桿菌的OD值達(dá)到0. 4~0. 6時，加入終濃度為Immol/L的 IPTG，在 25~37°C誘導(dǎo) 4~8 小時。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的羅氏沼蝦野田病毒衣殼蛋白卵黃抗體，其特征在于，所述免 疫為兩翅及兩側(cè)胸肌注射。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的羅氏沼蝦野田病毒衣殼蛋白卵黃抗體，其特征在于，所述免 疫的次數(shù)為3次，每次免疫的時間間隔為2周。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的羅氏沼蝦野田病毒衣殼蛋白卵黃抗體，其特征在于，所述免 疫方式為：首次免疫注射由GST-MrNV-CP重組蛋白與等體積完全弗氏佐劑乳化成的疫苗， 第二次及第三次免疫注射由GST-MrNV-CP重組蛋白與不完全弗氏佐劑乳化成的疫苗。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的羅氏沼蝦野田病毒衣殼蛋白卵黃抗體，其特征在于，步驟（3) 所述從雞蛋中提取并純化卵黃抗體的方法為：將所收集雞蛋的蛋清和蛋黃分離，取蛋黃，去 掉卵黃膜，然后加入滅菌蒸餾水，充分搖勻、置于4°C條件下過夜后，收集上清即為卵黃抗 體。
10. 權(quán)利要求1~9任一所述羅氏沼蝦野田病毒衣殼蛋白卵黃抗體在制備蝦用抗羅氏沼 蝦野田病毒疫苗制品中的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種羅氏沼蝦野田病毒衣殼蛋白卵黃抗體及其應(yīng)用。所述卵黃抗體由下述方法制備：將羅氏沼蝦野田病毒衣殼蛋白基因重組到GST融合基因表達(dá)載體pGEX-5x-1中，構(gòu)建成pGEX-5x-1-MrNV-CP重組質(zhì)粒；將pGEX-5x-1-MrNV-CP重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌并誘導(dǎo)融合基因表達(dá)；采用包涵體提純技術(shù)提取并純化得到GST-MrNV-CP重組蛋白；用GST-MrNV-CP重組蛋白免疫母雞，收集雞蛋并從雞蛋中提取卵黃抗體。本發(fā)明所制備的卵黃抗體能夠有效抑制羅氏沼蝦野田病毒，效價高，具有良好的免疫保護(hù)效力，可以在蝦類的蝦苗期，將其作為羅氏沼蝦野田病毒疫苗添加到羅氏沼蝦飼料中。
【IPC分類】C07K16-02, C07K16-10
【公開號】CN104725504
【申請?zhí)枴緾N201510150327
【發(fā)明人】林蠡, 伊麗竹, 秦真東, 周洋, 鄧俊杰, 譚銳敏
【申請人】華中農(nóng)業(yè)大學(xué), 深圳市鴻鵠科技發(fā)展有限公司
【公開日】2015年6月24日
【申請日】2015年3月31日