專利名稱：：兔出血病病毒(rhdv)重組衣殼和蛋的質(zhì)，含所述rhdv重組衣殼和蛋白質(zhì)的診斷藥盒和疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及用重組桿狀病毒系統(tǒng)，經(jīng)在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)而生產(chǎn)的為兔出血病病因的病毒(RHDV)的重組衣殼和蛋白質(zhì)。本發(fā)明還涉及含所述重組衣殼和蛋白質(zhì)的診斷藥盒和疫苗。早在1988年夏，在西班牙Asturias和Almeria-Murcia區(qū)的農(nóng)村兔養(yǎng)殖場，出現(xiàn)了一種奇怪的疾病，其中種畜，有時是成年兔在沒有任何明顯的臨床癥狀的情況下就死掉了。開始，由于它是急性的而將其歸因于毒性型疾病，或者因在病畜中檢測到抗粘液瘤病病毒抗體而歸因于粘液瘤病病毒。這兩種假設(shè)均被放棄了，結(jié)論是臨床癥狀與1984年首次在中國(江蘇省)報道并稱為“出血性兔疾病”或“感染性病毒肺炎”(Liu.S.J，等人，1984，An.Hus.Vet.Med.16(6)253-255)的傳染性疾病非常相近。根據(jù)Xu等人在1988年于匈牙利舉行的世界兔會議(4thWorldRabbitCongressW.R.S.A.，1988，3456-462)上展示的資料，這種疾病是由聯(lián)邦德國進(jìn)口的一批Angora兔傳入中國的。這個事實得出的結(jié)論是，這種病毒可能已在歐洲潛伏了很長時間了。歐洲第一例病毒性出血病病例是1986年在意大利檢查出來的，開始稱為“x疾病”(Cancelloti，F(xiàn).M.等人，1988，Coniglicoltura，25，941-46)。在1988到1989年之間，在法國、德國、和西班牙也報道了這種疾病(Villares，A，等人，1988，Med.Vet.，5645-650；Plana，J.等人，1989，Med.Vet.687-88)。這種病主要影響成年兔。年幼的未成熟兔和肥胖兔似乎自然受到保護(hù)。來自工業(yè)化農(nóng)場的動物似乎比在小型農(nóng)場中飼養(yǎng)的那些動物不易受這種病毒的影響。潛伏期為2-3天；死亡率在90％以上。臨床癥狀是抽搐、共濟(jì)失調(diào)，呼吸困難和隨著鼻出血而突然死亡。損傷的特征在于在不同器官—主要在肺中產(chǎn)生充血和瘀斑或出血區(qū)。在肝中檢測到不同的退化期，因為這里是病毒復(fù)制的靶器官。這種病的致病因子是被稱為兔出血病病毒的病毒。這種病毒首次同時在西班牙(Plana，J.等人，見上文；Parra，F(xiàn).andPrieto，M.，1990，J.Virology，644013-4015)和德國(Ohlinger，V.F.，等人，1990，J.Virology，643331-3336)分離出。RHDV的大小為40nm，未包被的，以單股RNA鏈為基因組材料。以形態(tài)學(xué)資料為基礎(chǔ)，開始將其分為微小RNA病毒(Pu，B.等人，1985，Chi.J.Vet.Med.1116-17)和細(xì)小病毒(Xu等人，4thWorldRabbitCongress，上文)。但根據(jù)相應(yīng)的病毒粒子大小、密度、形態(tài)學(xué)和分子結(jié)構(gòu)，已將其確定地分為萼狀病毒(calicivirus)。已在兩篇文獻(xiàn)中描述了德國RHDV分離物的分子特征和核苷酸序列a)Meyers，G，Wirblich，C，和THiel，H-J，1991，“RabbitHemorrhagicdiseasevirus.Molecularcloningandnucleotidesequencingofacalicivirusgenome”，Virology，184664-676。b)Meyers，G，Wirblich，C.，andThiel，H-J.，1991，“GenomicandsubgenomicRNAsofrabbithemorrhagicdiseasevirusarebothprotein-linkedandpackagedintoparticles”，Virology，184677-686。最近，克隆并定序了完整的RHDV基團(tuán)組(Meyers，G.等人，見上文)。RHDV基團(tuán)組由在3′末端含腺嘌呤殘基尾部(poly-A)的單鏈RNA分子組成?；鶊F(tuán)組的長度約800個核苷酸或堿基對(bp)；在其結(jié)構(gòu)中，它含有占病毒基因組89％的單一開放閱讀框架(ORF)。5′區(qū)編碼非結(jié)構(gòu)病毒蛋白，與由貓萼狀病毒(FCV)編碼的蛋白質(zhì)相比呈現(xiàn)出高度同源性。在此，已經(jīng)描述了與參予RNA合成之微小RNA病毒基因2C所述者相似的序列，與在含Cys殘基之蛋白酶中所呈現(xiàn)者相似的結(jié)構(gòu)，以及RNA依賴性RNA聚合酶。相反，該單一RHDVORF的3′區(qū)則編碼構(gòu)成病毒衣殼的結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)。由于其大小約60KDa，所以稱該區(qū)為VP60，并且從來自基因組RNA的長轉(zhuǎn)錄本和后加工，以及從2200pb亞基因組RNA的轉(zhuǎn)譯完成其合成。對RHDV，已描述了這兩種病毒RNA形式—其它RNA病毒的特征(Meyers，G.等人，見上文)，并認(rèn)為它們均存在于與15KDa蛋白質(zhì)相聯(lián)系并被包裹的病毒粒子中。對于制備抗RHDV引起之疾病的疫苗來說，一個主要的困難是只可能在體內(nèi)復(fù)制這種病毒。已描述了一些容許的細(xì)胞系統(tǒng)。具體地說，在我們的實驗室，我們已在兔腎RH-13細(xì)胞中增殖了病毒，不過病毒產(chǎn)率很低。這意味著，為了得到疾苗抗原，必需感染并殺死兔。本發(fā)明提供一種可替代的途徑以解決與傳統(tǒng)疫苗有關(guān)的不利方面。這種可供選擇的方法包括制備并使用能有效對抗RHDV感染的重組疫苗。新的重組疫苗可以含有由本發(fā)明提供的重組衣殼和/或蛋白質(zhì)。這些重組疫苗不需使用全病毒，而只需要其部分，從而排除病毒釋放事故造成的危險，得到一種明顯優(yōu)于傳統(tǒng)第一代疫苗的新疫苗。另一方面，用本發(fā)明的重組衣殼和/或蛋白質(zhì)已研制出一種用酶免疫檢測技術(shù)(ELISA)診斷RHDV的新方法。許多表達(dá)和生產(chǎn)重組蛋白質(zhì)的系統(tǒng)是已知的。大規(guī)模生產(chǎn)重組蛋白質(zhì)的一種最有效的系統(tǒng)是以在培養(yǎng)的昆蟲細(xì)胞中，復(fù)制衍生于Autographacalifornica核多角體病病毒(AcNPV)的重組桿狀病毒為基礎(chǔ)的。在桿狀病毒中表達(dá)技術(shù)的描述可參見下列文章和文獻(xiàn)a)Luckow.V.A.和Summer，M.D.，“Trendsinthedevelopmentofbaculovirusexpressionvectors”Bio/Technology，647-55(1988)。b)Bishop，D.H，L.，“Baculovirusexpressionvectors”，SeminarsinVIROLOGY，3253-264(1992)。本發(fā)明提供用在許可的宿主細(xì)胞上復(fù)制的適宜表達(dá)系統(tǒng)產(chǎn)生的RHDV重組衣殼和蛋白質(zhì)。在一個具體的例子中，本發(fā)明提供的重組衣殼和蛋白質(zhì)是通過用重組桿狀病毒系統(tǒng)在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)而產(chǎn)生的。能產(chǎn)生所述重組衣殼和蛋白質(zhì)的重組桿狀病毒，以及所用的轉(zhuǎn)移載體構(gòu)成本發(fā)明的另外兩個目的。獲得所述重組桿狀病毒和產(chǎn)物(衣殼和蛋白質(zhì))的方法也構(gòu)成本發(fā)明的一個目的。本發(fā)明還提供一種能保護(hù)兔免于RHDV感染的新疫苗，包含由本發(fā)明提供的重組衣殼和/或蛋白質(zhì)，以及適宜的載體或佐劑。另外，本發(fā)明提供能預(yù)防兔出血病和其他兔感染的二或多價疫苗，其含有由本發(fā)明提供的RHDV重組衣殼和/或蛋白質(zhì)，以及一種或多種兔病原體和適宜的載體或佐劑。本發(fā)明還提供檢測生物學(xué)樣品，如來自可疑被感染之兔血清中特異性識別RHDV之抗體存在的方法和診斷藥盒，其包括使用本發(fā)明提供的重組衣殼和/或蛋白質(zhì)，和適宜的檢測方法。本發(fā)明還提供一種檢測可疑被感染原兔生物學(xué)樣品，如血液、血清、肺、脾或肝中抗原(RHDV)存在的方法和診斷藥盒，其包括已借助本發(fā)明提供的重組衣殼和/或重組蛋白質(zhì)免疫動物而得到的、特異地識別RHDV的抗體和充分的檢測方法。圖1說明轉(zhuǎn)移載體pAcRHDV-710的構(gòu)建，指明將編碼RHDVVP60的基因插入質(zhì)粒pAcYM1中所進(jìn)行的操作。圖2列出了天然VP60基因[RHDV(VP60)]和經(jīng)修飾的基因[pRHD-7]結(jié)構(gòu)，顯示了兩者間存在的不同?？梢杂^察到，在這種特定情況下，經(jīng)修飾的基因含有一序列編碼(i)兩個氨基酸，不同于在天然VP60序列(位點(diǎn)+2和+3氨基酸)中存在者，其在重組蛋白質(zhì)中已被兩種其他氨基酸取代，和(ii)在天然VP60序列中沒有的，并源于編碼pMTL22質(zhì)粒多聚接頭之序列的5個附加氨酸。該圖還顯示了與重組pAcRHDV-710克隆中的多角體蛋白啟動子有關(guān)的，借助限制性核酸內(nèi)切酶酶切圖譜分析得知的經(jīng)修飾之基因的正確方向，其中可觀察到在位點(diǎn)BamHI和轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)之間的距離僅2個堿基。圖3顯示通過集聚本發(fā)明提供的一種RHDV重組蛋白質(zhì)而形成的病毒衣殼的制備(圖3a)以及純化之病毒顆粒的制備(圖3b)歷經(jīng)多年，我們實驗室完成了鑒定兔出血病病原因子(RHDV)的研究工作。這項研究的結(jié)果是，分離并描述了RHDV的特征(Plana等人，見上文)，開發(fā)并以商標(biāo)名“CYLAPHVD”上市了一種抗所述感染性疾病的常規(guī)疫苗。最近，已發(fā)表了我們的研究成果，分離并克隆了所述RHDV分離物的基因組，并研制出有效對抗RHDV感染的新重組疫苗。到此為止，已克隆了其基因組的一個片段—相當(dāng)于病毒基因組的3′末端，編碼稱為VP60的結(jié)構(gòu)病毒蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)可能與病毒的抗原性和免疫原性有關(guān)。本發(fā)明提供了在免疫原性和抗原性方面類似于天然RHDV和該病毒之天然VP60蛋白質(zhì)的RHDV重組衣殼和蛋白質(zhì)。為此，可以使用這些產(chǎn)物—重組衣殼和/或重組蛋白質(zhì)—制造能夠預(yù)防RHDV感染的疫苗，和適用于該病毒的診斷藥盒?？赏ㄟ^本發(fā)明提供的RHDV重組蛋白質(zhì)的聚集作用得到所述的重組衣殼。短語“抗原性類似于天然RADV和該病毒的天然VP60蛋白質(zhì)”或相似的表述在本發(fā)明的意義上應(yīng)是可以理解的，即是指重組衣殼和/或重組蛋白質(zhì)能夠以與天然RHDV和該病毒之天然VP60蛋白質(zhì)相同的誘導(dǎo)方式誘導(dǎo)產(chǎn)生抗體。短語“免疫原性上類似于天然RHDV和該病毒的天然VP60蛋白質(zhì)”或相似的表述在本發(fā)明描述所用的意義上應(yīng)是可以理解的，即是指重組衣殼和/或重組蛋白能誘導(dǎo)動物的免疫反應(yīng)以足以保護(hù)它抵御RHDV感染，由于該原因，前述的重組衣殼和/或重組蛋白質(zhì)適用于配制RHDV疫苗。使用常規(guī)的遺傳工程技術(shù)，可在適當(dāng)細(xì)胞上復(fù)制的適宜表達(dá)系統(tǒng)中，生產(chǎn)本發(fā)明提供的重組衣殼和蛋白質(zhì)。在本發(fā)明的一個具體實施方案中一作為可以完成的一種方式的詳細(xì)說明—克隆并表達(dá)重組蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)含有RHDV天然VP60蛋白質(zhì)的全部氨基酸序列，但不包括兩個位點(diǎn)+2和+3的氨基酸。在本說明書中，將該重組蛋白質(zhì)稱為“重組VP60”，“rVP60”或“修飾的VP60”。重組VP60蛋白質(zhì)含有帶下列修飾的RHDV天然VP60氨基酸序列(i)在重組VP60蛋白質(zhì)中，原天然VP60蛋白質(zhì)系列位點(diǎn)+2和+3氨基酸已被兩種其他氨基酸取代，和(ii)重組VP60蛋白質(zhì)包括在天然VP60蛋白質(zhì)序列中沒有的、位于氨基末端的5個附加氨基酸。所述5個附加氨基酸序列來源于編碼pMTL22質(zhì)粒多聚接頭的序列。這5個氨基酸是非功能性的，而且可替換地，可用另外相同或不同數(shù)目的類似序列取代所述的附加序列而不改變最終的結(jié)果。將在下文進(jìn)一步詳細(xì)描述的所述重組VP60蛋白質(zhì)的其他特征是a)已在于昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)物上復(fù)制的重組桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)中生產(chǎn)出來；b)令人驚異地是，它能形成與RHDV病毒衣殼類似的衣殼或多聚體結(jié)構(gòu)或蛋白質(zhì)聚集體；和c)重組VP60蛋白質(zhì)以及衣殼或它們可形成的蛋白質(zhì)聚集體與RHDV天然VP60蛋白質(zhì)及天然病毒有類似的免疫原性和抗原性，為此它們適于免疫兔使之對抗RHDV引起的感染，并可用以-配制有活性的，主動的、單、二或多價疫苗，所述疫苗能使兔抵御RHDV及其他兔病原體引起的感染；和-制備進(jìn)行下列檢測的診斷藥盒(i)特異性識別RHDV之抗體的存在，或(ii)借助特異性識別RHDV的抗體(所述抗體是經(jīng)用本發(fā)明提供的重組衣殼和蛋白質(zhì)免疫動物而得到的)檢測RHDV的存在。如下文的詳述的，在本發(fā)明的一個具體實施方案中，用在容許的宿主細(xì)胞培養(yǎng)物中增殖的重組桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)RHDV重組衣殼和蛋白質(zhì)，特別是稱為重組VP60的蛋白質(zhì)。得到上述重組VP60蛋白質(zhì)的完整方法包括下列幾大步驟I.制備將插入桿狀病毒中的cDNA序列；和II.得到表達(dá)重組蛋白質(zhì)的重組桿狀病毒。將這些總步驟分成其他一些分步驟。因此，制備將被插入之cDNA序列，包括以下分步驟I.a.分離并純化RHDV；I.b.分離其總病毒RNA；和I.c.從基因組RNA合成cDNA。得到表達(dá)RHDV重組VP60的重組桿狀病毒包括下列步驟II.a.制備編碼RHDVVP60的基因；II.b.將所述基因插入桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體中；II.c.用所述的轉(zhuǎn)移載體轉(zhuǎn)染允許的宿主細(xì)胞，所述載體含有編碼被插入之RHDVVP60的基因；和II.d.選擇表達(dá)所述重組VP60的重組桿狀病毒。然后完成重組桿狀病毒的特征鑒定以及所得重組蛋白質(zhì)的特征鑒定和純化。所有這些步驟將在下面進(jìn)一步詳細(xì)描述。按照實施例1中描述的方法，獲得RHDV重組衣殼和蛋白質(zhì)的步驟是從分離和純化RHDV開始的，即此情況下利用了我們實驗室得到的分離物。一旦分離并純化了病毒，就用SDS(十二烷基磺酸鈉)，鏈霉蛋白酶和蛋白酶K處理樣品并用苯酚氯仿提取(實施例2)以分離總病毒RNA。在0.7％的中性瓊脂糖凝膠上，經(jīng)用溴化乙錠染色分析得到的RNA，觀察到兩條主帶，其可能相當(dāng)于病毒的基因組和亞基因組RNA。將這些帶與己知大小的標(biāo)準(zhǔn)RNA進(jìn)行比較，推測一帶的大小為8kb。然后，利用存在poly(A)所帶來的優(yōu)點(diǎn)，建立用oligod(T)作為能被反轉(zhuǎn)錄酶延伸并合成cDNA分子之引物的戰(zhàn)略，使用商品試劑盒(BOEHRINGER)合成相當(dāng)于病毒RNA之3′末端的cDNA(實施例3)。計數(shù)合成的物質(zhì)中摻入的放射活性，并在堿性和中性瓊脂糖凝膠上電泳，以證實并定量確定cDNA合成。為了克隆cDNA，首先完成對合成之cDNA的大小選擇。選擇了三種大小的cDNA片段，即1,000到2,000bp間，2,000和5,000bp間，5,000bp以上。以平頭將純化的cDNA克隆到載體PMTL25中，用SmaI切成線性，并用堿性磷酸酶去磷酸化。用DNA連接酶連接插入片段和載體，并用其轉(zhuǎn)化E.coliXL-1Blue細(xì)胞，以完成以顏色為基礎(chǔ)的對重組菌落的初步篩選。以德國RHDV分離物的序列(Meyer等人，見上文)為基礎(chǔ)，經(jīng)質(zhì)粒DNA制備和用BamHI及EcoRI進(jìn)行限制性位點(diǎn)圖譜分析來分析陽性克隆。分析的38個質(zhì)粒中，只有10個是陽性的，相當(dāng)于RHDV的3′區(qū)，帶有在800到2000dp間的插入片段。其中，命名為pRHD-24，pRHD-25和pRHD-45的3個大小約2,000bp，因此更可能含有VP60結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)基因。由于這一原因，借助用于雙鏈質(zhì)粒的雙脫氧技術(shù)，測定它們的序列以確證真實性并確定插入?yún)^(qū)、方向和精確大小。使用通用寡核苷酸(5′GTAAAACGACGGCCAGT3′)和反向寡核苷酸(5′AACAGCTATGACCATG3′)。觀察到克隆pRHD-24和pRHD-25開始于核苷酸5313處(依照Meyers等人的序列，見上文)，而克隆pRHD-45開始于核苷酸5193處。前2個克隆終止在位于3′端的poly(A)尾部。按下列兩個戰(zhàn)略來鑒別VP60蛋白質(zhì)的起始密碼子(a)一種實驗性近似法，有意用自動蛋白質(zhì)測序儀直接測定N末端序列，和(b)用Microgenie計算機(jī)程序(BECKMANN)經(jīng)序列分析從理論上預(yù)測。從蛋白質(zhì)的直接定序，沒有得到實際結(jié)果，而通過模擬可能的轉(zhuǎn)錄本區(qū)域的大小，計算出VP60編碼序列開始于RHDV基因組的核苷酸5305處(作為以后的VP60表達(dá)實驗的參考)。為了得到表達(dá)RHDVVP60的重組桿狀病毒，采用下列步驟首先制備待插入的VP60基因。為此，選擇命名為pRHD-24的質(zhì)粒，該質(zhì)粒中cDNA插入片段開始于理論上的ATG起始密碼子的5bp以下，所以需加入一個能使表達(dá)開始的ATG。用BamHI部分消化，并再克隆于pMTL22載體的BglII位點(diǎn)，得到完整的pRHD-24插入片段，以致使插入片段的開放閱讀框架與屬于pMTL22靶NCOI序列的ATG一起保留在框架中。用NcoI和EcoRI消化所得到的構(gòu)建體以除去cDNA克隆的3′非克隆區(qū)，用E.coliDNA聚合酶I的klenow片段補(bǔ)平，并再克隆到用SmaI消化的PMTL25中，得到稱為pRHD-7的質(zhì)粒(圖1)。借助該構(gòu)建體，位于天然VP60之理論位點(diǎn)+2和+3位的原氨基酸丟失，天然VP60序列中的這兩個氨基酸(Glu和Ala)被重組VP60中的兩個其他氨基酸(Ser和Pro)取代。還產(chǎn)生了編碼5個氨基酸(Ala-Cys-Ile-Asp-Arg)的插入序列，該序列不存在于天然VP60蛋白質(zhì)序列中并且來源于質(zhì)粒pMTL22多接頭編碼序列。這5個氨基酸是非功能性的，并且可以用另一個有相同或不同數(shù)目的類似序列取代所述的附加序列而不改變最終結(jié)果。經(jīng)堿溶解純化所得的質(zhì)粒(pRHD-7)并用限制性內(nèi)切酶酶切圖譜法和測定插入?yún)^(qū)的序列來確定其特征。該質(zhì)粒被用于提取經(jīng)修飾的VP60。以后，將編碼修飾的VP60的基因插入適宜的轉(zhuǎn)移載體中—如pACYM1載體，其具有一個與多角體蛋白啟動子并列的BamHI位點(diǎn)。經(jīng)修飾的VP60基因在其序列中有一個BamHI限制性位點(diǎn)，因此，很難克隆所述的pAcYM1載體，因為必需進(jìn)行能提取完整插入片段的新的部分消化。為了從pRHD-7質(zhì)粒中分離VP60基因，試驗用BamHI進(jìn)行部分消化的時間。觀察到最適合的時間在15和30分鐘之間。通過在瓊脂糖凝膠中連續(xù)電泳(實施例5)，收集1.7kb帶并與已用BamHI消化和用堿性磷酸酶去磷酸化的質(zhì)粒pAcYM1相連接。用該連接混合物轉(zhuǎn)化E.coliDH5α細(xì)胞。用限制性內(nèi)切酶圖譜法選擇重組pAcRHDV-710和pAcRHDV-709質(zhì)粒(轉(zhuǎn)移載體)。測定兩質(zhì)粒的序列以確定與多角體蛋白啟動子有關(guān)的適宜插入方向。觀察到，在BamHI位點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)之間僅有2個堿基的距離。然后，用親本AcRP23-lacZ病毒純化的感染性DNA和相應(yīng)轉(zhuǎn)移載體的混合物轉(zhuǎn)染Spodopterafrugiperda細(xì)胞，sf9克隆。一旦完成共轉(zhuǎn)染，即可在用X-gal著染病毒子代后，用噬菌斑顏色表型檢測法鑒定重組桿狀病毒，并純化之該重組桿狀病毒，稱為AcNPVRHDV-710，已寄存了歐洲動物細(xì)胞培養(yǎng)物收集中心(ECACC)。實施例4到6詳細(xì)描述了表達(dá)RHDV修飾的VP60之重組桿狀病毒的獲得。已評價了重組桿狀病毒AcNPVRHDV-710和AcNPVRHDV-709在sf9細(xì)胞中的表達(dá)產(chǎn)物，并用SDS-PAGE凝膠電泳法和免疫印跡法充分鑒定了重組VP60的特征。用SDS-PAGE凝膠電泳，主要得到與純化的RHDV遷移位置相同的60KDa蛋白質(zhì)。還注意到重組蛋白質(zhì)主要保留在細(xì)胞溶解上清液中，這說明該蛋白質(zhì)是非常易溶的。如果凝膠電泳進(jìn)行一段足夠的時間，就可能觀察到，重組蛋白質(zhì)的游動性比病毒的游動性稍微低一些。這是由于5個附加氨基酸的碼內(nèi)融合而引起的。用免疫印跡法證明在凝膠中觀察到的蛋白質(zhì)相當(dāng)于RHDV天然VP60。為此，將凝膠轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，用脫脂奶粉封閉該帶，并使之面對多克隆抗RHDV兔血清(LaboratoriesSobrino)。結(jié)果是結(jié)論性的，卻因為多克隆抗RHDV兔血清識別由重組AcNPVRHDV-710桿狀病毒感染的細(xì)胞中和陽性對照細(xì)胞中的相同60KDa蛋白質(zhì)。但是，它不識別在未被感染的sf9提取物中的任何蛋白質(zhì)(實施例7.2)。以后對由AcNPVRHDV-710重組桿狀病毒表達(dá)的VP60蛋白質(zhì)的研究使問題更清楚，且令人驚異的是，該蛋白質(zhì)能形成與病毒衣殼相似的衣殼或多聚結(jié)構(gòu)或蛋白質(zhì)聚集體。為此，用電子顯微鏡檢查重組VP60制品并研究其血細(xì)胞凝集活性。按著實施例8中描述的方法，用低濃度硫酸銨沉淀得到重組衣殼，純度水平高達(dá)80％以上。重組VP60樣品的電子顯微鏡分析令人吃驚地顯示，存在結(jié)構(gòu)和形態(tài)上與病毒衣殼相似的蛋白聚集體(衣殼)。這些重組衣殼的大小與原病毒粒子(35-40nm)相似。同樣，可以觀察到在重組衣殼制品中，所有顆粒都是空的，即不合有基因組材料(圖3)。另一方面，用加在PBS中的1％人O型紅血細(xì)胞對重組衣殼進(jìn)行血細(xì)胞凝集試驗，結(jié)果呈現(xiàn)陽性。用ELISA技術(shù)，比較重組衣殼抗純化的RHDV的行為。按照實施例8.3描述的方法，觀察到抗RHDV血清同樣地識別重組表達(dá)產(chǎn)物(VP60或VP60衣殼)及純化的病毒。在未感染的sf9細(xì)胞提取物前沒有顯示出反應(yīng)性?；谒羞@些結(jié)果，可以得出肯定的結(jié)論表達(dá)產(chǎn)物(衣殼和重組VP60蛋白質(zhì))在抗原性上類似于天然RHDV和RHDV天然VP60蛋白質(zhì)。并且導(dǎo)入的序列并不改變蛋白質(zhì)形成多聚衣殼型結(jié)構(gòu)的固有能力?？蓪⒈景l(fā)明的重組衣殼和/或蛋白質(zhì)用于診斷目的，用于檢測特異性RHDV抗體的存在(實施例11)，并可使用以本發(fā)明重組衣殼和/或蛋白免疫動物而得到的特異性識別RHDV的抗體，來檢測是否存在抗原(RHDV)。另外，可使用上述重組衣殼和/或蛋白質(zhì)免疫兔以對抗RHDV。這樣可使之用于配制重組疫苗，以有效地保護(hù)兔免于遭受RHDV感染。這些疫苗可以是主動的或被動的?？蓪⑺龅闹亟M衣殼和/或蛋白質(zhì)懸浮在適當(dāng)?shù)淖魟┲?，以制備主動免疫疫苗。如果這些重組衣殼和/或蛋白是以凍干形式存在的，則可將其重新懸浮在免疫學(xué)上可接受的稀釋劑或佐劑中。被動疫苗—或更準(zhǔn)確地說，被動疫苗—可通過用所述重組衣殼和蛋白質(zhì)主性免疫動物，然后分離多克隆抗體而得到，后者一旦被分離和純化即可用作疫苗進(jìn)行接種治療。磷酸鹽緩沖鹽(PBS)溶液或其它相似的溶液是免疫學(xué)上可接受的稀釋劑。在配制疫苗中常用的任何佐劑均可用作重組衣殼和蛋白質(zhì)的佐劑，或稀釋劑。因此，這些佐劑可以是油狀的、以礦物油為基礎(chǔ)的、甘油和脂肪族醚—酸衍生物、合成的和含水佐劑，如氫氧化鋁、氧化鋁凝膠懸浮液，QuilA，MDP(胞壁酰二肽)，ISCOM(ImmunoStimulantComplex)或脂質(zhì)體。另外，本發(fā)明提供能預(yù)防兔病毒出血病及另一種感染或其他感染的二價或多價疫苗。這些疫苗含有本發(fā)明提供的重組衣殼和/或蛋白質(zhì)，并結(jié)合或聯(lián)合有一種或多種兔病原體和適宜的載體或佐劑。這些病原體是粘液瘤病病毒、Shope氏纖維瘤病毒，支氣管敗血性桿菌，以及巴斯德菌屬、梭狀芽孢桿菌屬、沙門菌屬、葡萄球菌屬、嗜血桿菌屬等的微生物種。本發(fā)明提供的疫菌可經(jīng)肌肉內(nèi)(IM)、皮下(SC)、皮內(nèi)(ID)和口服途徑用于動物。對于IM或SC給藥，疫苗可以是油型[簡單的(W/O)和(O/W)型或雙乳化(W/O/W)型]，水溶液或其他劑型，例如使用MDP，脂質(zhì)體或ISCOM的制劑。對于ID給藥，可以用任何常規(guī)給藥系統(tǒng)，較好用商標(biāo)為DERMOJETR的系統(tǒng)。對于口服給藥疫苗，可以含有或不含與抗原一起的含水佐劑。疫苗抗原(重組產(chǎn)物)的存在形式可以是含上述抗原之一的溶液或懸浮液形式。在這種存在形式中，可以使用稀釋劑或其他兔疫苗。也可以是凍干形式的，其中可將終產(chǎn)物與稀釋劑、佐劑或任何其他類型的含水或油狀疫苗重新配在一起應(yīng)用于兔。本發(fā)明提供的疫苗適用于保護(hù)野生的、農(nóng)場的和寵物兔抵御RHDV感染。下面將借助實施例進(jìn)一步詳細(xì)描述本發(fā)明。這些實施例涉及獲得上述重組VP60蛋白質(zhì)和其可形成的衣殼的方法，并涉及這兩種重組產(chǎn)物的疫苗和診斷應(yīng)用。本發(fā)明有的范圍不只限于本說明書中提到的重組衣殼和蛋白質(zhì)，或重組桿狀病毒，因為下文描述的實現(xiàn)僅僅是作為具體方式的舉例的說明性實施例，其中依據(jù)下列條件可以獲得本發(fā)明的以及任何其他的RHDV重組蛋白或衣殼a)功能等同于上述的那那些重組蛋白質(zhì)，即提供與天然蛋白質(zhì)或衣殼相同或相似的抗原和免疫反應(yīng)，而不必考慮它是否具有與天然VP60或其片段，或所述天然VP60的修飾序列相同的氨基酸序列，所述修飾序列包括幾個氨基酸的修飾及用其他一些氨基酸的取代，或者抗原性和免疫原性上等同的氨基酸序列，和b)借助遺傳工程技術(shù)在可以用的等同于昆蟲細(xì)胞中重組桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)的任何其他表達(dá)系統(tǒng)中得到的，并落在本發(fā)明范圍內(nèi)。實施例1.RHDV的獲得和純化1.1用RHDV感染兔1.1.1.動物使用的雜種兔由我們自己的飼養(yǎng)場飼養(yǎng)，年齡大約3個月，體重超過2千克。感染前，動物經(jīng)心臟穿刺法抽血，并使用血細(xì)胞凝集抑制(HAI)試驗分析血清，證實其不含抗RHDV抗體。簡單地說，HAI技術(shù)包括先處理血清以除去抑制血細(xì)胞凝集的成份。然后，將血清在56℃溫育30分鐘。每0.1ml血清中，加入0.4ml磷酸緩沖鹽水溶液(PBS)和0.5ml以25％懸浮于PBS中的高嶺土(SIGMA公司)懸濁液，室溫放置1小時，并不斷攪拌。一旦吸附完成，將樣品以200g離心10分鐘。向上清液中加入50μl人O型紅血細(xì)胞，懸液再按上述方法攪拌和離心。余下試驗在無菌的帶96個U形孔的微量試驗板中進(jìn)行。在50μl不同稀釋度的已處理血清中加入4HAu(血細(xì)胞凝集單位)的RHDV。平板在室溫下溫育30分鐘，隨后，加入50μl以1％懸浮于PBS中的人O型紅血細(xì)胞。反應(yīng)混合物在4℃下保溫，隨后在2至24小時間進(jìn)行監(jiān)測。1.1.2.感染使用的病原性RHDV分離物得自我們自己的實驗室(Plana，J.，eta1.，1988，Med.Vet.，6，87-88)。從該分離物(PV1-MSV1)開始，在兔體內(nèi)進(jìn)行三次傳代，在感染中以P3作為接種物。用0.5mlRHDV在鹽溶液中的懸液經(jīng)鼻內(nèi)感染兔(20,400HAu/動物)用對人O型紅血細(xì)胞進(jìn)行的血凝試驗法來滴定病毒。然后，將50μl以1％的濃度懸浮于PBS中的人O型紅血細(xì)胞懸液與50μl不同稀釋度的病毒PBS中的懸液混合。4℃保溫2至24小時，評價紅血細(xì)胞中是否存在凝集現(xiàn)象。1.1.3.肝臟的摘取感染的結(jié)果是，兔在感染后3到5天內(nèi)死亡(感染后的天數(shù)簡稱d.p.i.)。從死亡的動物體內(nèi)摘取肝臟和脾。將殘留的組織(脂肪，結(jié)締組織)和膽囊從肝臟上分離掉。最后，用鹽溶液(PBS)將它們沖洗并保存于4℃?zhèn)溆谩?.2RHDV的純化從感染了RHDV之兔的肝臟中純化病毒。將肝臟切碎，加入大約等體積的PBS。用超速勻漿的方法(2分鐘，10次循環(huán)，間隔期進(jìn)行冰浴)制備肝組織勻漿。然后將所得懸液在4℃以20,000g離心35分鐘以澄清之。所得的上清液在17％蔗糖的PBS溶液緩沖層上以113,000g4℃離心2小時，以純化和沉淀病毒。一旦去掉上清液，即將沉淀重懸于PBS中。然后，用1.1.2-三氯三氟乙醇(MERCK公司)提取病毒懸液(1∶1)。第二次用溶劑抽提含有病毒的水相，并在連續(xù)的蔗糖梯度溶液(15-30％w/v，溶于PBS)中以113,000g離心4小時以純化病毒。離心完成后，梯度自動被分離為幾個部分(大約1ml/部分)，用血凝試驗檢測病毒在不同部分中的存在(見實施例1.1.2)。相應(yīng)于兩個最大血球凝集峰的部分命名為峰-I和峰II，將它們混合，用TE緩沖液(Tris-HCl10mM，PH＝8.0和EDTA1mM)稀釋，最后以113,000g離心7小時得到病毒沉淀。在9％聚丙烯酰胺-SDS(十二烷基硫酸鈉)凝膠中電泳來分析純化的病毒(Laemmli，U.K.，Nature，227680，1970)。全部蛋白的檢測通過考馬斯藍(lán)染色和免疫印跡方法來完成(Towbin，H.，etal.，1979，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.764350-4354)。使用特異性抗RHDV血清和過氧化物酶-蛋白A結(jié)合物(SIGMA公司)顯現(xiàn)印跡。在經(jīng)過考馬斯藍(lán)染色的凝膠上，峰I和峰II樣品中一條大約為60KD的主帶被鑒定出來。隨后，證實它們與已描述過的RHDV結(jié)構(gòu)VP60蛋白質(zhì)的大小相符。除了這種蛋白外。經(jīng)考馬斯蘭染色觀察到一條大約40KDa的帶，在峰II處比峰I處更富集，這種蛋白也能與抗-RHDV血清發(fā)生反應(yīng)，這一事實表明它是60KDa蛋白質(zhì)的部分降解產(chǎn)物。實施例2病毒RNA的分離對病毒樣品的總RNA進(jìn)行純化，純化方法如實施例1.2所述。簡單地說，200μl峰-I樣品用1％SDS，0.5mg/ml蛋白酶K(SIGMA公司)和2mg/ml鏈霉蛋白酶(SIGMA公司)37℃處理30分鐘，使蛋白質(zhì)和RNase失活。然后，樣品用酚連續(xù)處理兩次，再用酚氯仿異戊醇抽提RNA，最后用加入1/10體積3M乙酸鈉、0.25mg/ml糖原和2.5體積乙醇沉淀之(-20℃，1小時)。這一段時間過后，4℃下以16,000g離心30分鐘得到RNA。棄去上清液，將NRA沉淀重新懸浮于40μlTE中。所得的RNA在0.7％中性瓊脂糖凝膠中電泳，溴化乙錠染色進(jìn)行分析。觀察到兩條主帶可能與病毒的基因組和亞基因組RNA相對應(yīng)。將這些帶與已知大小的RNA標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行比較可推導(dǎo)出其中一條帶大小為8kb。必須指出在這些凝膠中存在的低分子量物質(zhì)可能相當(dāng)于細(xì)胞DNA或RNA。實施例3.從RHDV總RNA合成cDNA3.1.cDNA的制備合成相應(yīng)于病毒RHDVRNA之3′端的cDNA。利用3′末端存在多聚A尾部的優(yōu)點(diǎn)，使用寡聚d(T)作為延展引物，使之在逆轉(zhuǎn)錄酶作用下延伸以合成DNA分子拷貝(cDNA)。cDNA的合成以一套商品試劑盒(BOEHRINGER公司)進(jìn)行并完成，所用方法簡述如下1μg按實施例2所述方法制得的RHDVRNA-polyA，在各1mMdATP、dCTP(5-10μci32p-α-dCTP)、dGTP、和dTTP，25RNA酶抑制單位、0.8μg5′端磷酸化的OligodCT)12以及40單位逆轉(zhuǎn)錄酶存在下，以最終體積20μl進(jìn)行保溫。反應(yīng)混合物在42℃保溫1小時，然后在同一試管中開始合成第二條鏈。隨后，加入緩沖液，RNA酶和25單位E.coliDNA多聚酶，22℃保溫1小時，再于65℃保溫10分鐘。最后，產(chǎn)生平頭末端，加入4單位DNAT4多聚酶，37℃保溫10分鐘后，加入EDTA(乙二胺四乙酸)和肌氨酸終止反應(yīng)。然后，按實施例2所述用酚氯仿異戊醇提取混合物，并用乙醇沉淀合成的材料。通過計數(shù)摻入所合成材料中的放射活性，并在堿性及中性瓊脂糖凝膠中電泳來證實和定量cDNA的合成。3.2cDNA的克隆首先，對合成的cDNA的大小進(jìn)行挑選以避免克隆過短的片段。為此經(jīng)以16,000g離心30分鐘，回收cDNA合成得到的材料。沉淀物經(jīng)真空干燥，溶解于TE緩沖液中，點(diǎn)樣于1％瓊脂糖凝膠中。分別挑選出三種大小的cDNA片段1,000至2,000bp；2,000至5,000bp；大于5,000bP。在所有情況下，均用DEAE纖維素濾紙從凝膠中回收用NaCl洗脫、然后沉淀所需材料。將純化的cDNA克隆到載體pMTL25(一種從PUC18中衍生的載體)的平端上。隨后，用SmaI將載體切成線性并用堿性磷酸酶處理以降低再連接的可能性。用DNAT4連接酶連接后，14℃過夜，轉(zhuǎn)化大腸桿菌XL-1Blue感受態(tài)細(xì)胞，其在X-gal(5-溴-4-吲哚-β-D-吡喃半乳糖苷)(BOEHRINGER)和IPTG(異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷)(GOLDBIOCH)存在條件下，允許根據(jù)顏色來初步挑選重組菌落(蘭色菌落沒有插入片段而白色菌落有插入片段)。根據(jù)德國RHDV分離物的序列(Meyersetal.，文獻(xiàn)同上)經(jīng)質(zhì)粒DNA制備(Birnboim和Doly，1979，NucleicAcidsRes.，71513-1523)和用BamHIYEcoRI酶進(jìn)行限制性酶切圖譜分析來鑒定陽性克隆。對38個質(zhì)粒樣品進(jìn)行分析(從三個相應(yīng)大小選擇cDNA及其克隆)，只有10個是陽性的，它們相當(dāng)于RHDV3′端，并在800至2,000bp間有插入序列。其中3個命名為pRHD-24，pRHD-25和pRHD45者大小約為2,000bp，因此很可能是含有VP60結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)基因，為證實其可靠性，確定插入?yún)^(qū)，其方向及精確大小，而對它們進(jìn)行了測序。為了達(dá)到測序目的，使用了應(yīng)用于雙鏈質(zhì)粒的雙脫氧鏈終止法(Sanger，F(xiàn).，etal，1977，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，745463-5467)，和通用(5′GTAAAACGACGGCCAGT3′)及反向(5′AACAGCTATGACCATG3′)寡聚核苷酸。測定經(jīng)分析之RHDV克隆的序列，證實克隆pRHD-24和pRHD-25始于5313位核苷酸(與Meyers等人的序列相對應(yīng)，文獻(xiàn)出處同上)，克隆pRHD-45則始于5193位核苷酸。這三個克隆都在位于3′端的poly(A)尾部終止。3.3.VP60蛋白質(zhì)起始密碼子的鑒定因為VP60蛋白包含于含有大部分病毒基因組的單個開放閱讀框架內(nèi)，故為了定位相應(yīng)于VP60基因的起始ATG而采取了兩種戰(zhàn)略。一種是通過實驗研究在自動蛋白序列儀上直接試測N-端序列；另一種辦法是借助計算機(jī)程序MICROGENIC(BECKMANN)經(jīng)序列分析進(jìn)行理論推測。因為不能獲得一個清楚的序列，所以蛋白質(zhì)的直接測序不能給出實際的結(jié)果。其原因可能是存在封閉蛋白質(zhì)氨基末端的結(jié)構(gòu)末端。另一方面，經(jīng)模擬可能的轉(zhuǎn)錄本區(qū)大小計算出VP60蛋白質(zhì)編碼序列起始在RHDV基因組核苷酸5305處(Meyeret.al.，文獻(xiàn)同上)。在繼后的rVP60表達(dá)實驗中，這一核苷酸用作參考。實施例4制備插入到轉(zhuǎn)移載體中的基因根據(jù)實施例3.3中確立的假設(shè)，選出起始點(diǎn)接近所述的ATG的cDNA克隆。沒有一個克隆剛好在ATG之前起始，因此，選出克隆pRHD-24。在這一克隆中，cDNA插入段開始可在理論起始密碼子ATG下游5bp處，因此需要加入一個ATG以使表達(dá)得以啟動。隨后的方法如下所述。質(zhì)粒pRHD-24的完整插入序列通過用BamHI部分消化而得到，鑒于存在另一個內(nèi)部BamHI位點(diǎn)，故再克隆于PMTL22載體的Bg1II位點(diǎn)，這樣，插入序列的開放閱讀框架即定位于帶有屬于pMTL22靶NcoI序列之ATG的碼內(nèi)。然后，這一結(jié)構(gòu)體經(jīng)用NcoI和EcoRI消化(除去cDNA克隆內(nèi)的非克隆3′區(qū))，用大腸桿菌DNA聚合酶I的Klenow片段處理(室溫處理15分鐘)，以轉(zhuǎn)化成平頭，最后，再克隆到用SmaI消化過的PMTL25中。所得到的質(zhì)粒定名為克隆pRHD-7(圖1)?？偟卣f來，具有這種結(jié)構(gòu)的質(zhì)粒，位于天然VP60理論上+2和+3位點(diǎn)的原始氨基酸丟失，導(dǎo)致這兩個氨基酸(Glu和Ala)被另外兩個氨基酸(Ser和Pro)取代而產(chǎn)生被修飾的VP60蛋白質(zhì)，并且插入了5個在天然VP60序列中不存在的、起源于pMTL22序列的氨基酸(Ala-Cys-Ile-Asp-Arg)所形成的質(zhì)粒被命名為pRHD-7，并用于提取修飾的VP60基因。實施例5在pAcYM1桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體中克隆載體pAcYM1(Matsuura等人，1987，J.Gen.Virol.，68，1233-1250)具有一與多角體啟動子相符的單個克隆位點(diǎn)，BamHI。由于修飾后的VP60基因在其序列中有一個BamHI限制性酶切位點(diǎn)，在所述的載體上進(jìn)行克隆較困難，因為需要進(jìn)行新的部分消化才能得以完整地提取插入段。pAcYM1與其他桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體相比具有一個優(yōu)點(diǎn)它不要求使用β-半乳糖苷酶作為標(biāo)記，因此所得到的表達(dá)產(chǎn)物只能由在多角體啟動子控制下的導(dǎo)入基因產(chǎn)生的—在此特定情況下，是重組VP60。為從pRHD-7克隆中分離VP60基因，試用BamHI部分消化不同的時間。在最初的研究中，試驗了0，1，2，5和10分鐘。由于沒有足夠的插入序列釋放出來，進(jìn)而試驗了更長時間1，2，5，10，15，20，25和30分鐘，每次消化產(chǎn)物取10％加在瓊脂糖凝膠上，以便觀察到最合適的消化時間。得出最合適的時間為15，20，25和30分鐘。將消化的余留部分加在1％的瓊脂糖凝膠上，一側(cè)為消化15和20分鐘，另一側(cè)為25和30分鐘，以便挑選出1.7kb的帶。用PIB-纖維素膜(SCHLEICHER和SCHUELL篩選出最高的帶(HB)和緊接著它下面的帶(LB)。按廠家說明書將DNA樣品從膜上洗脫下來。洗脫物用乙醇沉淀并重懸于30μl體積的TE溶液中。為了避免腸胃外的pMTL25載體底端可能的再連接，預(yù)先用ScaI總體消化。將這樣制備的材料加于1％瓊脂糖凝膠上。在洗脫的HB中再出現(xiàn)二條帶，相當(dāng)于HB和LB污染。再次提取較高的帶，并與經(jīng)BamHI消化的pAcYM1連接，并用堿性磷酸酶脫磷酸化。用該連接混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，通過限制性核酸內(nèi)切酶圖譜分析篩選出來重組的pAcRHDV-710和pAcRHDV-709克隆。使用雙脫氧鏈終止法(Sanger，1977，文獻(xiàn)同上)測兩者的序列(圖2)。以進(jìn)一步證實相應(yīng)于多角體啟動子來說插入片段的正確方向。BamHI位點(diǎn)與轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)間的距離僅2個堿基。實施例6.重組桿狀病毒的轉(zhuǎn)染和獲得按照Felgner的技術(shù)(Felgner等人，1987，Proc.Natl.Acad.Sci，USA，84，7413-7417)，用命名為pAcRHDV-710和pAcRHDV-709的轉(zhuǎn)移載體，分別與AcRP23-LacZ腸胃外桿狀病毒的DNA(由Posee博士I、V、E、M.，Oxford，UK提供)一起共轉(zhuǎn)染Spodopterafrugiperda昆蟲細(xì)胞Sf9。為了共轉(zhuǎn)染，使用2μg相應(yīng)于pAcRHDV-709或pAcRDHV-710的轉(zhuǎn)移載體加上500ng腸胃外病毒的混合物，并有l(wèi)ipofectin(GIBCO-BRL)的存在。將混合物加到培養(yǎng)有2.5×106個sf單層細(xì)胞的T25培養(yǎng)瓶(COSTAR)中。24小時后棄去轉(zhuǎn)染混合物，加入含有5％小牛血清的TNMFH培養(yǎng)基。細(xì)胞在27℃培養(yǎng)，7天后收集細(xì)胞培養(yǎng)物上清液和細(xì)胞余留物。使用感染的細(xì)胞培養(yǎng)上清液篩選表達(dá)重組VP60的重組桿狀病毒，在存在X-gal和中性紅存在下，通過連續(xù)地鋪板來進(jìn)行這一篩選。重組桿狀病毒產(chǎn)生白色的噬斑，野生型病毒則產(chǎn)生蘭色噬斑。將所得的重組桿狀病毒命名為AcNPVRHDV-710和AcNPVRHDV-709。重組桿狀病毒AcNPVRHDV-710于1994年5月18日保藏在歐洲動物細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心(ECACC)，保藏登記號為V94051819。實施例7對AcNPVRHDV-710和AcNPVRHDV-709在Sf9細(xì)胞中表達(dá)產(chǎn)量的評價，重組VP60的特征鑒定。7.1SDS-PAGE凝膠電泳Sf9細(xì)胞經(jīng)每種重組桿狀病毒感染，并在感染后的72小時收集。500g離心5分鐘收集細(xì)胞，用磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)pH7.4沖洗并以10×106個細(xì)胞/ml重懸于溶胞液(含5％SDS，1％β-疏基乙醇和17.4％甘油)中。在9％SDS-PAGE凝膠中分析前，提取物經(jīng)超聲處理而分成可溶部分和不溶部分。有峰-I純化的病毒和未感染的Sf9抽提取物的樣品同時上柱。凝膠用考馬斯藍(lán)染色。相應(yīng)于重組桿狀病毒的樣品，一種大約為60KDa的遷移位置與純化的病毒蛋白質(zhì)相似的蛋白質(zhì)，顯示是主要的蛋白質(zhì)。另外還觀察到，大多數(shù)重組蛋白質(zhì)保留在細(xì)胞溶解上清液中，這表明這種蛋白質(zhì)是很易溶的。如果凝膠電泳的時間足夠，可觀察到重組蛋白的游動性略低于病毒蛋白質(zhì)—這是因為它在閱讀框內(nèi)融合有5個額外的氨基酸。7.2免疫印跡分析進(jìn)行免疫印跡試驗以證實在凝膠中觀察到的蛋白質(zhì)是目的產(chǎn)物(RHDVrVP60)。按照以前建立的方案(Burnette等人，和Towbin等人，文獻(xiàn)同上)，凝膠在半干燥裝置(BIORAD)中轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。硝化纖維素帶用以3％溶于緩沖液(Tris-HCl20mMpH7.5，NaCl500mM[TBS])中的粉末脫脂乳(MOLICOR，Nestle)，室溫下封閉1小時。然后使之與按1∶100TBS-0.05％Tween-20中稀釋的多克隆抗RHDV兔血清，在室溫下混合2小時，然后，用含有0.05％Tween-20的TBS洗滌液洗30分鐘。與標(biāo)記有過氧化物酶的蛋白A(按1∶1,000在TBS-Tween-20中稀釋)一起保溫1小時，然后漂洗，并用4-氯-1-萘酚(SIGMA)、17％(V/V)甲醇和在TBS中的0.015％充氧水處理直到出現(xiàn)可見的帶。用蒸餾水終止反應(yīng)。試驗的結(jié)果是，多克隆抗-RHDV兔血清識別存在于感染了重組桿狀病毒AcNPVRHDV-710的細(xì)胞及陽性對照(峰I)中的同種60KDa蛋白質(zhì)。但不識別未感染的Sf9細(xì)胞提取物中的任何蛋白質(zhì)。出現(xiàn)在峰I和AcNPVRHDV-710提取物中的帶低于被血清識別的60KDa帶。對這條額外帶的存在可給出幾種解釋，但決不會影響終產(chǎn)物的質(zhì)量，例如已證明它們也出現(xiàn)在細(xì)小病毒中?？紤]到在得到的兩種重組桿狀病毒中AcNPVRHDV-710的產(chǎn)量較高這一事實，在隨后的所有實驗中，包括制備保藏于ECACC的最終接種物(實施例6)的實驗均選用這一克隆。實施例8分析基于RHDV重組VP60之空衣殼的形成為了分析重組AcNPVRHDV-710桿狀病毒表達(dá)的重組VP60蛋白質(zhì)是否能形成與病毒衣殼相似的多聚結(jié)構(gòu)，用電鏡檢查重組VP60制品并研究其血凝活性。用AcNPVRHDV-710以每細(xì)胞感染復(fù)數(shù)為1pfu(噬斑形成單位)感染Sf9細(xì)胞，然后在27℃培養(yǎng)72小時。按上所述離心收集細(xì)胞并用PBS洗滌，以2×107細(xì)胞/ml重懸于25mM碳酸氫鹽溶液(PH9.5)中以裂解細(xì)胞。裂解的細(xì)胞提取物以9,000g離心15分鐘，棄去細(xì)胞殘留物，并在標(biāo)準(zhǔn)條件下用30％硫酸銨沉淀上清液。由于硫酸銨百分濃度小，故可望多聚結(jié)構(gòu)發(fā)生沉淀。經(jīng)9％SDS-PAGE凝膠電泳分析估測樣品的純度。證實經(jīng)過一次簡單沉淀步驟后可得到的重組衣殼前體純度水平超過80％。8.1電鏡分析用電鏡分析半純化的重組VP60樣品，可見蛋白聚集體，其結(jié)構(gòu)和形態(tài)與病毒衣殼相似。圖3a顯示純化的衣殼制劑(增大64k倍)，圖3b顯示峰II純化的病毒粒子(增大79k倍)。重組衣殼前體的大小與原始的病毒粒子大小相似，估計約為35-40nm。在衣殼前體制劑中，觀察到所有的顆粒都是空的，而在病毒粒子制劑中則存在有兩種類型。8.2血凝試驗用1％人O型紅血細(xì)胞PBS懸液做血凝試驗，以檢測與實施例8.1中所用者相同的重組VP60樣品。得到的效價是VP6015,000HAu/50μlRHDV(峰I)390,750HAu/50μl然而，必須考慮到在VP60中的蛋白質(zhì)量比峰I中少5倍。8.3ELISA運(yùn)用ELISA技術(shù)，對照分析RHDV純化峰I前面之重組衣殼前體的行為。4℃條件下，以有不同抗原濃度的碳酸鹽緩沖液(pH9.6)做噬斑試驗(每孔500，100，20和4ng)。洗滌三次后，與稀釋度在1/100至1/12,500之間的三份兔血清混合，其中使用在1％PBS-MolicoR的稀釋因數(shù)5的稀釋液。37℃保溫2小時，洗滌3次，加入按1∶1,000以1％PBS-MolicoR稀釋的標(biāo)記有過氧化物酶的蛋白A，室溫保溫1小時。洗滌5次，使用ABTS[2，2′-連氮基-雙(3-乙基-苯并噻唑-6磺酸)]作底物顯色20分鐘。用1％SDS終止反應(yīng)。并監(jiān)測405nm處吸光率。估計ELISA試驗的最適抗原濃度范圍為每孔500和100ng。隨后，使用以2倍系列稀釋的0.35kg抗原/孔。測定血清的滴度，比較峰I和重組VP60。試驗條件與上面描述者相同。最好地區(qū)別陽性和陰性的血清稀釋度為1/200和1/400?？?RHDV血清等同地識別表達(dá)產(chǎn)物rVP60和純化的病毒，對未感染的Sf9細(xì)胞提取物未呈現(xiàn)反應(yīng)性?；谶@些結(jié)果，進(jìn)一步證實了表達(dá)產(chǎn)物(rVP60)在抗原性上是與RHDV天然VP60蛋白質(zhì)相似的，并且證實所導(dǎo)入的序列沒有改變重組蛋白形成多聚衣殼型結(jié)構(gòu)的固有能力。實施例9疫苗配制按下述程序?qū)⒁呙?能保護(hù)兔抵抗RHDV攻擊)制成油狀或氫氧化鋁/Quil-A乳膠的形式。用重組桿狀病毒AcNPV-RHD710以1pfu/細(xì)胞的感染復(fù)數(shù)(m.o.i)感染300mlSf9細(xì)胞懸浮培養(yǎng)物。感染后72小時收集細(xì)胞，然后按實施例7所述的方法進(jìn)行操作，直到最后一步，即用30％硫酸銨純化重組VP60蛋白質(zhì)。樣品用9％SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析，并用抗-RHDV血清做免疫印跡。觀察到一條分子量約為60KDa的主帶(＞80％)，以及與VP60一起純化的兩條較小的帶(43-60KDa)，但它們不是病毒特異性的(未被抗-RHDV血清檢測到)。用Lowry法和考馬斯蘭染色的SDS-凝膠電泳法測得制劑中重組VP60蛋白質(zhì)濃度為2mg/ml。A油狀疫苗按如下方法制備a)50％抗原相，由純化的重組VP60蛋白質(zhì)(rVP60)在PBS緩沖液中構(gòu)成；以及b)50％油相，由82.3％Marcol-82(ESSOESPANOLAS.A.)，6.5％Eumulgin-48(HENKEL)，10％Montanide-80(SEPIC)，1.2％苯甲醇(ELFATOCHEM/ATO)和0.1ml三乙醇胺(MERCK)組成。將抗原相緩慢加入油相中并持續(xù)攪拌，一旦抗原相完全加入后，再繼續(xù)攪拌10分鐘，并將疫苗貯存于4℃?zhèn)溆?。分別制備了五種不同的疫苗，其中各具有不同的重組抗原(rVP60)濃度并加有油狀抗原疫苗參考劑型rPV60蛋白濃度(μg/l-ml劑量)0.5W/O/W0.53W/O/W310W/O/W1025W/O/W2550W/O/W50B.另外，使用MunokyninR系統(tǒng)作佐劑(氫氧化鋁和Quil-A，AMERICANCYANAMID)制備其它疫苗。疫苗分別由兩個不同濃度的重組抗原rVP60)和MunokyninR佐劑制備而成。疫苗參考劑型rVP60蛋白濃度(μg/l-ml劑量)0.5W/W0.525W/W25實施例10.用疫苗對兔作實驗室水平的效力和安全性試驗。10.1動物使用新西蘭兔，年齡為45天，用HAI技術(shù)檢查無抗RHDV抗體(實施例1)。動物按兩只一組分配于籠中，以便每籠有兩只兔以相同疫苗抗原濃度接種疫苗。10.2接種和再接種試驗共使用39只兔，其中a)26只兔接種一劑1ml實施例9所述疫苗。接種后21天，再使用同樣的疫苗對它們進(jìn)行第二劑量的再接種，除了按疫苗指標(biāo)為3W/O/W外，用該疫苗進(jìn)行最初接種的4只兔中只有1只再次接種。b).作為陽性對照，用一劑LaboratoriosSobrino/Cyanamid商品疫苗“CYLAPHVDR”接種和再接種4只兔。c).剩下的9只兔作為“崗哨”或陰性對照，其中4只接種僅含油性佐劑(參考劑量W/O/W)的乳液，另外4只用僅含MunokyninR佐劑(參考劑型(W/W))的懸液接種，1只未接種。除了僅有2只兔接種的疫苗參考劑型0.5W/O/W外，每個劑量和每種疫苗按4只一組分配動物。每組2只動物經(jīng)肌肉內(nèi)(IM)途徑接種，另外2只經(jīng)皮下(SC)途徑接種，用疫苗0.5W/O/W的2只動物經(jīng)IM途徑接種。從接種開始到接種后35天期間，估測下列的參數(shù)A.用HAI技術(shù)檢查血清學(xué)反應(yīng)，動物在T0，T14，T21和T35時間時抽血。T0接種前抽血T14接種后第14天抽血T21接種后第21天抽血，與再接種的時間一致。T35接種后第35天，即再接種后第14天抽血。表1顯示在不同時間所作血凝抑制滴定的結(jié)果。表1與抵抗RHDV引起之疾病的重組疫苗的效力相對應(yīng)的兔血清HAI滴定試驗(1)肌肉內(nèi)途徑因感染死亡(2)皮下途徑*因抽血死亡ND未做除接種較低濃度重組抗原(如0.5μg)者外，不管是否使用佐劑，接種后14天的動物均可觀察到陽性血清學(xué)反應(yīng)。接種安慰劑的動物沒有出現(xiàn)可用HAI法檢測到的血清學(xué)反應(yīng)。相應(yīng)于在接種后第21天抽取的血清可見抗體滴度升高，即使那些接種較低濃度重組抗原的動物血清也開始檢測到抗體。再接種后至感染前，即使在以較低的重組抗原濃度接種的動物中也觀察到較高水平的抗體。從10μg的劑量開始，劑量的增加在血清學(xué)反應(yīng)方面觀察不到重大區(qū)別。B.注射位點(diǎn)的局部反應(yīng)在接種過程中，沒有觀察到動物有明顯的局部或全身型反應(yīng)。從上文A部分和B部分得到的結(jié)果證實，含有RHDV重組VP60蛋白質(zhì)的疫苗(除了作為一種安全疫苗外)所引起的兔血清轉(zhuǎn)化與天然病毒(CYLARHVDR)引起的血清轉(zhuǎn)化相似。10.3疫苗的效力接種36天后，所有兔用劑量為3.6×104LD50(致死量的50％)的RHHV進(jìn)行鼻腔內(nèi)感染，感染在安全的飼養(yǎng)室進(jìn)行。從感染時到感染后第14天(14d.p.i)，估測下面參數(shù)A.是否存在該疾病的特征性臨床癥狀，以及由該疫苗所提供的保護(hù)水平。在總共32只被感染的兔中—23只先前接種了重組抗原(rVP60)，3只接種了商品天然疫苗，剩下的6只接種了安慰劑(見表1)—僅有6只崗哨動物在感染后的第5天前死亡并表現(xiàn)出典型的兔出血疾病癥狀，而經(jīng)過疫苗接種的動物則能抵抗感染并在感染14天后仍存活，沒有出現(xiàn)這一疾病的明顯臨床癥狀(見表1)。這些動物在顯微鏡下觀察不到明顯的肺和肝臟損傷，在其肝臟里也檢測不到RHDV。必須指出的是，接種了3μg單一劑量重組抗原(rVP60)的兔(參考號4558，4559和4560)也能抵抗感染，這表明低劑量的重組抗原足以賦予抵抗疾病的保護(hù)作用。B.血清學(xué)反應(yīng)(HAI)動物在C0，C6，和C14時抽血C0攻擊前抽血C6攻擊后第6天抽血C14攻擊后第14天抽血接種疫苗動物的感染后的血清經(jīng)HAI滴定所得到的結(jié)果示于表1中。感染后第6天，抗RHDV抗體滴度與攻擊前滴度(T35/C0)非常相似，而在感染后第14天，滴度普遍較高而且更均勻。這種抗體滴度的增加是由于攻擊中所用病毒的強(qiáng)化效應(yīng)。C.攻擊后動物體內(nèi)是否存在病毒檢查攻擊中死亡之動物和感染后第14天處死之動物肝臟樣品中是否有RHDV存在。從每個疫苗組挑選2只觀察可能有肝臟損傷的動物(其中一只動物經(jīng)IM途徑接種，另一只經(jīng)SC途徑接種)，并收集肝臟樣品。兩種情況下均從這些樣品中分離到RHDV。為此，用超速勻漿器制備肝臟勻漿的PBS懸液(實施例1)。形成的懸液以1,600g離心30分鐘澄清之。用所得的上清液以血凝試驗檢測是否存在RHDV(實施例1)。如表2所示，在攻擊期間死亡的兔肝臟中檢測到RHDV(對照組或“崗哨”兔)，這一事實證實了引起死亡的原因。表2攻擊后，兔肝中RHDV的分離和滴定表2*血凝(HAU/50μl)**肝臟中存在球蟲表2顯示，只在一只對照動物(參考號，4579)中檢測到極低水平的病毒，這是因為在該動物的顯微觀察中發(fā)現(xiàn)有肝球蟲病。這可能由于部分肝實質(zhì)已被破壞，而導(dǎo)致RHDV的低復(fù)制率。對于接種過疫苗的動物，在感染后第14天被處死，其肝臟中檢測不到病毒。一只以最低濃度重組抗原接種過的兔(參考號4553)，由于感染后第6天抽血導(dǎo)致死亡，這正如在肝臟中未分離出RHDV這一事實所證明的(表2)。所得的結(jié)果證實含重組VP60蛋白質(zhì)的重組疫苗對兔出血病具有高免疫原性并且即使在較低劑量的情況下也能提供完全保護(hù)。疫苗經(jīng)肌肉或皮下途徑給藥沒有發(fā)現(xiàn)有明顯的區(qū)別。另外，重組疫苗能阻止的病毒擴(kuò)散，因有可能證實用病毒攻擊接種過疫苗之動物的靶器官(肝臟)中不再有RHDV復(fù)制。實施例11重組VP60蛋白在診斷方法和技術(shù)中的應(yīng)用如在實施例7.3中所提到的，重組VP60蛋白質(zhì)可用于檢測特異性的抗RHDV抗體。這一發(fā)現(xiàn)對于證實動物的感染和決定是否需要接種是有用的。所用的方法是在96圓底孔微量滴定板中做間接ELISA試驗。程序簡述如下各孔內(nèi)加入0.25μg重組抗原(rVP60)在碳酸鹽緩沖液(pH9.6)中的溶液做噬斑試驗，平板4℃下過夜。加入按合適的稀釋度以0.1％PBS-MolicoR稀釋的試驗血清，并于室溫保溫1小時。洗噬斑并使用ABTS作底物進(jìn)行顯色(實施例8.3)。在用重組疫苗測定兔血清的ELISA滴度及相應(yīng)的效力試驗中，可用抗RHDV抗體的檢測和定量程序作為例子。抗RHDV抗體的ELISA滴定結(jié)果如表3中所示。表3用ELISA檢測抗RHDV抗體</tables>(1)肌肉內(nèi)途徑死于感染(2)皮下途徑*死于放血一般說來，用HAI和ELISA測得的滴度之間相關(guān)性是很好的，盡管ELISA方法的靈敏度高10倍，其所得的滴度值高5-20倍。在4只兔(參考號.4597，4569，4572和4600)中用ELISA檢測到少許的抗體滴度，但用HAI則檢測不到，這一事實可能表明殘留有母體免疫，但其好象并不影響誘導(dǎo)抗體。這一結(jié)果提示即使存在母體抗體時，疫苗可能仍是有效的。實施例12.經(jīng)口服途徑接種疫苗—疫苗的效力和安全性試驗將疫苗(能保護(hù)兔不受RHDV的感染)按下述程序制備成水懸液的形式用重組桿狀病毒AcNPV-RHDV710以感染復(fù)數(shù)(m.o.i)為1pfu/細(xì)胞的劑量感染300mlSf9細(xì)胞懸浮培養(yǎng)物。感染后72小時收集細(xì)胞，按上面實施例7所述方法處理，直到最后一步以30％硫酸銨純化重組VP60蛋白質(zhì)。用9％SDS-聚丙烯酰胺凝膠對樣品作電泳分析并用抗RHDV血清做免疫印跡分析。觀察到一條分子量大約為60KDa的主帶(＞80％)以及兩條與VP60一起純化的小帶(43-60KDa)，但后者并不是病毒特異性的(用抗RHDV血清未檢測到)。用lowry法和SDS-凝膠分析及考馬斯藍(lán)染色測知制劑中重組VP60蛋白質(zhì)濃度為2mg/ml。A.疫苗按下面方法配制重組VP60蛋白質(zhì)用PBS(pH7.2)稀釋成1ml稀釋液(1劑量)含3μg重組VP60蛋白質(zhì)。該溶液用二等份的乙烯亞胺以終濃度5mM于37℃滅活72小時。B.另外，使用濃度為1ml劑量含3μg重組VP60，但未滅活的同一抗原溶液配制另一疫苗?！辉囈呙鐪缁畹囊呙缥礈缁畹囊呙纭獎游锸褂眯挛魈m兔，年齡為60天，以HAI技術(shù)估測其無抗RHDV抗體(實施例1)。將動物分配于籠中?！臃N和再接種試驗共用15只兔進(jìn)行，其中a)，5只兔接種每份1ml劑量的滅活疫苗。從開始接種后的第21天，用第二份劑量的同種疫苗進(jìn)行再接種[第15組，表4]。b)，5只兔用1劑量未滅活疫苗進(jìn)行接種和再接種[第16組，表4]。c)，5只兔留作“崗哨”或陰性對照，用PBS接種[第17組，表4]。疫苗經(jīng)過口服途徑給藥，以1ml的水相放入口內(nèi)。從開始接種到接種后35天間，估測下列參數(shù)A.用HAI技術(shù)測血清學(xué)反應(yīng)動物在T-4，T21和T35，T43天抽血。T-4接種前4天抽血，T21接種后21天抽血，與再接種時間一致，T35接種后35天即再接種后第14天抽血，T43接種后43天即再接種后第22天抽血。表4列出了在不同時間血凝抑制滴度的結(jié)果。表4與重組疫苗對抗RHDV引起之疾病的效力試驗(口服接種)相對應(yīng)的兔血清的HAI滴度死于放血死于感染Y是Neg陰性接種后第21天，觀察到用滅活疫苗接種的5只動物中有3只(參考號401，413和411)血清學(xué)反應(yīng)呈陽性。用未滅活疫苗接種的動物中，只有一只(第415號)發(fā)生血清轉(zhuǎn)化。B.全身反應(yīng)接種期間，在兔子中觀察不到明顯的局部或全身反應(yīng)。表4所得的結(jié)果證實含有RHDV重組VP60蛋白質(zhì)的疫苗可導(dǎo)致兔的血清轉(zhuǎn)化，但其效力比經(jīng)皮下途徑給藥的效力低?！呙绲男Я臃N后35天，所有兔均以3.6×104LD50(致死劑量的50％)的RHDV進(jìn)行鼻腔內(nèi)感染。攻擊在安全保障條件下。從感染時到感染后第8天，測定下面參數(shù)A是否存在該疾病特征性的臨床癥狀，以及該疾苗所提供的保護(hù)水平在15只感染的兔中，5只接種過滅活的重組抗原(rVP60)，5只接種未滅活的重組抗原，剩下的5只接種的安慰劑(表4)。對于崗哨動物，100％在感染后第8天前死亡，表現(xiàn)出兔出血病的典型癥狀。用未滅活抗原接種的動物，4只中有3只死亡，在5只用滅活疫苗接種的動物中，有1只死亡。B.攻擊后在動物體內(nèi)是否存在病毒從在感染后8天前死亡以及感染后第8天處死的動物中獲得肝臟樣品，按照實施例1所提到的方法，檢測和定量RHDV的存在。由表4中可以看出，處死動物的肝臟中RHDV的濃度實際上為0(相應(yīng)于接種過疫苗的動物)，而感染后8天前死亡的動物肝臟中，則檢測到高濃度的RHDV。因此，這些疫苗與IM及SC疫苗(實施例9和10)一樣，不僅阻止臨床癥狀的發(fā)生，而且能避免RHDV在所分析器官(肝臟)中復(fù)制。所得結(jié)果證實含有滅活重組VP60蛋白質(zhì)的重組疫苗具有免疫原性并且經(jīng)口服途徑接種后能對兔出血病提供保護(hù)。微生物的保藏命名為AcNPVRHDV-710的重組桿狀病毒于1994年5月18日保藏在歐洲動物細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心(EuropeanCollectionofAnimalCellCulture，ECACC)，PortonDown，Salisbury，WhiltshireSP4OJG，UnitedKingdom′，保藏號為V94051819。保藏的目的并不是使本發(fā)明的范圍受到已保藏的重組桿狀病毒的限制，因為有效的保藏物只是便于作為一種重組桿狀病毒的解釋例，適用于理解本發(fā)明，而且任何其他在功能上可能等同于已保藏之桿狀病毒的重組體(微生物，細(xì)胞系)也應(yīng)在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。權(quán)利要求1.兔出血病病毒(RHDV)衣殼。2.可經(jīng)RHDV重組蛋白質(zhì)的聚集作用得到的兔出血病病毒(RHDV)衣殼。3.根據(jù)權(quán)利要求2的衣殼，其特征在于它們是由RHDV重組VP60蛋白質(zhì)的單體聚集而成的，所述重組VP60蛋白質(zhì)在功能上等同于RHDV天然VP60蛋白質(zhì)或所述蛋白質(zhì)的一個片段。4.根據(jù)權(quán)利要求3的衣殼，其特征在于所述重組蛋白質(zhì)具有與RHDV天然蛋白質(zhì)的氨基酸序列或所述蛋白質(zhì)一個片段相同的氨基酸序列，或者其特征在于它具有抗原性和免疫原性上相等的氨基酸序列。5.根據(jù)權(quán)利要求2至4中任一項的衣殼，其可利用低濃度硫酸銨沉淀重組桿狀病毒的表達(dá)產(chǎn)物而得到，所述重組桿狀病毒在昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)物上復(fù)制后表達(dá)RHDV重組蛋白質(zhì)。6.根據(jù)權(quán)利要求2至5中的任一項的衣殼，其特征在于經(jīng)電子顯微鏡檢測確定的其大小為35到40nm。7.根據(jù)權(quán)利要求2至6中任一項的衣殼，其特征在于它們不含任何基因組材料。8.根據(jù)權(quán)利要求2至7中任一項的衣殼，其特征在于具有血細(xì)胞凝集活性并被抗RHDV血清識別。9.根據(jù)權(quán)利要求2至8中任一項的衣殼，其特征在于它們在抗原性和免疫原性上與天然RHDV類似。10.根據(jù)權(quán)利要求2至9中任一項的衣殼，其特征在于它們可經(jīng)聚集含有RHDV天然VP60蛋白質(zhì)之氨基酸序列的RHDV重組蛋白質(zhì)而得到，重組蛋白序列有以下修飾(i)在重組蛋白質(zhì)中，原天然VP60序列的位點(diǎn)+2和+3氨基酸已被兩種其他氨基酸取代，并且(ii)重組蛋白質(zhì)包括一個位于氨基末端的在天然VP60序列中沒有的附加氨基酸序列。11.根據(jù)權(quán)利要求10的衣殼，其特征在于定位于氨基末端的所述附加氨基酸序列是下列序列Ala-Cys-Ile-Asp-Arg或其他任何氨基酸數(shù)相同或較少的功能等同的類似序列。12.兔出血病病毒(RHDV)重組VP60蛋白質(zhì)。13.兔出血病病毒(RHDV)重組VP60蛋白質(zhì)，其特征在于它在功能上等同于RHDV天然VP60蛋白質(zhì)或所述蛋白質(zhì)的一個片段。14.根據(jù)權(quán)利要求13的重組VP60蛋白質(zhì)，其特征在于它具有與RHDV天然VP60蛋白質(zhì)的氨基酸序列，或所述蛋白質(zhì)的一個片段相同的氨基酸序列，或在于具有抗原性和免疫原性上等同的氨基酸的序列。15.根據(jù)權(quán)利要求13或14的重組VP60蛋白質(zhì)，其特征在于它能形成與病毒衣殼相似的衣殼。16.根據(jù)權(quán)利要求13到15中任一項的重組VP60蛋白質(zhì)，其特征在于它在抗原性和免疫原性上類似于RHND天然VP60蛋白質(zhì)。17.兔出血病病毒(RHDV)重組VP60蛋白質(zhì)，其特征在于它可通過用重組桿狀病毒系統(tǒng)在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)而得到。18.兔出血病病毒(RHDV)重組VP60蛋白質(zhì)，其特征在于它含有RHDV天然VP60的氨基酸序列，并有下列修飾(i)在重組蛋白質(zhì)中，天然VP60蛋白質(zhì)的原序列的位點(diǎn)+2和+3氨基酸已被兩種其他氨基酸取代，并且(ii)重組蛋白質(zhì)包括一個位于氨基末端，在天然VP60序列中設(shè)有的附加氨基酸序列。19.根據(jù)權(quán)利要求18的重組VP60蛋白質(zhì)，其特征在于位于氨基末端的所述附加氨基酸序列是下列序列Ala-Cys-Ile-ASp-Arg或者氨基酸數(shù)相同或較少的任何其他功能上等同的類似序列。20.根據(jù)權(quán)利要求18或19的重組VP60蛋白質(zhì)，其特征在于它能形成與病毒衣殼相似的衣殼。21.根據(jù)權(quán)利要求18至20中任一項的重組VP60蛋白質(zhì)，其特征在于它在抗原性和免疫原性上與RHDV天然VP60蛋白質(zhì)類似。22.一種適用于接種并保護(hù)兔抵御兔出血病病毒(RHD)的疫苗，其含有(i)免疫適宜量的i.a)如權(quán)利要求1至11中的任一項限定的衣殼，或i.b)如權(quán)利要求12至21中的任一項限定的RHDV重組蛋白質(zhì)；和ii)適宜的載體或佐劑。23.根據(jù)權(quán)利要求22的疫苗，其特征在于所述佐劑是基于礦物油、甘油和脂肪醚-酸衍生物的油性佐劑。24.根據(jù)權(quán)利要求22或23的疫苗，其特征在于所述疫苗的形式是簡單乳劑[(W/O)，(O/W)]或雙重乳劑(W/O/W)。25.根據(jù)權(quán)利要求22的疫苗，其特征在于所述佐劑是合成佐劑。26.根據(jù)權(quán)利要求22的疫苗，其特征在于所述佐劑是含水佐劑，如氫氧化鋁、氧化鋁凝膠懸浮液，QuilA和其混合物。27.根據(jù)權(quán)利要求22的疫苗，其特征在于所述佐劑選自MDP(胞壁?；?，ISCOM(ImmunoStimulantComplex)或脂質(zhì)體。28.根據(jù)權(quán)利要求22至27中任一項的疫苗，其特征在于它適于經(jīng)肌肉內(nèi)，皮下，皮內(nèi)或口服途徑給藥。29.根據(jù)權(quán)利要求22至28的任一項的疫苗，其特征在于疫苗抗原與佐劑或稀釋劑一起以溶液或懸浮液的形式存在。30.根據(jù)權(quán)利要求22的疫苗，其特征在于它以其后可用稀釋劑、佐劑重新配制的凍干形式或其它含水或油狀兔疫苗形式存在。31.根據(jù)權(quán)利要求22至30中任一項的疫苗，其特征在于它適用于保護(hù)野生兔、農(nóng)場兔和寵物兔抵抗RHDV。32.根據(jù)權(quán)利要求22至31任一項的疫苗，其特征在于即使存在母體抗體的情況下，也是有效的。33.根據(jù)權(quán)利要求22至32中任一項的疫苗，其特征在于它阻止RHDV在接種過疫苗的，并且在此后受所述病毒攻擊的動物體內(nèi)復(fù)制。34.能預(yù)防兔的兔出血病和另一種感染或其他兔感染的二價或多價疫苗，其特征在于它含有i)按照權(quán)利要求1至11中任一項限定的衣殼，或如利要求12至21中的任一項限定的RHDV重組蛋白質(zhì)；ii)一種或多種兔病原體，和iii)一種適宜的載體或佐劑。35.根據(jù)權(quán)利要求34的疫苗，其特征在于所述病原體選自粘液瘤病病毒，Shope氏病毒，支氣管敗血性桿菌，以及巴斯德菌屬、梭狀芽孢桿菌屬、沙門菌屬、葡萄球菌屬、嗜血桿菌屬等的微生物種。36.一種適用于接種并保護(hù)兔抵御兔出血病(RHD)的被動疫苗，其特征在于它含有用如權(quán)利要求1到11的任一項限定的衣殼，或如權(quán)利要求12到21中任一項限定的RHDV重組蛋白質(zhì)免疫動物所得到的抗體，以及適當(dāng)?shù)妮d體或佐劑。37.一種檢測來自兔的生物學(xué)樣品中是否存在特異性識別RHDV之抗體的診斷藥盒，其含有如權(quán)利要求1到11中任一項限定的衣殼，或如權(quán)利要求12到21中任一項限定的RHDV重組蛋白質(zhì)及適宜的檢測工具。38.一種檢測來自兔的生物學(xué)樣品中是否存在RHDV的診斷藥盒，其含有用如權(quán)利要求1到11中任一項限定的衣殼，或如權(quán)利要求12到21中任一項限定的RHDV重組蛋白質(zhì)免疫動物所得到的特異性識別RHDV的抗體，以及適宜的檢測工具。39.一種重組桿狀病毒，其特征在于它表達(dá)兔出血病病毒(RHDV)重組蛋白質(zhì)。40.一種重組桿狀病毒，其特征在于它表達(dá)通過聚集作用形成RHDV重組衣殼的兔出血病病毒(RHDV)重組蛋白質(zhì)。41.根據(jù)權(quán)利要求39或40的重組桿狀病毒，其命名為AcNPVRHDV-710，寄存于ECACC，保藏號為V94051819。42.一種適用于接種并保護(hù)兔抵御兔出血病(RHD)的疫苗，其含有(i)兔疫學(xué)上適宜量的i.a)如權(quán)利要求1到11中的任一項限定的衣殼；或i.b)如權(quán)利要求12到21中任一項限定的蛋白質(zhì)；以及ii)一種含水稀釋劑。43.根據(jù)權(quán)利要求42的疫苗，其中所述衣殼或蛋白是滅活的。44.根據(jù)權(quán)利要求42的疫苗，其中所述衣殼或蛋白是未被滅活的。45.根據(jù)權(quán)利要求42至44中任一項的疫苗，其經(jīng)口服途徑使用。46.權(quán)利要求12至21中任一項的重組蛋白質(zhì)，它與RHDV天然VP60蛋白質(zhì)至少有50％，優(yōu)選至少60％，優(yōu)選至少70％，優(yōu)選至少80％，優(yōu)選至少85％，優(yōu)選至少90％，優(yōu)選至少95％的氨基酸序列同源性。47.權(quán)利要求1至11中任一項的衣殼或權(quán)利要求12至21中任一項的蛋白質(zhì)用于預(yù)防和/或治療兔出血病(RHD)。48.權(quán)利要求1至11中任一項的衣殼或權(quán)利要求12至21中任一項的蛋白質(zhì)用于制造預(yù)防和/或治療兔出血病(RHD)的藥物。全文摘要已用在昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)物上復(fù)制的重組桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)了兔出血病病毒(RHDV)的重組衣殼和重組蛋白質(zhì)。這些重組衣殼和蛋白質(zhì)與RHDV天然VP60蛋白質(zhì)有類似的免疫原性和抗原性，并適用于配制能有效保護(hù)兔抵御RHDV感染的疫苗，以及用于制備診斷藥盒，所述診斷藥盒適用于檢測識別RHDV的抗體的存在和來自兔的生物學(xué)樣品中之RHDV的存在。本發(fā)明對于生產(chǎn)獸醫(yī)藥物是有價值的。文檔編號A61K39/00GK1134461SQ95115058公開日1996年10月30日申請日期1995年7月7日優(yōu)先權(quán)日1994年7月8日發(fā)明者J·普拉納·杜蘭,J·I·卡薩爾·阿爾瓦雷斯,I·克利門特·桑切斯,M·J·勒德里古茲·加西亞申請人:氨晴伊韋里卡公司