表達(dá)西尼羅熱病毒PrM/E蛋白的重組新城疫LaSota疫苗株的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明提供一種表達(dá)西巧羅熱病毒（West Nile virus, WNV)PrM/E蛋白的重組新 城疫病毒LaSota疫苗株及其應(yīng)用。具體而言，本發(fā)明提供表達(dá)西巧羅熱病毒PrM/E蛋白的 重組新城疫病毒LaSota疫苗株rLa-WNV-PrM/E (其保藏號(hào)為CGMCC No. 10199)及其在制備 用于預(yù)防西巧羅熱的疫苗中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 西巧羅病毒（West Nile Virus，WNV)是一種由庫(kù)蚊傳播的蟲媒病毒。WNV屬于黃 病毒科黃病毒屬，廣泛分布于非洲，歐洲西南部，俄羅斯，中東，印度W及澳大利亞。該病毒 于1999年傳入北美[1，2]。西巧羅病毒在血清學(xué)上屬于日本腦炎血清群，同群的病毒還有 圣路易斯腦炎病毒，墨累山谷腦炎病毒，日本腦炎病毒和昆津病毒。1998年W色列從發(fā)病的 鶴上分離到1系WNV病毒，其引起的臨床癥狀為腦炎和擁痕。1999年，紐約市發(fā)生WNV疫 情，分離得到的NY99株1系WNV病毒巧]。美國(guó)第一次WNV嚴(yán)重爆發(fā)發(fā)生在2003年，9000 人感染，死亡265人。第二次嚴(yán)重爆發(fā)發(fā)生在2012年，5387人感染，243人死亡。與2003 年爆發(fā)相比，2012年感染人群中呈現(xiàn)神經(jīng)癥狀的病例比例大幅上升。2012年西巧羅熱在意 大利，W色列，俄羅斯，塞爾維亞，突巧斯和希臘均有發(fā)生，總計(jì)167例[4]。
[0003] 西巧羅熱病毒宿主范圍較廣，能夠感染人，馬，狗，綿羊，羊駝等[5,6]，大部分動(dòng) 物呈隱形感染，極少數(shù)呈現(xiàn)臨床癥狀。大部分人感染西巧羅熱病毒只引起溫和癥狀或不典 型臨床癥狀，表現(xiàn)為高熱，皮疹，頭痛，肌肉酸疼等；少部分人發(fā)展成為嚴(yán)重的致死性神經(jīng)癥 狀，如腦炎，腦脊髓炎W及相關(guān)的并發(fā)癥，該病的潛伏期一般為3-12天[7,8]。鳥類，尤其是 烏鴉是WNV的重要儲(chǔ)存宿主，遷徙鳥類在病毒散播過(guò)程中起重要作用巧]。吸血節(jié)肢動(dòng)物如 蚊蟲、沙蛹、朦、壁風(fēng)等是西巧羅病毒的傳播媒介，庫(kù)蚊、伊蚊、按蚊等蚊蟲是該病的主要傳 播媒介，其中美洲大陸的尖音庫(kù)蚊是美洲主要的傳播媒介?，F(xiàn)已證實(shí)WNV在蚊蟲與鳥類中 循環(huán)。人類主要通過(guò)帶病毒的蚊蟲叮咬而感染西巧羅病毒巧]。
[0004] WNV基因組表達(dá)的多聚蛋白，被蛋白酶切割產(chǎn)生S個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白C，PrM和E蛋白W 及7個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白。C蛋白是是病毒核衣殼的主要成分。PrM是病毒細(xì)胞膜錯(cuò)定蛋白化及 病毒相關(guān)的M蛋白的前體蛋白。PrM蛋白駿基端含有一段跨膜區(qū)域，該區(qū)域可W協(xié)助PrM蛋 白與細(xì)胞膜結(jié)合，同時(shí)也可W作為E蛋白的信號(hào)膚，同時(shí)研究證實(shí)PrM蛋白與E蛋白的正確 折疊密切相關(guān)[10-12]。此外，PrM可W與E蛋白結(jié)合形成異源二聚體蛋白進(jìn)而組裝成未成 熟的病毒粒子[13]。當(dāng)病毒從細(xì)胞內(nèi)釋放時(shí)，位于高爾基復(fù)合體的furin蛋白酶W及其它 蛋白酶會(huì)將其切割成為成熟的M蛋白，從而形成成熟的病毒粒子[14]。WNV的E蛋白是其 最重要的結(jié)構(gòu)蛋白，其在病毒復(fù)制周期的多個(gè)環(huán)節(jié)起關(guān)鍵的作用，其功能包括受體結(jié)合、膜 融合、病毒組裝W及出芽釋放等。E蛋白是誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體的最主要結(jié)構(gòu)蛋白[15， 16]。E蛋白也能夠誘導(dǎo)具有免疫保護(hù)效力的CTL殺傷性T細(xì)胞免疫反應(yīng)[17]。
[0005] 西巧羅熱是一種重要的人獸共患病，我國(guó)目前尚未發(fā)現(xiàn)西巧羅病毒腦炎病例，沒(méi) 有分離到西巧羅病毒。近年來(lái)，隨著國(guó)際人員和物資流動(dòng)加快，感染者、帶毒畜禽和媒介蚊 蟲傳入我國(guó)的可能性日益增加。加之西巧羅病毒主要分布在北紳23.50° -南紳66. 50° 的溫帶地區(qū)，而我國(guó)大部分領(lǐng)±處在該一地區(qū)，并有適宜的鳥類宿主、易感動(dòng)物和媒介蚊蟲 分布，因此面臨著西巧羅病毒輸入和流行的威脅。由此，亟需開發(fā)出一種具有前瞻性和儲(chǔ)備 性、安全高效的西巧羅熱防控候選疫苗。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是開發(fā)一種具有前瞻性和儲(chǔ)備性、安全高效的西巧羅熱防控候選疫 苗。
[0007] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明人利用重組新城疫病毒反向遺傳操作系統(tǒng)，構(gòu)建了表達(dá) 西巧羅熱病毒PrM/E蛋白的重組新城疫病毒，實(shí)驗(yàn)表明該重組病毒在小鼠中安全有效，能 夠誘導(dǎo)高水平的中和抗體和E蛋白特異性CD4+和CD8+T細(xì)胞免疫反應(yīng)。研究結(jié)果表明該 重組病毒是優(yōu)秀的西巧羅熱儲(chǔ)備疫苗，對(duì)我國(guó)應(yīng)對(duì)該病的威脅具有重要戰(zhàn)略意義。
[0008] 因此，本發(fā)明提供一種表達(dá)西巧羅熱病毒（West Nile virus, WNV)PrM/E蛋白的 重組新城疫病毒LaSota疫苗株及其制備方法和應(yīng)用。具體而言，本發(fā)明提供表達(dá)西巧羅 熱病毒PrM/E蛋白的重組新城疫病毒LaSota疫苗株rLa-WNV-PrM/E (其保藏號(hào)為CGMCC No. 10199)及其在制備用于預(yù)防西巧羅熱的疫苗中的應(yīng)用。
[0009] 具體地，本發(fā)明成功構(gòu)建了表達(dá)西巧羅熱病毒PrM/E蛋白（SEQ ID No. 2)的重組 新城疫病毒LaSota疫苗株rLa-WNV-PrM/E，該疫苗株已于2014年12月12日保藏于中國(guó) 微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中屯、（CGMCC，中國(guó)北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3 號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，100101)，保藏號(hào)為CGMCC No. 10199,并在小鼠模型中系統(tǒng)評(píng) 價(jià)了所述重組病毒產(chǎn)生的體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)。
[0010] 本發(fā)明人采用新城疫病毒反向遺傳操作系統(tǒng)構(gòu)建了表達(dá)WNV PrM/E蛋白的重組病 毒新城疫病毒rLa-WNV-PrM/E。RT-PCR和間接免疫巧光實(shí)驗(yàn)檢測(cè)重組蛋白的表達(dá)；重組病 毒免疫小鼠，用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)巧LISA)和WNV瞻斑減少試驗(yàn)檢測(cè)重組病毒的體液免疫 水平；用流式細(xì)胞術(shù)評(píng)價(jià)重組病毒產(chǎn)生的特異性細(xì)胞免疫水平。結(jié)果顯示，該疫苗株能夠正 確表達(dá)PrM/E蛋白。將重組病毒兩次免疫巧7BL/6小鼠，ELISA結(jié)果表明免疫小鼠可產(chǎn)生 高水平的PrM/E蛋白特異性IgG ;中和試驗(yàn)結(jié)果顯示免疫小鼠可W產(chǎn)生高水平的WNV中和 抗體；流式細(xì)胞術(shù)表明免疫小鼠能夠產(chǎn)生WNV E蛋白表位特異性CD4+和CD8+T細(xì)胞免疫反 應(yīng)。
[0011] 本發(fā)明中所用的西巧羅熱病毒PrM/E基因通過(guò)對(duì)WNV NY99株的PrM/E基因 (Genbank登記號(hào)為DQ211652. 1)進(jìn)行哺乳動(dòng)物密碼子優(yōu)化后合成而得到的，優(yōu)化后的序列 為SEQ ID No. 1，其編碼的PrM/E蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示。
[0012] 本發(fā)明還提供表達(dá)西巧羅熱病毒PrM/E蛋白的重組新城疫病毒LaSota疫苗株 rLa-WNV-PrM/E在制備用于預(yù)防由西巧羅熱病毒引起的疾病的疫苗中的應(yīng)用。
[0013] 優(yōu)選地，本發(fā)明提供一種用于預(yù)防由西巧羅熱病毒引起的疾病的疫苗，其包含 有效量的本發(fā)明所述的表達(dá)西巧羅熱病毒PrM/E蛋白的重組新城疫病毒LaSota疫苗株 rLa-WNV-PrM/E。可W施用該疫苗進(jìn)行預(yù)防作用的受試者主要為哺乳動(dòng)物，例如，但不限于， 人、馬、狗、綿羊、羊駝、小鼠、大鼠等。
[0014] 由西巧羅熱病毒引起的疾病例如，但不限于，高熱，皮疹，頭痛，肌肉酸疼，嚴(yán)重者 如腦炎，腦脊髓炎w及相關(guān)的并發(fā)癥等。
[0015] 本發(fā)明還提供用于預(yù)防哺乳動(dòng)物中由西巧羅熱病毒引起的疾病的方法，所述方法 包括給所述哺乳動(dòng)物施用有效量的包含本發(fā)明的表達(dá)西巧羅熱病毒PrM/E蛋白的重組新 城疫病毒LaSota疫苗株rLa-WNV-PrM/E的疫苗。
[0016] 本發(fā)明所述的表達(dá)西巧羅熱病毒PrM/E蛋白的重組新城疫病毒LaSota疫苗株 rLa-WNV-PrM/E還可W與其他疫苗株進(jìn)行聯(lián)合免疫。
[0017] 綜上所述，本發(fā)明提供下述實(shí)施方案：
[001引 1. 一種表達(dá)西巧羅熱病毒（West Nile virus)PrM/E蛋白的重組新城疫病毒 LaSota疫苗株，其中所述PrM/E蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示。
[0019] 2.根據(jù)第1項(xiàng)所述的重組新城疫病毒LaSota疫苗株，其命名為rLa-WNV-PrM/E， 保藏號(hào)為 CGMCC No. 10199。
[0020] 3. -種用于預(yù)防哺乳動(dòng)物中由西巧羅熱病毒引起的疾病的疫苗，其包含有效量 的第1項(xiàng)或第2項(xiàng)所述的表達(dá)西巧羅熱病毒PrM/E蛋白的重組新城疫病毒LaSota疫苗株 rLa-WNV-PrM/Eo
[002U 4.根據(jù)第3項(xiàng)所述的疫化其中所述哺乳動(dòng)物選白人、馬、狗、綿羊、羊駝、小鼠或 大鼠。
[0022] 5.根據(jù)第4項(xiàng)所述的疫苗，其中所述哺乳動(dòng)物為人。
[0023] 6.根據(jù)第3項(xiàng)所述的疫苗，其中由所述西巧羅熱病毒引起的疾病選自由西巧羅熱 病毒引起的高熱、皮疹、頭痛、肌肉酸疼、腦炎、腦脊髓炎或相關(guān)的并發(fā)癥。
[0024] 7.第1項(xiàng)或第2項(xiàng)所述的表達(dá)