專(zhuān)利名稱(chēng)：抗乙型肝炎病毒x蛋白多肽藥物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及多肽藥物領(lǐng)域，具體涉及抗こ型肝炎病毒X蛋白的多肽和編碼此多肽的多核苷酸，以及它們的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
肝癌是導(dǎo)致病人死亡的惡性腫瘤之一，其惡性程度高，在我國(guó)肝癌死亡率僅次于胃癌，居我國(guó)惡性腫瘤死亡率第二位。據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國(guó)毎年新增肝癌人數(shù)30萬(wàn)人，而每年肝癌死亡人數(shù)達(dá)11萬(wàn)。こ型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染可導(dǎo)致肝炎、肝硬變和原 發(fā)性肝癌的發(fā)生，在我國(guó)80%以上的肝癌患者為こ肝感染后肝癌，可稱(chēng)之為こ肝后肝癌。HBV為長(zhǎng)約3. 2Kb的DNA病毒，其開(kāi)放閱讀框表達(dá)こ型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)、こ型肝炎病毒核心抗原(HBcAg)、こ型肝炎病毒多聚酶和こ型肝炎病毒X抗原(HBxAg)(或稱(chēng)之為こ型肝炎病毒X蛋白，即HBx)，其中HBx是HBV DNA復(fù)制所必須的因子。由于HBx是HBV DNA復(fù)制所必須的因子，因此抑制HBx的功能，意味著可抑制HBV的感染，以及由此導(dǎo)致的肝炎和肝硬變。另外，HBx作為反式作用因子，促進(jìn)肝癌的生長(zhǎng)和増殖，稱(chēng)之為癌蛋白。在分子水平、細(xì)胞水平和動(dòng)物水平的研究也發(fā)現(xiàn)，HBx具有很強(qiáng)的促肝癌細(xì)胞增殖和遷移的作用。轉(zhuǎn)基因鼠實(shí)驗(yàn)也證明HBx具有顯著的促進(jìn)肝癌發(fā)生的作用。大量研究結(jié)果顯示，HBV感染的持續(xù)存在可導(dǎo)致慢性肝病，包括慢性肝炎、慢性肝炎反復(fù)發(fā)作引起的肝組織中纖維結(jié)締組織增生后發(fā)生的肝硬變，及大部分在肝硬變基礎(chǔ)上發(fā)生的肝癌。在慢性肝病(包括肝炎、肝硬變和肝癌)的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，HBx發(fā)揮了重要的作用。因此，HBx是預(yù)防和治療肝病的重要靶點(diǎn)。目前，肝癌的治療以手術(shù)為主，輔以介入療法，而化療效果不理想。在臨床手術(shù)的肝癌組織中HBsAg和HBxAg的表達(dá)陽(yáng)性檢出率高達(dá)80%甚至90%以上。因此，HBx作為肝癌發(fā)生發(fā)展的重要致病因子，而發(fā)現(xiàn)其特異性抑制劑，則具有重要的理論意義和實(shí)際臨床應(yīng)用價(jià)值。然而，由于目前HBx的三維構(gòu)象解析尚未完成，故難以通過(guò)HBx立體三維構(gòu)象設(shè)計(jì)其化學(xué)抑制劑。多肽片段可作為藥物,其在臨床上已廣為應(yīng)用。例如，胸腺肽(thymopeptide)是從小牛胸腺中提取的胸腺五肽，具有促進(jìn)淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化、增強(qiáng)巨噬細(xì)胞吞噬活性的作用，可用于治療多種免疫缺陷病。多肽藥物的特點(diǎn)是藥理作用明確，安全性高，并易于生產(chǎn)。但是，多肽藥物的發(fā)現(xiàn)難度大，其原因在于大部分的多肽片段在體內(nèi)的半衰期短，直接影響藥效學(xué)作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及一種具有抑制こ型肝炎病毒X蛋白(hepatitis B virus X protein,HBx)功能活性的多肽，其在分子水平、細(xì)胞水平和動(dòng)物水平上具有抑制HBx的活性，因而能抑制こ型肝炎病毒感染所造成的肝炎，由肝炎反復(fù)發(fā)作引起的肝硬變，以及在肝硬變基礎(chǔ)上發(fā)生的肝癌。該多肽和它的肽模擬物，包括它們的功能片段和功能變體，以及編碼這些多肽、肽模擬物或它們的功能片段、功能變體的基因，可廣泛用于防治こ型肝炎感染后的肝病，包括肝炎、肝硬變和肝癌。一方面，本發(fā)明提供了分離的多肽或肽模擬物，其包含如SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列、或其功能片段或功能變體，所述多肽或肽模擬物具有抑制こ型肝炎病毒X蛋白的功能，井能抑制こ型肝炎病毒感染后的慢性肝病的發(fā)生和發(fā)展。所述こ肝病毒感染后的慢性肝病可以包括肝炎，由肝炎反復(fù)發(fā)作引起的肝硬變，以及在肝硬變基礎(chǔ)上發(fā)生的肝癌。在本發(fā)明的ー些具體實(shí)施例中，上述多肽或肽模擬物，其包含的氨基酸序列、其功能片段或功能變體可以具有與SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列至少70%，或者80%，或者90%，以及甚至更高的相同性。優(yōu)選地，這些多肽或肽模擬物包含如SEQ ID NOs :1-6中所示的任一種氨基酸序列。另ー方面，本發(fā)明提供分離的多核苷酸，所述多核苷酸包含編碼如SEQ ID N0:1所示的氨基酸序列、其功能片段或功能變體的多核苷酸；或者是與包含編碼如SEQ ID NO 1 所示的氨基酸序列、其功能片段或功能變體的多核苷酸互補(bǔ)或嚴(yán)格雜交的多核苷酸。優(yōu)選地，這些多核苷酸為編碼SEQ ID NOs :1-6所示的氨基酸序列的多核苷酸，或者為與編碼SEQID NOs :1_6所示的氨基酸序列的多核苷酸互補(bǔ)或嚴(yán)格雜交的多核苷酸。另ー方面，本發(fā)明還提供含有外源多核苷酸的重組表達(dá)載體，其包含編碼如SEQID NO :I所示的氨基酸序列、其功能片段或功能變體的多核苷酸；或者是與包含編碼如SEQID NO 1所示的氨基酸序列、其功能片段或功能變體的多核苷酸互補(bǔ)或嚴(yán)格雜交的多核苷酸。優(yōu)選地，這些重組表達(dá)載體權(quán)利包含編碼SEQ ID NOs :1-6所示的氨基酸序列的多核苷酸，或者包含與編碼SEQ ID NOs :1-6所示的氨基酸序列的多核苷酸互補(bǔ)或嚴(yán)格雜交的多核苷酸。本方明還提供包括上述重組表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。此外，本發(fā)明也提供包括上述多肽或肽模擬物、核苷酸以及重組表達(dá)載體在制造抗こ肝病毒感染后的慢性肝病的藥物中的應(yīng)用。在ー個(gè)具體實(shí)施例中，所述藥物可為こ肝的治療性疫苗。所述藥物可以包含藥物組合物，其可以包含任選的藥物載體。本發(fā)明中，所述的多肽(包括其功能片段或變體)及其肽模擬物，作為HBx的有效抑制因子，具有抑制HBx的生物活性的能力，能抑制こ型肝炎病毒感染所造成的肝炎，由此引發(fā)的肝硬變和在肝硬變基礎(chǔ)上發(fā)生的肝癌。值得強(qiáng)調(diào)的是，本發(fā)明提供的上述多肽具有明顯的藥效學(xué)作用，因此可以成為治療由于こ肝病毒感染所導(dǎo)致的肝病的有效藥物。


圖I :應(yīng)用高壓液相色譜(HPLC)對(duì)純化后人工合成多肽anti-HBxPl#的分析結(jié)
果O圖2.應(yīng)用報(bào)告基因檢測(cè)本發(fā)明的多肽基因質(zhì)粒對(duì)表達(dá)HBx蛋白的肝癌細(xì)胞的影響。結(jié)果顯示，p-Anti-HBxPl#對(duì)H印G2-X細(xì)胞、L-02-X細(xì)胞和H印G2. 2. 15細(xì)胞中NF-B啟動(dòng)子的活性具有抑制作用，呈劑量依賴(lài)性，而對(duì)無(wú)HBx的HepG2肝癌細(xì)胞和無(wú)HBx的L-02肝細(xì)胞無(wú)影響。相似地，p-Anti-HBxPI#的5種功能變體基因(O. 15μ g/well)對(duì)H印G2-X細(xì)胞和L-02-X細(xì)胞中NF-B啟動(dòng)子的活性具有一定的抑制作用。*P < O. 05廣P < O. 01，進(jìn)行Student’ s t test統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
圖3.檢測(cè)本發(fā)明的多肽在細(xì)胞水平對(duì)表達(dá)的HBx蛋白激活NF-B啟動(dòng)子的活性的影響。結(jié)果顯示，人工合成的多肽Anti-HBxPI#對(duì)表達(dá)HBx蛋白的H印G2-X細(xì)胞、L-02-X細(xì)胞和H印G2. 2. 15細(xì)胞中的NF-B啟動(dòng)子的活性具有抑制作用，且該抑制作用呈劑量依賴(lài)性，但對(duì)無(wú)HBx表達(dá)的H印G2肝癌細(xì)胞和L-02肝細(xì)胞則無(wú)此影響。乍< O. 05，**P < O. 01，進(jìn)行Student’ s t test統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。圖4.應(yīng)用MTT檢測(cè)轉(zhuǎn)染本發(fā)明的多肽基因質(zhì)粒對(duì)表達(dá)HBx蛋白的肝癌細(xì)胞的影響。結(jié)果顯示，p-Anti-HBxPI#對(duì)H印G2-X細(xì)胞、L-02-X細(xì)胞和H印G2. 2. 15細(xì)胞生長(zhǎng)和増殖具有抑制作用，且其效果呈劑量依賴(lài)性，但對(duì)無(wú)HBx表達(dá)的H印G2肝癌細(xì)胞和L-02肝細(xì)胞則無(wú)影響。p-Anti-HBxPl#的5種功能變體基因(O. 15 μ g/well)對(duì)H印G2-X細(xì)胞和L-02-X細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖也具有抑制作用。p-Anti-HBxPl#后*P < O. 05，**P < O. 01，進(jìn)行Student’ s t test統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。圖5.應(yīng)用MTT檢測(cè)本發(fā)明的多肽對(duì)肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)的影響。結(jié)果顯示，應(yīng)用人工 合成的多肽Anti-HBxPl#對(duì)H印G2-X細(xì)胞、L-02-X細(xì)胞和H印G2. 2. 15細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖具有抑制作用，且其作用呈劑量依賴(lài)性。而對(duì)無(wú)HBx表達(dá)的H印G2肝癌細(xì)胞和L-02肝細(xì)胞無(wú)影響。< O. 05，**P < O. 01，進(jìn)行 Student’ s t test 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。圖6 :人工合成的多肽Anti-HBxPl#對(duì)H印G2-X細(xì)胞的作用。裸鼠接種實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，應(yīng)用人工合成的多肽Anti-HBxPl#對(duì)H印G2-X細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖具有明顯的抑制作用。**P < O. 01, Student’ s t test 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析圖7.人工合成的多肽Anti-HBxPl#對(duì)H印G2. 2. 15細(xì)胞的作用。裸鼠接種實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，應(yīng)用人工合成的多肽Anti-HBxPl#對(duì)H印G2. 2. 15細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖具有明顯的抑制作用。"wP < O. 01, Student’ s t test 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
圖8.構(gòu)建多肽真核表達(dá)載體的連接示意圖。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明中，包括說(shuō)明書(shū)和權(quán)利要求書(shū)，使用的下列術(shù)語(yǔ)除非特別說(shuō)明，具有如下的含義“分離的” ー詞是指將物質(zhì)從它原始的環(huán)境(例如，若是自然產(chǎn)生的就指其天然環(huán)境)分離出來(lái)。比如說(shuō)，ー個(gè)自然產(chǎn)生的多核苷酸或多肽存在于活動(dòng)物中就是沒(méi)有被分離出來(lái)，而同樣的多核苷酸或多肽同一些或全部在自然系統(tǒng)中與之共存的物質(zhì)分開(kāi)就是分離的。這樣的多核苷酸或多肽可以是某ー載體的一部分，也可以是某ー組合物的一部分。既然載體和組合物不是它的天然環(huán)境的成分，它們?nèi)匀皇欠蛛x的?！凹兓摹?ー詞意指已經(jīng)在純度上提高的?！凹兌取痹谶@是相對(duì)術(shù)語(yǔ)，并不必要地解釋為絕對(duì)純度。例如，純度可以是至少約50%，或可以是大于60%、70%、80%、90%、或可以是100%。如本發(fā)明中所用，分離的物質(zhì)是從其原始環(huán)境中分離出來(lái)?；铙w細(xì)胞內(nèi)的天然狀態(tài)下的多核苷酸和多肽是沒(méi)有分離的，但同樣的多核苷酸和多肽如從天然狀態(tài)中同存在的其他物質(zhì)中分開(kāi)，則為分離的，同時(shí)純度上得到了提高，也因此是純化的。“核酸”、“核酸序列”或“堿基序列”是指核苷酸，寡核苷酸或多核苷酸及其片段或部分。本發(fā)明的核酸能夠以RNA (例如，mRNA)的形態(tài)、或DNA的形態(tài)(例如，cDNA或基因組DNA)存在。DNA可以是雙鏈，也可以是單鏈。單鏈DNA或RNA可以是編碼鏈(有義鏈)、或非編碼鏈(反義鏈)中任ー種。另外，本發(fā)明的多核苷酸也可以在其5’端或3’端融合編碼標(biāo)簽標(biāo)記(標(biāo)簽序列或標(biāo)記物序列)的多核苷酸。它們可以是合成的或是從天然來(lái)源獲得的(例如，分離和/或純化)，其可以包含天然的、非天然的或者修飾過(guò)的核苷酸，并且其可以包含天然的、非天然的或改變的核苷酸之間的鍵，諸如氨基磷酸酯鍵或硫代磷酸酯鍵，用來(lái)代替在未修飾的寡核苷酸中核苷酸之間存在的磷酸ニ酯鍵。所謂“氨基酸序列”或“多肽”是指肽、寡肽、多肽或蛋白質(zhì)及其部分片段，其間以肽鍵相連接的氨基酸。當(dāng)本發(fā)明中的“氨基酸序列”涉及ー種天然存在的蛋白質(zhì)分子的氨基酸序列吋，這種“多肽”或“蛋白質(zhì)”并不意味著將氨基酸序列限制為與所述蛋白質(zhì)分子相關(guān)的完整的天然氨基酸序列。本發(fā)明的氨基酸序列可以含有附加的肽。作為附加的肽，如多組氨酸標(biāo)簽(His-tag)、或Myc、FLAG等表位標(biāo)記的肽為例?！叭笔А笔侵冈诎被嵝蛄谢蚝塑账嵝蛄兄幸粋€(gè)或多個(gè)氨基酸或核苷酸的缺失?！安迦搿被颉疤砑印笔侵冈诎被嵝蛄谢蚝塑账嵝蛄兄械母淖儗?dǎo)致與天然存在或改 變前的分子相比，一個(gè)或多個(gè)氨基酸或核苷酸的增加?！爸脫Q”是指由不同的氨基酸或核苷酸替換ー個(gè)或多個(gè)氨基酸或核苷酸?！叭笔А⒅脫Q或添加一個(gè)或多個(gè)氨基酸或核苷酸”則是指，利用定位誘變法等公知的突變核酸或多肽的制作法缺失、置換或添加能夠缺失、置換或添加的程度的數(shù)目的氨基酸或核苷酸。上述突變不限于利用已知的定點(diǎn)突變法而人為誘導(dǎo)的突變，也可以是對(duì)天然存在的核酸或蛋白質(zhì)的突變進(jìn)行分離純化而得到的。對(duì)氨基酸的突變可以包含有一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基為構(gòu)象為D-型的氨基酸，自然界存在的稀有氨基酸或人工修飾的氨基酸，這些氨基酸可以是也可以不是由遺傳密碼子編碼的。與此相類(lèi)似的，誘導(dǎo)核酸發(fā)生突變，可以包括自然界天然存在的核苷酸，也可以包括具有修飾的核苷酸。多肽的“功能片段”是指本發(fā)明的多肽的任何部分，所述部分保留其作為一部分的多肽(即“親本”多肽)的基本相似或相同的生物學(xué)活性和功能。多肽的“功能變體”是指基本上保持如所述多肽或氨基酸序列相同或相似的生物學(xué)功能或活性的氨基酸序列，它們可以包括，例如，D原氨基酸序列中一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基有缺失和/或一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基被添加；或者2)原氨基酸序列中一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基被保守或非保守氨基酸殘基取代；或者3)原氨基酸序列中一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基上的某個(gè)基團(tuán)被其它基團(tuán)取代；或者4)原氨基酸序列和另外的分子或化合物(比如糖、脂類(lèi)、聚こニ醇等)的融合；或者5)原有的氨基酸序列與添加的氨基酸序列融合進(jìn)而形成的多肽序列(如前導(dǎo)序列或分泌序列或用來(lái)純化此多肽的序列等)；或者6)原氨基酸序列的逆反類(lèi)似物；或者7)以上各種情況的混合。本發(fā)明中，氨基酸序列的功能變體，可以包含有ー個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基為構(gòu)象為D-型的氨基酸，自然界存在的稀有氨基酸或人工修飾的氨基酸，這些氨基酸可以是也可以不是由遺傳密碼子編碼的。多肽的“逆反類(lèi)似物”是指包括反轉(zhuǎn)的親本多肽氨基酸序列的多肽，以致所述逆反類(lèi)似物的氨基酸序列(當(dāng)從N端向C端讀取時(shí))與當(dāng)從C端向N端讀取時(shí)的親本多肽的氨基酸序列相同；此外，逆反類(lèi)似物中每ー個(gè)氨基酸是該氨基酸的D異構(gòu)體，D異構(gòu)體與L異構(gòu)體相反。例如，三肽Val-Ala-Gly的逆反類(lèi)似物具有氨基酸序列Gly-Ala-Val，其中每個(gè)氨基酸是D異構(gòu)體。本發(fā)明中，“肽模擬物”是指具有與相對(duì)應(yīng)多肽基本相同的通用結(jié)構(gòu)且具有，例如，能増加其穩(wěn)定性或生物學(xué)功能的修飾的化合物。肽模擬物包括，例如，包含與相對(duì)應(yīng)多肽的相同氨基酸序列的那些化合物，但在其中兩個(gè)或更多個(gè)氨基酸之間，肽模擬物具有改變的主鏈。所述肽模擬物可以包括合成的或非天然存在的氨基酸來(lái)代替天然存在的氨基酸。本發(fā)明中，核苷酸序列的“簡(jiǎn)并變異體”是這樣的多核苷酸序列，其與親本核苷酸序列有區(qū)別，但編碼的蛋白質(zhì)和多肽和親本核苷酸序列所編碼的蛋白質(zhì)或多肽一祥。“核酸雜交”在本領(lǐng)域已公知(參見(jiàn),例如，Sambrook等，Molecular Cloning ALaboratory Manual, 3rd Ed. , Cold Spring Harbor Laboratory, 2001)。通常，溫度越高，鹽濃度越低，則嚴(yán)謹(jǐn)性變得越高(難以雜交)，從而能夠取得更加相同的多核苷酸。適合的雜交溫度根據(jù)堿基序列或其堿基序列的長(zhǎng)度而異。另外，本發(fā)明還涉及在“嚴(yán)格條件”下雜交。本發(fā)明中，“嚴(yán)格條件”是指，在較低離子強(qiáng)度和較高溫度下的雜交和洗脫，例如，42°C的條件下、在(50%甲酰胺、5 X SSC(150mM NaCl、15mM檸檬酸三鈉)、50mM的磷酸鈉(pH7. 6)、5 XDenhardt溶液、10%硫酸葡聚糖、和20 μ g/ml的變性剪切鮭魚(yú)精子DNA)中孵育過(guò)夜，然后在65°C條件下用O. IXSSC洗脫。
“同源性”是指互補(bǔ)的程度，可以是部分同源，也可以是完全同源?！安糠滞础笔侵俯`種部分互補(bǔ)的序列，其可部分抑制完全互補(bǔ)的序列與靶核酸的雜交。這種抑制可通過(guò)在嚴(yán)格性程度降低的條件下進(jìn)行雜交(Southern印跡或Northern印跡等)來(lái)檢測(cè)?；就吹男蛄谢螂s交探針可競(jìng)爭(zhēng)和抑制完全互補(bǔ)的序列與靶序列在嚴(yán)格性程度降低的條件下的結(jié)合。當(dāng)然，嚴(yán)格性降低的條件并非允許非特異性的結(jié)合，兩條序列相互結(jié)合，仍然需要特異性或選擇性的相互作用。氨基酸序列或核苷酸序列的“相同性”或“同一性”百分率是指在兩種或多種氨基酸或核苷酸序列比較中，序列相同或相似的百分率。有很多本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法測(cè)定相同性百分率，如通過(guò) MEGALIGN 程序(Lasergene software package, DNASTA, Inc.,Madison, WI)。MEGALIGN程序可根據(jù)不同的方法如Cluster法比較兩種或多種序列(參見(jiàn)Higgins & Sharp7Gene 73 :237_244，(1988))，Gluster法通過(guò)檢查所有配對(duì)之間的距離將各組序列排列成簇，然后將簇以成對(duì)或成組分配。兩個(gè)氨基酸序列如序列A和序列B之間的相同性百分率可以通過(guò)下式計(jì)算[(序列A與序列B之間匹配的殘基個(gè)數(shù))/(序列A的殘基數(shù)-序列A中間隔殘基數(shù)-序列B中間隔殘基數(shù))]X 100%同理，也可以通過(guò)Cluster法或用本領(lǐng)域已知的方法，如Jotun Hein的方法(參見(jiàn)Hein J. , Methods in Emzumology 183 :625-645,1990),測(cè)定核酸序列的相同性百分率?！爸亟M表達(dá)載體”是指遺傳修飾的寡核苷酸或多核苷酸重組體，該重組體克隆有編碼mRNA、蛋白、多肽、或肽的核苷酸序列，當(dāng)該表達(dá)載體進(jìn)入宿主細(xì)胞后可表達(dá)相應(yīng)的mRNA、蛋白、多肽、或肽。本發(fā)明中，重組表達(dá)載體可以包含任意類(lèi)型的核苷酸序列，但不僅限于是DNA或RNA，可為單鏈或雙鏈、人工合成或來(lái)自天然，也可為非天然的或改變的核苷酸。核苷酸之間的鍵可以是天然存在的、也可以是非天然存在的或修飾的。本發(fā)明中，“こ肝病毒感染后的慢性肝病”是指こ型肝炎病毒感染后導(dǎo)致的肝病，包括慢性肝炎、慢性肝炎反復(fù)發(fā)作引起的肝組織中纖維結(jié)締組織增生后發(fā)生的肝硬變，及大部分在肝硬變基礎(chǔ)上發(fā)生的肝癌。肝癌的發(fā)生是こ型肝炎病毒持續(xù)感染的結(jié)果，這種肝癌可稱(chēng)之為こ肝后肝癌。
本發(fā)明中，“治療”和“預(yù)防”以及由它們派生的詞語(yǔ)，但并不意味是100%的或完全的治療或預(yù)防，可以認(rèn)定為本領(lǐng)域技術(shù)人員所認(rèn)同的治療或預(yù)防程度。本發(fā)明中的“預(yù)防”可理解為延遲疾病、或其癥狀或病癥的發(fā)作。多肽本發(fā)明提供分離或純化的多肽。本發(fā)明涉及的多肽可以是包含、基本由、或由氨基酸序列 Gly-Ser-Ala-Val-Met-Phe-Ser-Ser-Lys-Glu-Arg-Gly (SEQ ID NO 1)所組成的多肽。研究證實(shí)這些多肽可以明顯抑制HBx的活性，具有明顯抑制こ肝病毒感染后的慢性肝病的發(fā)生和發(fā)展的作用，更重要的是，這些多肽可以抑制感染有こ肝病毒的肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和増殖。所述抑制在分子水平、細(xì)胞水平和動(dòng)物水平均有體現(xiàn)。如，所述多肽在分子水平上可以抑制由HBx激活的核因子B(NF-B)的啟動(dòng)子活性，從而體現(xiàn)所述多肽對(duì)HBx的有效抑制，且其抑制效果呈量效關(guān)系；所述多肽在細(xì)胞水平也體現(xiàn)出對(duì)含HBx基因的肝癌細(xì)胞的 生長(zhǎng)和増殖功能的有效抑制，且其抑制效果也呈量效關(guān)系；通過(guò)裸鼠接種方法顯示，所述多肽在動(dòng)物水平能有效抑制表達(dá)HBx的肝癌細(xì)胞的成瘤能力。然而，所述多肽對(duì)無(wú)表達(dá)HBx肝癌細(xì)胞中NF-B的啟動(dòng)子活性無(wú)影響，對(duì)無(wú)表達(dá)HBx肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖也無(wú)影響。本發(fā)明還提供所述本發(fā)明多肽的各種功能片段。所述功能片段可以為本發(fā)明的多肽的連續(xù)氨基酸序列的任何片段，條件是其與親本多肽相比，能以相似程度、相同程度、或更高程度保留親本多肽的生物活性，例如，抑制HBx的活性。參照親本多肽，所述功能片段可以包括，例如，親本多肽的約 10% ,20% ,30% ,40% ,50% ,60 % ,70% ,80% ,90% ,95%,100%,105%,110%,120%,150%,200%或更高的活性。所述功能片段還可以在上述連續(xù)氨基酸序列片段的氨基或羧基端、或其氨基以及羧基兩端，包含額外的氨基酸，例如，與親本多肽的氨基酸序列中不同的氨基酸。如果所述額外的氨基酸不妨礙所述功能片段的生物學(xué)功能是理想的，例如，抑制HBx的活性，并有效地抑制癌細(xì)胞，優(yōu)選是肝癌細(xì)胞，尤其是感染有こ肝病毒的肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和増殖。更為理想的是，當(dāng)與所述親本多肽的生物學(xué)活性相比較時(shí)，所述額外的氨基酸能夠?qū)е略鰪?qiáng)的生物學(xué)活性。本發(fā)明的多肽的功能片段包括與所述親本多肽具有至少70%的序列同一性的氨基酸序列為優(yōu)選序列。在ー個(gè)具體的實(shí)施例中，本發(fā)明的功能片段包括在所述親本多肽的N端和/或C端添加氨基酸，例如一個(gè)或兩個(gè)氨基酸。另外，本發(fā)明的多肽及其功能片段的功能變體也包括在本發(fā)明范圍之內(nèi)。所述本發(fā)明的多肽及其功能片段的功能變體保留與所述親本多肽或親本功能片段基本相似或相同的生物活性，例如，抑制HBx的活性，以及有效地抑制肝癌細(xì)胞，尤其是感染有こ肝病毒的肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和増殖。參照所述親本多肽或親本功能片段，所述功能變體可以與所述親本多肽或親本功能片段的氨基酸序列至少有約50 %、60 %、70 %、80 %、90 %、95 %或100%的同一性。優(yōu)選地，本發(fā)明的多肽及其功能片段的功能變體包含，與所述親本多肽或親本功能片段具有至少70%的序列同一性。更優(yōu)選的，本發(fā)明的多肽及其功能片段的功能變體包含與所述親本多肽或親本功能片段只有1-3個(gè)氨基酸的區(qū)別。最優(yōu)選地，本發(fā)明的多肽及其功能片段的功能變體包含與所述親本多肽或親本功能片段只有I個(gè)氨基酸的區(qū)別。所述本發(fā)明的多肽及其功能片段的功能變體可以包括，例如，包含具有至少ー個(gè)保守氨基酸置換的親本多肽或親本功能片段氨基酸序列。具體來(lái)說(shuō)，所述本發(fā)明的多肽及其功能片段的功能變體可以包含具有2個(gè)、3個(gè)、4個(gè)、5個(gè)、或更多個(gè)保守氨基酸置換的親本多肽或親本功能片段的氨基酸序列。另外，所述本發(fā)明的多肽及其功能片段的功能變體也可以包括具有至少ー個(gè)非保守氨基酸置換的親本多肽或親本功能片段的氨基酸序列。具體來(lái)說(shuō)，可以包括具有2個(gè)、3個(gè)、4個(gè)、5個(gè)、或更多個(gè)非保守氨基酸置換的親本多肽或親本功能片段的氨基酸序列。在這些情形中，對(duì)于所述的氨基酸置換，優(yōu)選的是不妨礙或抑制所述功能變體的生物學(xué)功能或活性。更優(yōu)選地，所述氨基酸置換提高本發(fā)明的多肽及其功能片段的功能變體的生物學(xué)功能或活性，以致當(dāng)與所述親本多肽或親本功能片段相比較時(shí)，所述功能變體的生物學(xué)功能或活性提高。優(yōu)選地，本發(fā)明的多肽及其功能片段的功能變體包括ー個(gè)或多個(gè)保守氨基酸置換。在本領(lǐng)域內(nèi)，保守氨基酸置換是公知的，它指的是這樣的氨基酸置換，即，其中ー個(gè)具有某種物理和/或化學(xué)特性的氨基酸被換為另ー個(gè)具有相同化學(xué)或物理特性的氨基酸。本領(lǐng)域技術(shù)人員了解，保守性的氨基酸置換可以不造成蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)或功能的顯著改變。典型的保守性置換包括，例如，用酸性氨基酸置換另ー個(gè)酸性氨基酸(例如，AsP或Glu)，用具有非極性側(cè)鏈的氨基酸置換另ー個(gè)具有非極性側(cè)鏈的氨基酸(例如，Ala，Gly, Val, He, Leu, Met, Phe, Pro, Trp，Val，等)，用堿性氨基酸置換另ー個(gè)堿性氨基酸(Lys，Arg,等)，用具有極性側(cè)鏈的氨基酸置換另ー個(gè)具有極性側(cè)鏈的氨基酸(Asn, Cys, Gin, Ser, Thr, Tyr,等),用芳香氨基酸(Trp，Phe，Tyr，等)置換另ー個(gè)芳香氨基酸，等。另外，本發(fā)明的多肽及其功能片段的功能變體還可以包括本發(fā)明的任意多肽或功能片段的逆反類(lèi)似物。本發(fā)明中，“逆反類(lèi)似物”是指包括反轉(zhuǎn)的親本多肽氨基酸序列的多肽，以致所述逆反類(lèi)似物的氨基酸序列(當(dāng)從N端向C端讀取時(shí))與當(dāng)從C端向N端讀取時(shí)的親本多肽的氨基酸序列相同。此外，關(guān)于逆反類(lèi)似物，每ー個(gè)氨基酸是該氨基酸的D異構(gòu)體，D異構(gòu)體與L異構(gòu)體相反。例如，三肽Val-Ala-Gly的逆反類(lèi)似物具有氨基酸序列Gly-Ala-Val，其中每個(gè)氨基酸是D異構(gòu)體。本發(fā)明中，所述功能變體優(yōu)選包括SEQ ID NOI的逆反類(lèi)似物。本發(fā)明的多肽(包括功能片段)及其功能變體可以是任意長(zhǎng)度的，即，可以包括任意數(shù)目的氨基酸，條件是所述多肽(包括功能片段)及其功能變體保留必要的生物學(xué)活性，例如，抑制HBx的活性，以及有效地抑制癌細(xì)胞，優(yōu)選是肝癌細(xì)胞，尤其是感染有こ肝病毒的肝癌細(xì)胞。舉例來(lái)說(shuō)，本發(fā)明的多肽(包括功能片段和功能變體)可以是4-2000個(gè)氨基酸長(zhǎng)，如長(zhǎng)度為 5,6,7,8,9,10，11，12，13，14，15，16，18，20，25，30，40，50，60，70，80，90，100，125，150，175，200，300，400，500，700，800，1000 或更多。優(yōu)選地，本發(fā)明的多肽長(zhǎng)度為6-20個(gè)氨基酸，并滿(mǎn)足作為多肽藥物的藥效學(xué)和半衰期的要求。在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明的多肽及其功能片段的功能變體與親本多肽SEQ ID NO:I具有一個(gè)氨基酸的差別，其具有與親本多肽SEQ ID NO 1相似的生物學(xué)活性和功能，例如，抑制HBx的活性，以及有效地抑制癌細(xì)胞，優(yōu)選是肝癌細(xì)胞，尤其是表達(dá)HBx的肝癌細(xì)胞。更具體地，本發(fā)明的多肽及其功能片段的功能變體包括SEQ ID NOs 2-60本發(fā)明還提供所述多肽(包括功能片段和功能變體)的肽模擬物。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述肽模擬物是擬肽。擬肽是指這樣的肽模擬物，其中每個(gè)氨基酸的側(cè)鏈粘附在氨基酸的氮原子上而不是α碳上。例如，擬肽可以被視為N-置換的甘氨酸，其具有NRCH2CO通用結(jié)構(gòu)的重復(fù)單位，并且其具有與相對(duì)應(yīng)的多肽相同或基本相同的氨基酸序列。在另ー個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述肽模擬物包括改變的主鏈，其中在每個(gè)氨基酸之間的鍵是甲基化的。在這一點(diǎn)上，所述肽模擬物可以包括下述結(jié)構(gòu)的甲基化肽主鏈
...NCH3 ■ Ca- CO - NCH3 - Ca- CO...
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側(cè)鏈側(cè)鏈本發(fā)明的多肽(包括功能片段和功能變體)以及肽模擬物中，可以包括用合成的氨基酸來(lái)置換天然存在的氨基酸。所述合成的氨基酸在本領(lǐng)域內(nèi)是已知的，包括，例如，氨基環(huán)己烷羧酸、正亮氨酸、a-氨基正癸酸、高絲氨酸、S-こ酰氨基甲基-半胱氨酸、反式-3-羥脯氨酸、反式-4-羥脯氨酸、4-氨基苯丙氨酸、4-苯甲酰苯丙氨酸、4-硝基苯 丙氨酸、4-氯苯丙氨酸、4-羧基苯丙氨酸、苯基絲氨酸、羥基苯丙氨酸、苯基甘氨酸、a -萘基丙氨酸、環(huán)己基丙氨酸、環(huán)己基甘氨酸、ニ氫吲哚-2-羧酸、1，2，3,4-四氫異哇琳-3-羧酸、氨基丙ニ酸、氨基丙ニ酸單酞胺、N’ -芐基-N’-甲基-賴(lài)氨酸、N'，N' - ニ芐基-賴(lài)氨酸、6_羥基賴(lài)氨酸、鳥(niǎo)氨酸、a-氨基環(huán)戊烷羧酸、a-氨基環(huán)己烷羧酸、a-氨基環(huán)庚燒羧酸、a _(2_氨基-2-降冰片燒)_羧酸、α, γ-ニ氨基丁酸、α, β - ニ氨基丙酸、高苯丙氨酸、和α-叔-丁基甘氨酸。本文所述的本發(fā)明的多肽(包括功能片段和功能變體)以及肽模擬物還可以包含細(xì)胞-穿透肽(CPP)。所述CPP促進(jìn)本發(fā)明多肽穿過(guò)細(xì)胞膜并且進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。CPPs在本領(lǐng)域中是已知的。參見(jiàn)，例如，Deshayes等，細(xì)胞分子生命科學(xué)(Cell. Mol. LifeSci. ) 62 1839-1849 (2005) ;EI_Andaloussi 等，現(xiàn)代藥物設(shè)計(jì)(Curr· Pharm. Design.) 11 3597-3611 (2005)。所述CPP可以是本領(lǐng)域已知的那些中的任ー種。本發(fā)明的多肽(包括功能片段和功能變體)以及肽模擬物還可以，例如，被脂化(例如，脂肪酸化)、糖基化、酰胺化、羧酸化、磷酸化、酷化、N-?；⑼ㄟ^(guò)ニ硫鍵環(huán)化、轉(zhuǎn)化成酸加成鹽、ニ聚體化或多聚體化，和/或綴合化。舉例來(lái)說(shuō)，本發(fā)明所述多肽(包括功能片段和功能變體)以及肽模擬物可以是脂化衍生物。所含的脂質(zhì)分子可以包括本領(lǐng)域已知的任何脂質(zhì)，例如，脂肪酸，磷脂基團(tuán)，糖磷脂酰肌醇，磷脂酰絲氨酸，磷脂酰こ醇胺，鞘磷脂，磷脂酰膽堿，心磷脂，磷脂酰肌醇，磷脂酸，溶血磷酸甘油酷，和膽固醇基團(tuán)。優(yōu)選地，所述脂化衍生物是脂肪酸衍生物，所述脂肪酸分子可以是任何C8-C20脂肪酸，例如，月桂酸、棕櫚酸、肉豆蘧酸、硬脂酸、油酸、亞油酸、亞麻酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸、芥酸、或花生酸等。所述脂肪酸還可以在任意碳原子上任選地包含其他官能團(tuán)，例如，ー個(gè)或多個(gè)氨基。所述脂肪酸分子可以附著在本發(fā)明多肽(包括功能片段和功能變體)以及肽模擬物的任何適當(dāng)?shù)牟糠?。例如，在本發(fā)明的多肽氨基端、羧基端、或氨基和羧基兩端包括脂肪酸分子。脂肪酸分子可以直接或通過(guò)連接體附著到本發(fā)明的多肽(包括功能片段和功能變體)以及肽模擬物上。本發(fā)明的多肽(包括功能片段和功能變體)以及肽模擬物，包括其衍生物例如脂肪酸衍生物，還可以是單體肽、ニ聚肽或多聚體肽。本發(fā)明的多肽(包括功能片段和功能變體)以及肽模擬物可以通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法獲得(參見(jiàn)，例如，Chan等,Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis,牛津大學(xué)出版社，牛津，英國(guó)，2005 ;Reid, R. , Peptide and Protein Drug Analysis,Marcel DekkerCompany, 2000 ；以及美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5，449，752)。此外，也可由核酸重組方法生產(chǎn)多肽而得到(參見(jiàn)，例如，Sambrook等，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)' (Molecular Cloning A LaboratoryManual),第3版,冷泉港出版社(Cold Spring Harbor Press),冷泉港,紐約,2001)。此外，本發(fā)明的一些多肽(包括其功能片段以及功能變體)可以從如植物、細(xì)菌、昆蟲(chóng)、哺乳動(dòng)物如大鼠、人等分離和/或純化。分離和純化的方法在本領(lǐng)域內(nèi)也是公知的。備選地，本文所述的多肽(包括其功能片段以及功能變體)可以從商業(yè)公司合成后購(gòu)買(mǎi)獲得。多核苷酸本發(fā)明還提供編碼任一種所述的本發(fā)明多肽(包括功能片段和功能變體)的分離的多核苷酸。所述多核苷酸包含編碼任一種本發(fā)明多肽(包括功能片段和功能變體)編碼序列，例如編碼SEQ ID NO :1的核苷酸序列SEQ ID NO :7，以及這些編碼序列的任一種簡(jiǎn)并變異體；備選地，所述多核苷酸還可以包含附加編碼序列和/或非編碼序列。另ー方面，本發(fā)明還提供包含這樣的分離的多核苷酸或其片段，其所包含的核苷酸序列與本發(fā)明所述的任ー種核酸的核苷酸序列互補(bǔ)或在嚴(yán)格條件下與本發(fā)明所述的任一種多核苷酸的核苷酸序列雜交。本發(fā)明還提供上述多核苷酸的變異體，其編碼與本發(fā)明多肽(包括功能片段和功能變體)有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的功能片斷、功能變體。此多核苷酸的變異體可以是天然發(fā)生的等位變異體或非天然發(fā)生的變異體。這些核苷酸變異體包括取代變異體、缺失變異體和插入變異體。如本領(lǐng)域所知的，等位變異體是ー個(gè)多核苷酸的替換形式，它可能是ー個(gè)或多個(gè)核苷酸的取代、缺失或插入，但不會(huì)從實(shí)質(zhì)上改變其編碼的多肽的功倉(cāng)^:。本發(fā)明的多核苷酸可以是天然存在通過(guò)純化而得到，也可以通過(guò)重組產(chǎn)生，或者可以基于化學(xué)合成/或酶連接反應(yīng)，使用本領(lǐng)域已知的方法而構(gòu)建。本發(fā)明的多核苷酸可以含有天然存在的核苷酸，也可以包含具有修飾的核苷酸。所述具有修飾的核苷酸設(shè)計(jì)成增加分子的生物學(xué)穩(wěn)定性或增加在雜交時(shí)形成的雙鏈體的物理穩(wěn)定性(例如，硫代磷酸衍生物和吖啶置換的核苷酸)，包括，例如，5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黃嘌呤、黃嘌呤、4-こ酰胞嘧啶、5-(羧基羥甲基)尿嘧啶、5-甲氧基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、尿嘧啶-5-羥基こ酸、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫胞嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-羥基こ酸甲基酷、3-(3-氨基-3-N-2-羧丙基)尿嘧啶、和2，6_ニ氨基嘌呤等。并且，其可以包含天然的或改變的核苷酸之間的鍵，諸如氨基磷酸酯鍵或硫代磷酸酯鍵，用來(lái)代替天然存在的磷酸ニ酯鍵。優(yōu)選的，本發(fā)明的核酸是重組產(chǎn)生的。重組表達(dá)載體本發(fā)明還提供包括任一種本發(fā)明多核苷酸的重組表達(dá)載體。所述重組表達(dá)載體可以是任何適當(dāng)?shù)闹亟M表達(dá)載體，并且可以用于轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染任何適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞。適當(dāng)?shù)妮d體包括設(shè)計(jì)用于繁殖和擴(kuò)增或用于表達(dá)，或同時(shí)用于二者，如質(zhì)?；虿《?。所述載體可以通過(guò)下列自由組合pUC系列、pcDNA系列，pBluescript、pET系列、pGEX系列和pEX系列。還可以使用噬菌體載體，諸如AGTIO、AGTlU AZaPII, AEMBL4等。植物表達(dá)載體可以包括pBIOl、pBIlOl. 2、pBIlOl. 3、pBI121 和 pBIN19。動(dòng)物表達(dá)載體可以包括 pEUK_Cl、pMAM 和 pMAMneo。優(yōu)選地,本發(fā)明提供pcDNA系列的質(zhì)粒。
可以使用標(biāo)準(zhǔn)重組DNA技術(shù)制備本發(fā)明的重組表達(dá)載體。可以制備環(huán)形的或線性的表達(dá)載體構(gòu)建體，以包含在原核或真核宿主細(xì)胞中起作用的復(fù)制系統(tǒng)。理想地，所述重組表達(dá)載體包括調(diào)控序列，諸如轉(zhuǎn)錄和翻譯起始與終止密碼子。所述調(diào)控序列對(duì)于所述載體所引入的宿主類(lèi)型(例如，細(xì)菌、真菌、植物、或動(dòng)物)是特異性的。所述重組表達(dá)載體可以包括一種或多種標(biāo)記基因，其允許選擇轉(zhuǎn)化的或轉(zhuǎn)染的宿主。標(biāo)記基因包括對(duì)殺生物劑的抗性，例如，對(duì)抗生素、重金屬等的抗性，在營(yíng)養(yǎng)缺陷型宿主中互補(bǔ)以提供原養(yǎng)型，以及催化生物熒光等等。對(duì)于本發(fā)明表達(dá)載體合適的標(biāo)記基因包括，例如，新霉素/G418抗性基因、熒光酶素報(bào)告基因、潮霉素抗性基因、組氨醇抗性基因、四環(huán)素抗性基因、和氨芐青霉素抗性基因。所述重組表達(dá)載體可以包括天然的或非天然的啟動(dòng)子。啟動(dòng)子的選擇，例如，強(qiáng)、弱、誘導(dǎo)型、組織特異型和發(fā)育特異型的，在技術(shù)人員的普通技能之內(nèi)。相似地，核苷酸序列與啟動(dòng)子的組合也在技術(shù)人員的技能之內(nèi)。啟動(dòng)子可以是非病毒啟動(dòng)子或病毒啟動(dòng)子，例如，巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動(dòng)子、SV40啟動(dòng)子、RSV啟動(dòng)子、以及在鼠干細(xì)胞病毒長(zhǎng)末端重復(fù)中存在的啟動(dòng)子。本發(fā)明的重組表達(dá)載體可以設(shè)計(jì)用于瞬時(shí)表達(dá)、用于穩(wěn)定表達(dá)、或用于ニ 者。此外，所述重組表達(dá)載體可以制備成用于組成型表達(dá)或用于誘導(dǎo)型表達(dá)。此外，所述重組表達(dá)載體可以包括自殺基因?！白詺⒒颉笔侵冈诩?xì)胞中表達(dá)后導(dǎo)致細(xì)胞死亡的基因。自殺基因表達(dá)后可影響細(xì)胞對(duì)某種試劑如藥物的敏感性，進(jìn)而引起細(xì)胞死亡。自殺基因在本領(lǐng)域內(nèi)是已知的(參見(jiàn)，例如，自殺基因治療方法和綜述(Suicidebene i'herapy Methods and Reviews), bprmger,しaroiine J. (Cancer Research UKCentre for Cancer Therapeutics at the Institute of Cancer Research， Sutton，Surrey, UK), Humana Press，2004)，例如單純疤疹病毒(HSV)胸苷激酶(TK)基因和嘌呤核苷磷酸酶，以及硝基還原酶等。宿主細(xì)胞本發(fā)明還提供包括本文所述的任何一種重組表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。宿主細(xì)胞是包含本發(fā)明重組表達(dá)載體的任何類(lèi)型的細(xì)胞。宿主細(xì)胞可以是真核細(xì)胞，例如，植物、動(dòng)物、真菌、或藻類(lèi)，或者可以是原核細(xì)胞，例如，細(xì)菌或原生動(dòng)物。宿主細(xì)胞可以是培養(yǎng)的細(xì)胞或原代細(xì)胞，即，直接從生物體如人分離的原代細(xì)胞。宿主細(xì)胞可以是貼壁細(xì)胞或懸浮的細(xì)胞，SP，在混懸液中生長(zhǎng)的細(xì)胞。適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞在本領(lǐng)域內(nèi)是已知的，包括，例如，DH5a大腸桿菌細(xì)胞、中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞、猴VERO細(xì)胞、COS細(xì)胞、HEK293細(xì)胞，等等。為了擴(kuò)增或復(fù)制所述重組表達(dá)載體的目的，所述宿主細(xì)胞優(yōu)選是原核細(xì)胞。為了產(chǎn)生重組修飾的多肽或蛋白的目的，宿主細(xì)胞優(yōu)選是哺乳動(dòng)物細(xì)胞。人源細(xì)胞為優(yōu)選的宿主細(xì)胞。宿主細(xì)胞可以是任何細(xì)胞類(lèi)型，可以來(lái)自任何類(lèi)型的組織，并且可以是任何發(fā)育階段的。本發(fā)明還提供包括至少ー種本文所述的宿主細(xì)胞的細(xì)胞群體。所述細(xì)胞群體可以是異種群體，包括包含任一種所述重組表達(dá)載體的宿主細(xì)胞，以及至少ー種其它細(xì)胞，例如，不包含任何所述重組表達(dá)載體的宿主細(xì)胞(例如，T細(xì)胞)，或除T細(xì)胞之外的細(xì)胞，例如，B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞、紅細(xì)胞、肝細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞、肌細(xì)胞、腦細(xì)胞，等等。備選地，所述細(xì)胞群體可以是基本同種群體，其中所述群體主要包括包含所述重組表達(dá)載體的宿主細(xì)胞(例如，主要由包含所述重組表達(dá)載體的宿主細(xì)胞組成)。所述群體還可以是細(xì)胞的克隆群體，其中所述群體的所有細(xì)胞是包含重組表達(dá)載體的単一宿主細(xì)胞的克隆，以致該群體的所有細(xì)胞包含所述重組表達(dá)載體。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述細(xì)胞群體是包括包含本文所述的重組表達(dá)載體的宿主細(xì)胞的克隆群體。綴合物本發(fā)明還包括綴合物，例如，生物綴合物，其包括本發(fā)明的多肽(包括功能片段和功能變體)以及肽模擬物、多核苷酸、重組表達(dá)載體、或宿主細(xì)胞中的任ー種。綴合物，以及通常合成綴合物的方法在本領(lǐng)域內(nèi)也是已知的(參見(jiàn),例如，Hudecz, F.，分子生物學(xué)方法(Methods Mol. Biol.) 298 :209-223 (2005)和 Kirin 等，無(wú)機(jī)化學(xué)(Inorg. Chem. )44(15)5405-5415(2005))。藥物組合物
本發(fā)明所提供的上述各種物質(zhì)，包括多肽(包括功能片段和功能變體)以及肽模擬物、脂肪酸衍生物、多核苷酸、重組表達(dá)載體、以及宿主細(xì)胞(包括其群體)、綴合物等(籠統(tǒng)稱(chēng)為“本發(fā)明物質(zhì)”)可以是分離的、純化的、合成的、和/或重組的。本發(fā)明物質(zhì)還可以配制成組合物，諸如藥物組合物。在這一點(diǎn)上，本發(fā)明提供包括任意所述多肽(包括功能片段和功能變體)以及肽模擬物、脂肪酸衍生物、綴合物、核酸、重組表達(dá)載體和宿主細(xì)胞(包括其群體)，以及藥用載體的藥物組合物。包含任意本發(fā)明物質(zhì)的本發(fā)明藥物組合物可以包括多于ー種本發(fā)明物質(zhì)，例如多肽和核酸，或兩種或更多不同的多肽。備選地，所述藥物組合物可以包括與另ー種或多種藥物活性試劑或藥物的組合。所述另ー種或多種藥物活性試劑或藥物優(yōu)選可以包括諸如化療劑，例如，天冬酰胺酶，白消安，卡鉬，順鉬，柔紅霉素，多柔比星，氟尿嘧唆，吉西他濱，羥基服，甲氨蝶呤，紫杉醇，利妥昔單抗，長(zhǎng)春喊，長(zhǎng)春新喊，等等。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述藥物組合物包括與脂質(zhì)組合的本發(fā)明物質(zhì)。所述脂質(zhì)可以是任何脂質(zhì)，包括脂肪酸、磷脂、固醇、鞘脂、萜、甘油脂、甘油磷酸酯、異戊烯醇脂、糖脂和聚酮化合物等。所述脂在本領(lǐng)域內(nèi)是已知的。關(guān)于藥物組合物，藥用載體可以是任意常規(guī)所用的那些，它們可以?xún)H通過(guò)化學(xué)物理因素，諸如溶解性和缺乏與活性化合物的反應(yīng)性，以及通過(guò)施用的途徑，并進(jìn)行限定。本發(fā)明所述的藥用載體，例如，媒介物、佐劑、賦形劑和稀釋劑等，是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，并且容易為公眾所獲得。優(yōu)選地，所述藥用載體對(duì)活性試劑是化學(xué)惰性的，在使用條件下不具有有害副作用或毒性。載體的選擇應(yīng)該由特定的本發(fā)明物質(zhì)、以及由用于施用本發(fā)明物質(zhì)的特定方法決定。因此，存在本發(fā)明藥物組合物的多種適當(dāng)制劑。下述用于ロ服、氣霧劑、腸胃外、皮下、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、鞘內(nèi)、腹膜內(nèi)、直腸、和陰道施用的制劑是示例性的，并且不以任何方式限制?？梢允褂枚嘤讴`種途徑施用本發(fā)明物質(zhì)，在特定情形中，特定的途徑可以提供比另ー種途徑更直接和更有效的方法。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述藥物組合物是局部制劑、靜脈內(nèi)制劑、或皮下制劑。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述藥物組合是局部制劑。局部制劑是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。在本發(fā)明施用到皮肽的情形中，所述制劑特別適合。本發(fā)明的局部制劑可以是，例如，膏劑、洗液、油膏、貼片、油、糊劑、噴霧劑，例如氣霧劑噴霧劑、凝膠、滾抹式的液體、固體棒等。優(yōu)選地，本發(fā)明的局部制劑是膏劑、洗液、油膏、或貼片。適用于ロ服施用的制劑可以由下列各項(xiàng)組成a)液體溶液，諸如溶解在稀釋劑如水、鹽水、或橙汁中的有效量的本發(fā)明物質(zhì)；b)膠囊、片劑、錠劑等，每ー種包含預(yù)先確定量的，固體或顆粒狀的活性成分；C)粉劑；d)在適當(dāng)液體中的混懸液；和e)適當(dāng)?shù)娜閯?。液體制劑可以包括稀釋劑，諸如水和醇，例如，こ醇、苯甲醇、和聚こニ醇，可以添加或不添加藥用表面活性剤。膠囊形式可以是普通的硬或軟殼明膠型，其包含，例如，表面活性剤、潤(rùn)滑齊U、和惰性填充劑諸如乳糖、蔗糖、磷酸鈣、和玉米淀粉。片劑形式可以包括下列各項(xiàng)中的一種或多種乳糖、蔗糖、甘露醇、玉米淀粉、馬鈴薯淀粉、褐藻酸、微晶纖維素、阿拉伯樹(shù)膠、明膠、瓜耳膠、膠狀ニ氧化硅、滑石、硬脂酸鎂、硬脂酸鈣、硬脂酸鋅、硬脂酸、和其它賦形劑、著色劑、稀釋劑、緩沖劑、崩解劑、潤(rùn)濕劑、防腐剤、調(diào)味劑、和其它藥物相容的賦形劑。錠劑形式可以包括處在調(diào)味劑通常是在蔗糖或阿拉伯樹(shù)膠的本發(fā)明物質(zhì)，以及包括處在惰性基質(zhì)諸如明膠和甘油、或蔗糖和阿拉伯樹(shù)膠中的本發(fā)明物質(zhì)的軟錠劑，另外包含本領(lǐng)域已知的賦形劑的乳劑、凝膠等。本發(fā)明物質(zhì)，単獨(dú)的或與其它適宜的成分組合，可以制成通過(guò)吸入來(lái)施用的氣霧劑制劑。這些氣霧劑制劑可以放置在加壓可用的介質(zhì)中，諸如ニ氯ニ氟甲烷、丙烷、氮等。它 們還可以配制成非加壓的制劑，如在噴霧器或霧化器中。所述噴霧制劑還可以用于向粘膜噴霧。適于腸胃外施用的制劑包括水性和非水性、等滲無(wú)菌注射液，其可以包含抗氧化齊U、緩沖劑、抑菌劑、和使得所述制劑與預(yù)期接收者的血液等滲的溶質(zhì)，以及水性和非水性無(wú)菌混懸液，其可以包括混懸劑、增溶剤、增稠劑、穩(wěn)定劑、和防腐剤。本發(fā)明物質(zhì)可在藥用載體中的生理用稀釋劑中使用，諸如無(wú)菌液體或液體混合物，包括水、鹽水、水性葡萄糖和相關(guān)的糖溶液、醇如こ醇或十六醇、ニ醇如丙ニ醇或聚こニ醇、ニ甲亞礬、甘油、縮酮如2，2- ニ甲基-1，3- ニ氧戊環(huán)-4-甲醇、醚、油、脂肪酸、脂肪酸酯或甘油酷，或こ?；闹舅岣视涂幔砑踊虿惶砑铀幱帽砻婊钚詣┲T如皂或去污劑，混懸劑如果膠、甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、或氮甲基纖維素，或乳化劑和其它藥用佐劑?？梢杂迷谀c胃外制劑中的油包括石油、動(dòng)物油、植物油、或合成油。油的具體實(shí)例包括花生油、大豆油、芝麻油、棉籽油、玉米油、橄欖油、石油和礦物油。用在腸胃外制劑中的適當(dāng)?shù)闹舅岚ㄓ退?、硬脂酸、和異硬脂酸。用在腸胃外制劑中的適當(dāng)?shù)脑戆ㄖ緣A金屬和三こ醇胺鹽等，并含有適當(dāng)?shù)娜ノ蹌?，例如a)陽(yáng)離子去污劑ニ甲基ニ烷基鹵化銨和烷基鹵化吡啶；b)陰離子去污劑燒基、芳基、稀屬橫酸酷、燒基、稀經(jīng)、釀、單甘油硫酸酷和橫基玻拍酸酷等；c)非尚子去污劑脂肪胺氧化物、脂肪酸鏈烷醇酰胺和聚氧こ烯聚丙烯共聚物等d)兩性去污劑 焼基-β -氨基丙酸酯和2-烷基-咪唑啉季銨鹽；e)它們的混合物。所述腸胃外制劑可在溶液中含有大約為O. 5-25% (重量體積百分濃度)的本發(fā)明物質(zhì)。可以使用防腐劑和緩沖劑。為了最小化或消除在注射部位的刺激性，所述組合物可以包含ー種或多種親水性-親脂性平衡(HLB)的非離子表面活性剤。在所述制劑中表面活性劑的用量約為5-15% (重量體積百分濃度)。適當(dāng)?shù)谋砻婊钚詣┌ň郅偿舜际嚼嫣谴贾舅狨ズ铜h(huán)氧こ烷與疏水基的高分子量加合物，所述加合物是通過(guò)縮合環(huán)氧丙烷和丙ニ醇而形成的。所述腸胃外制劑可以存在于單位劑量或多劑量密封容器中，并且可以保存在冷凍干燥(凍干)的條件下，僅需要在即將使用之前加入無(wú)菌液體賦形劑如水用于注射?？梢杂上惹八龇N類(lèi)的無(wú)菌粉劑、顆粒劑、和片劑制備臨時(shí)的注射溶液和混懸液。
本發(fā)明物質(zhì)或包括所述本發(fā)明物質(zhì)的組合物還可以制成可注射制劑。可注射組合物對(duì)有效的藥用載體的需要是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員公知的。優(yōu)選地，當(dāng)施用于細(xì)胞例如樹(shù)突細(xì)胞時(shí)，所述細(xì)胞通過(guò)注射施用。另外，本發(fā)明的發(fā)明物質(zhì)，或包括所述發(fā)明物質(zhì)的組合物，可以通過(guò)與各種基質(zhì)如乳化基質(zhì)或水溶性基質(zhì)混合而制備成栓劑。適于例如陰道施用的制劑可以以陰道栓劑、衛(wèi)生棉條、膏劑、凝膠、糊劑、泡沫劑、或噴霧制劑存在，除了其活性成分之外，還包含本領(lǐng)域中已知合適的那些載體。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該了解，除了上述藥物組合物之外，本發(fā)明的發(fā)明物質(zhì)還可以配制為包含復(fù)合物，諸如環(huán)糊精包含復(fù)合物，或脂質(zhì)體。為了達(dá)到本發(fā)明的目的，施用的本發(fā)明物質(zhì)的量或劑量應(yīng)該在合理時(shí)間范圍內(nèi)在受試者或動(dòng)物內(nèi)產(chǎn)生例如治療或預(yù)防響應(yīng)。例如，本發(fā)明物質(zhì)的劑量應(yīng)該足以在從施用時(shí)亥Ij起約2小時(shí)以上如12-24小時(shí)或更長(zhǎng)的時(shí)間期間內(nèi)，抑制患病細(xì)胞的増殖，起到治療或預(yù) 防疾病(例如，腫瘤，癌癥等)的作用。在某些實(shí)施方案中，所述時(shí)間期間甚至可以更長(zhǎng)。齊U量應(yīng)該由特定的本發(fā)明物質(zhì)的功效和待治療的動(dòng)物(例如，人)的狀況，以及動(dòng)物(例如，人)的體重所確定。確定施用劑量的許多測(cè)定方法是本領(lǐng)域內(nèi)已知的。本發(fā)明物質(zhì)的劑量還將通過(guò)施用特定的本發(fā)明物質(zhì)可能伴隨的任何副作用的存在、性質(zhì)和程度而確定。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)該容易理解，本發(fā)明物質(zhì)可以以任何方式修飾，以提高本發(fā)明物質(zhì)的治療或預(yù)防功效。例如，本發(fā)明物質(zhì)可以直接或通過(guò)連接體間接與靶向的部分綴合。使化合物，例如，本發(fā)明物質(zhì)，與靶向部分綴合的實(shí)踐，在本領(lǐng)域內(nèi)是公知的。如參見(jiàn)，Wadwa等，藥物革巴向雜志(J. Drug Targeting), 3 :111, (1995)和美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5，087，616。再另ー個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明物質(zhì)可以被修飾成貯存庫(kù)形式，以便使本發(fā)明物質(zhì)釋放到其所施用的體內(nèi)的方式在時(shí)間和體內(nèi)部位方面受到控制(參見(jiàn)，例如，美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4，450，150)。本發(fā)明物質(zhì)的貯存庫(kù)形式可以是，例如，包括本發(fā)明物質(zhì)和多孔或非多孔物質(zhì)如聚合物的可植入組合物，其中本發(fā)明物質(zhì)通過(guò)所述物質(zhì)和/或所述非多孔物質(zhì)的降解而擴(kuò)散。然后，將貯存庫(kù)植入體內(nèi)的理想部位，并且本發(fā)明物質(zhì)以預(yù)先確定的速率從所述植入物釋放。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解，本發(fā)明提供的防止和抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)和増殖的方法，包括使患病細(xì)胞與具有有效抑制量的本發(fā)明所述的任意藥物組合物接觸?？梢圆捎萌我獬Ｒ?guī)的方法將本發(fā)明所述藥物組合物傳遞給癌細(xì)胞。在本發(fā)明方法的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，將所述藥物組合物通過(guò)局部施用給宿主。在另ー個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述藥物組合物直接施用到癌細(xì)胞，例如，腫瘤內(nèi)遞送。本發(fā)明的藥物組合物，包含多肽(包括功能片段和功能變體)以及肽模擬物、核酸、重組表達(dá)載體、和/或宿主細(xì)胞，可以用在防止和抑制こ型肝炎病毒感染誘發(fā)的慢性肝病，包括肝炎，以及由此產(chǎn)生的肝硬變和肝癌的方法中。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)該容易理解，本發(fā)明所述的由こ型肝炎病毒誘發(fā)的慢性肝病可以存在于任何宿主中。優(yōu)選地，所述宿主是哺乳動(dòng)物。特別優(yōu)選地，所述宿主是人。下面結(jié)合具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明作進(jìn)ー步的闡述說(shuō)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不在于限制本發(fā)明的范圍。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法；所用的材料，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為自常規(guī)生化試劑公司購(gòu)買(mǎi)得到的。
實(shí)施例一多肽的設(shè)計(jì)和制備人工合成多肽功能片段anti-HBxPl# 本發(fā)明用人工合成的方法合成了氨基酸序列為Gly-Ser-Ala-Val-Met-Phe-Ser-Ser-Lys-Glu-Arg-Gly(SEQ ID NO: I)的多肽(以下稱(chēng)anti-HBxPl#)。該多肽的制備采用固相合成方法，如應(yīng)用AAPPTECApex396型多肽合成儀器(購(gòu)自香港環(huán)球分析測(cè)試儀器有限公司)，在密閉的防爆玻璃反應(yīng)器中使氨基酸按SEQ ID NO :1所示的序列，從C端-羧基端向N端-氨基端，這是指第一個(gè)被加入到該氨基酸序列Gly-Ser-Ala-Val-Met-Phe-Ser-Ser-Lys-Glu-Arg-Gly的氨基酸單體是C末端的Gly,然后再是Arg,再是Glu,—直到最后的Ser以及N末端的Gly，不斷添加、反應(yīng)、合成，操作最終得到所要具有的氨基酸序列。固相合成法，大大的減輕了每步產(chǎn)品提純的難度。為了防止副反應(yīng)的發(fā)生，參加反應(yīng)的氨基酸的側(cè)鏈都是受保護(hù)的。羧基端是游離的，并且在反應(yīng)之前必須活化。具體合成由下列幾個(gè)循環(huán)組成
I)去保護(hù)Fmoc保護(hù)的柱子和單體必須用ー種堿性溶劑(piperidine)去除氨基的保護(hù)基團(tuán)。2)激活和交聯(lián)下一個(gè)氨基酸的羧基被一種活化劑所活化。活化的單體與游離的氨基反應(yīng)交聯(lián)，形成肽鍵。在此步驟使用大量的超濃度試劑驅(qū)使反應(yīng)完成。循環(huán)這兩步反應(yīng)反復(fù)循環(huán)直到合成完成。3)洗脫和脫保護(hù)多肽從柱上洗脫下來(lái)，其保護(hù)基團(tuán)被ー種脫保護(hù)劑(TFA)洗脫和脫保護(hù)。從C端(羧基端)向N端(氨基端)合成,把C端的第一個(gè)氨基酸Gly固定在樹(shù)脂上，脫去Gly氨基酸的保護(hù)基團(tuán)，并活化下一個(gè)氨基酸Arg的羧基端，使之發(fā)生縮和反應(yīng)，以此類(lèi)推到合成完最后一個(gè)氨基酸后，從樹(shù)脂上切割下來(lái)，粗肽經(jīng)HPLC純化，獲得98%純度的anti-HBxPl#，最后通過(guò)質(zhì)譜做進(jìn)ー步的鑒定，其分子量為1256. 50Kd。在固相合成中，肽鏈的延長(zhǎng)是在不溶性的聚苯こ烯樹(shù)脂載體上進(jìn)行的。合成多肽的C-末端先和氯甲基聚苯こ烯樹(shù)脂(氯化芐酯樹(shù)脂)反應(yīng)形成芐酯，然后按肽鏈一級(jí)結(jié)構(gòu)的順序?qū)被艘驯槐Ｗo(hù)的氨基酸逐個(gè)加上去，使肽鏈延長(zhǎng)。人工合成多肽anti-HBxPl#用高壓液相色譜(HPLC)(應(yīng)用PLCAgela C18柱)分析，顯示所獲得的純度為98. 997% (圖I)。實(shí)施例ニ 離體(in vitro)多肽的抗HBx活性采用兩種方法檢測(cè)離體情況下實(shí)施例一中的多肽的抗HBx的活性第一種方法是采用分子克隆技術(shù)，將表達(dá)實(shí)施例一中的多肽的cDNA克隆在真核表達(dá)載體pcDNA3. 1(+)上，通過(guò)基因轉(zhuǎn)染，在肝癌細(xì)胞內(nèi)實(shí)現(xiàn)表達(dá)所研究多肽的目的，進(jìn)而觀察所研究的多肽抑制HBx的效果；第二種方法是采用人工合成的多肽，直接加入到培養(yǎng)肝癌細(xì)胞的培養(yǎng)液中，觀察多肽抑制HBx的效果。實(shí)驗(yàn)中采用的肝癌細(xì)胞有兩種一種為組成型表達(dá)HBx的肝癌HepG2_X細(xì)胞(穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HBx的肝癌H印G2細(xì)胞);一種為組成型表達(dá)こ肝病毒全基因的肝癌H印G2. 2. 15細(xì)胞(穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HBV全基因的肝癌H印G2細(xì)胞)。由于HBx具有激活轉(zhuǎn)錄因子NF-κ B的作用，通過(guò)熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)方法，在分子水平檢測(cè)HBx是否受到抑制；由于HBx在肝癌細(xì)胞中具有促進(jìn)肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)和増殖的作用，可以通過(guò)3- (4，5- ニ甲基-2-噻唑)-2，5- ニ苯基四氮唑溴鹽(MTT)檢測(cè)實(shí)施例一中的多肽對(duì)上述H印G2-X細(xì)胞和H印G2. 2. 15細(xì)胞增殖的影響。A.多肽真核表達(dá)載體的構(gòu)建I.主要材料I)菌株Ε· coli DH5a (購(gòu)自原平皓(天津)生物技術(shù)有限公司)質(zhì)粒pcDNA3.I (+)(購(gòu)自 Invitrogen), pEGFP_C2 (購(gòu)自 Invitrogen)2.主要試劑
權(quán)利要求
1.分離的多肽或肽模擬物，其包含如SEQID NO :1所示的氨基酸序列、或其功能片段或功能變體，所述多肽或肽模擬物具有抑制こ型肝炎病毒X蛋白的功能，井能抑制こ型肝炎病毒感染后的慢性肝病的發(fā)生和發(fā)展。
2.權(quán)利要求I所述的多肽或肽模擬物，所述こ肝病毒感染后的慢性肝病包括肝炎、肝硬變和肝癌。
3.權(quán)利要求I所述的多肽或肽模擬物，其包含的氨基酸序列、其功能片段或功能變體具有與SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列至少70%的相同性。
4.權(quán)利要求I所述的多肽或肽模擬物，其包含的氨基酸序列、其功能片段或功能變體具有與SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列至少80%的相同性。
5.權(quán)利要求I所述的多肽或肽模擬物，其包含的氨基酸序列、其功能片段或功能變體具有與SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列至少90%的相同性。
6.權(quán)利要求I所述的多肽或肽模擬物，其包含如SEQID NOs :1_6中所不的任ー種氨基酸序列。
7.分離的多核苷酸，所述多核苷酸包含選自下組中的ー種 a)編碼SEQID NO :1所示的氨基酸序列、其功能片段或功能變體的多核苷酸；或者 b)與多核苷酸a)互補(bǔ)或嚴(yán)格雜交的多核苷酸。
8.權(quán)利要求7的多核苷酸,所述多核苷酸包含選自下組中的ー種 a)編碼SEQID NOs :1_6所示的任一種氨基酸序列的多核苷酸；或者 b)與多核苷酸a)互補(bǔ)或嚴(yán)格雜交的多核苷酸。
9.重組表達(dá)載體,其包含權(quán)利要求7或8所述的多核苷酸。
10.包括如權(quán)利要求9所述的重組表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。
11.權(quán)利要求1-6中任一所述多肽在制造抗こ肝病毒感染后的慢性肝病的藥物中的應(yīng)用。
12.權(quán)利要求7-8中任一所述核苷酸在制造抗こ肝病毒感染后的慢性肝病的藥物中的應(yīng)用。
13.權(quán)利要求9中所述重組表達(dá)載體在制造抗こ肝病毒感染后的慢性肝病的藥物中的應(yīng)用。
14.權(quán)利要求11-13中的任ー種應(yīng)用，所述應(yīng)用為制造抗こ型肝炎的治療性疫苗。
15.藥物組合物，其包含權(quán)利要求1-6中任一所述的多肽或肽模擬物，以及任選的藥物載體。
16.藥物組合物，其包含權(quán)利要求7-8中任一所述的多核苷酸，以及任選的藥物載體。
17.藥物組合物，其包含權(quán)利要求9中所述的重組表達(dá)載體，以及任選的藥物載體。
全文摘要
本發(fā)明涉及多肽藥物領(lǐng)域，具體涉及抗乙型肝炎病毒X蛋白的多肽和編碼此多肽的多核苷酸，以及它們的應(yīng)用。具體來(lái)說(shuō)，本發(fā)明涉及一種具有抑制乙型肝炎病毒X蛋白(hepatitis B virus X protein，HBx)功能活性的多肽，其在分子水平、細(xì)胞水平和動(dòng)物水平上具有抑制HBx的活性，因而能抑制乙型肝炎病毒感染所造成的肝炎，由肝炎反復(fù)發(fā)作引起的肝硬變，以及在肝硬變基礎(chǔ)上發(fā)生的肝癌。該多肽和它的肽模擬物，包括它們的功能片段和功能變體，以及編碼這些多肽、肽模擬物或它們的功能片段、功能變體的基因，可廣泛用于防治乙型肝炎感染后的肝病，包括肝炎、肝硬變和肝癌。
文檔編號(hào)A61K48/00GK102675422SQ201110061840
公開(kāi)日2012年9月19日 申請(qǐng)日期2011年3月15日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月15日
發(fā)明者葉麗虹, 張曉東 申請(qǐng)人:天津托普泰克生物科技有限公司