一種量子點(diǎn)標(biāo)記包膜病毒核衣殼的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種量子點(diǎn)標(biāo)記包膜病毒核衣殼的方法。將融合了生物素受體肽序列的衣殼蛋白序列和催化受體肽生物素化的酶序列同時(shí)插入到病毒全基因組，得到重組病毒質(zhì)粒，借助病毒質(zhì)粒在宿主細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制過(guò)程實(shí)現(xiàn)核衣殼的生物素化，繼而采用偶聯(lián)有鏈霉親和素的量子點(diǎn)實(shí)現(xiàn)對(duì)包膜病毒核衣殼的標(biāo)記。本發(fā)明無(wú)需通過(guò)劇烈的化學(xué)反應(yīng)改造和標(biāo)記病毒，有利于保持病毒本身的侵染活性，且包膜病毒內(nèi)部核衣殼的標(biāo)記不影響包膜病毒表面及其對(duì)細(xì)胞的識(shí)別。本發(fā)明可應(yīng)用于病毒侵染機(jī)理研究及與病毒相關(guān)的疾病治療研究。
【專利說(shuō)明】一種量子點(diǎn)標(biāo)記包膜病毒核衣殼的方法
[0001]
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002]本發(fā)明屬于化學(xué)和生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，涉及一種量子點(diǎn)標(biāo)記包膜病毒核衣殼的方法。【背景技術(shù)】
[0003]病毒侵染細(xì)胞機(jī)制研究對(duì)預(yù)防和治療病毒引起的疾病至關(guān)重要，對(duì)活病毒的熒光標(biāo)記可以為研究病毒侵染機(jī)制提供重要基礎(chǔ)。傳統(tǒng)的熒光標(biāo)記物往往存在易光漂等缺點(diǎn)，而半導(dǎo)體熒光量子點(diǎn)具有獨(dú)特的光學(xué)性能，如熒光量子產(chǎn)率高、激發(fā)光譜寬、發(fā)射光譜窄等，因此近年來(lái)出現(xiàn)了許多采用量子點(diǎn)標(biāo)記病毒的方法。包膜病毒廣泛存在于自然界并且與人類健康密切相關(guān)，因此在相關(guān)研究中受到極大關(guān)注。然而，目前還只能實(shí)現(xiàn)量子點(diǎn)對(duì)包膜病毒表面包膜的標(biāo)記，可能干擾病毒對(duì)細(xì)胞受體的識(shí)別及影響病毒的侵染活性，因此采用量子點(diǎn)標(biāo)記包膜病毒內(nèi)部的核衣殼是一種更優(yōu)選擇。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題在于針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足提供一種量子點(diǎn)標(biāo)記包膜病毒核衣殼的方法。
[0005]本發(fā)明利用包膜病毒基因組允許外源基因插入和在宿主細(xì)胞內(nèi)自我復(fù)制的特點(diǎn)，構(gòu)建了重組病毒基因組質(zhì)粒。將這種質(zhì)粒轉(zhuǎn)染其宿主細(xì)胞，核衣殼能夠在病毒組裝過(guò)程中被生物素化并出芽帶上包膜，從而獲得帶有生物素化核衣殼的重組包膜病毒。利用生物素和鏈霉親和素的相互作用，用偶聯(lián)有鏈酶親和素的量子點(diǎn)標(biāo)記重組病毒，實(shí)現(xiàn)量子點(diǎn)對(duì)活包膜病毒核衣殼的標(biāo)記(如圖1所示)。
[0006]本發(fā)明方法具體包括如下步驟:
1.將融合了生物素受體肽序列的衣殼蛋白序列和催化受體肽生物素化的酶序列同時(shí)插入到病毒全基因組，得到重組病毒質(zhì)粒；
2.用重組病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，細(xì)胞全部出現(xiàn)病變時(shí)收集細(xì)胞上清液并純化和濃縮得到重組病毒；
3.將重組病毒與細(xì)胞裂解液孵育至病毒液開(kāi)始由渾濁變澄清，得到脫去部分包膜的病
毒；
4.將偶聯(lián)有鏈酶親和素的量子點(diǎn)與部分脫膜的重組病毒孵育以標(biāo)記病毒，純化得到核衣殼標(biāo)記了量子點(diǎn)的包膜病毒。
[0007]對(duì)標(biāo)記了量子點(diǎn)的病毒的純化通過(guò)蔗糖密度梯度離心實(shí)現(xiàn)。
[0008]所述的酶序列為BirA酶序列。
[0009]本發(fā)明的實(shí)施例中，使用的包膜病毒為桿狀病毒，宿主細(xì)胞為Sf9細(xì)胞。
[0010]將濃縮的重組桿狀病毒在含有0.8% NP40的10 mM pH 8.5的Tris緩沖溶液中孵育15min,得到脫去部分包膜的桿狀病毒。[0011]將2 nM偶聯(lián)有鏈霉未和素的量子點(diǎn)(SA-QDs)與脫去部分包膜的重組桿狀病毒在4° C下孵育30分鐘，即可實(shí)現(xiàn)量子點(diǎn)對(duì)重組桿狀病毒核衣殼的標(biāo)記。
[0012]本發(fā)明借助病毒在宿主細(xì)胞內(nèi)的自我復(fù)制過(guò)程實(shí)現(xiàn)病包膜毒核衣殼的生物素化，繼而用偶聯(lián)有鏈酶親和素的量子點(diǎn)進(jìn)行反應(yīng)，從而實(shí)現(xiàn)了量子點(diǎn)對(duì)包膜病毒核衣殼的標(biāo)記。所構(gòu)建的重組病毒可以作為毒種長(zhǎng)期保存，通過(guò)簡(jiǎn)單擴(kuò)增就可以得到子代病毒并直接用于標(biāo)記。與其它的包膜病毒標(biāo)記方法相比，本發(fā)明方法更加溫和，無(wú)需通過(guò)劇烈的化學(xué)反應(yīng)改造和標(biāo)記病毒，保持了包膜病毒本身的侵染活性，且病毒內(nèi)部核衣殼的標(biāo)記不干擾包膜病毒表面對(duì)細(xì)胞受體的識(shí)別，有利于病毒對(duì)細(xì)胞的侵染過(guò)程的研究。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0013]圖1為量子點(diǎn)標(biāo)記病毒核衣殼的流程不意圖。
[0014]圖2為證明病毒核衣殼被生物素化的western blot圖。
[0015]圖3為重組桿狀病毒被標(biāo)記上量子點(diǎn)(A)及野生型病毒未被標(biāo)記上量子點(diǎn)(B)的透射電子顯微鏡圖，標(biāo)尺為100 nm。
[0016]圖4為標(biāo)記了量子點(diǎn)的重組桿狀病毒QDs-RBV和野生型桿狀病毒W(wǎng)BV的一步生長(zhǎng)曲線比較圖。
[0017]圖5為吸附在細(xì)胞表面的病毒與量子點(diǎn)的免疫熒光共定位圖,標(biāo)尺為10 μ mo【具體實(shí)施方式】
[0018]以下實(shí)施例僅用于進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，但不應(yīng)理解為對(duì)本發(fā)明的限制。
[0019]實(shí)施例1量子點(diǎn)標(biāo)記重組桿狀病毒核衣殼
下面以桿狀病毒核衣殼的量子點(diǎn)標(biāo)記為例，對(duì)本發(fā)明方法進(jìn)行詳細(xì)的說(shuō)明。
[0020]一、方法
1.重組桿狀病毒質(zhì)粒的構(gòu)建:利用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)，在桿狀病毒全基因組里同時(shí)插入VP39AP序列(融合了生物素受體肽AP序列的桿狀病毒衣殼蛋白VP39序列)和能夠催化AP生物素化的BirA酶序列，從而得到具有重組桿狀病毒全基因組的質(zhì)粒。
[0021]2.獲得純化的重組桿狀病毒RBV:用轉(zhuǎn)染試劑將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到宿主Sf9細(xì)胞中，72小時(shí)后細(xì)胞全部出現(xiàn)病變時(shí)收集細(xì)胞上清液，4° C下通過(guò)15 min的5000 rpm離心獲得第一代重組桿狀病毒。用第一代重組桿狀病毒侵染Sf9細(xì)胞,72小時(shí)后將所得上清液重復(fù)上述離心獲得第二代病毒。用第二代病毒侵染Sf9細(xì)胞,72小時(shí)后將所得上清液重復(fù)上述離心、0.45 μ m濾膜過(guò)濾及2小時(shí)的100000 g超速離心，獲得純化后的濃縮病毒。
[0022]3.脫去病毒部分包膜:在濃縮的重組桿狀病毒溶液中加入含有0.8% (質(zhì)量比)NP40的10 mM pH 8.5的Tris緩沖溶液，孵育15min病毒液開(kāi)始由渾濁變澄清時(shí)立即用150000 g超速離心I小時(shí)。用10 mM pH 7.0的PBS緩沖溶液重懸，得到脫去部分包膜的重組桿狀病毒。
[0023]4.量子點(diǎn)標(biāo)記重組桿狀病毒核衣殼:將2 nM偶聯(lián)有鏈霉未和素的量子點(diǎn)(SA-QDs)與部分脫去包膜的重組桿狀病毒在4° C下孵育30分鐘后，加入到w/v分別為65%、55%、45%、35%、25%、15%的蔗糖梯度中，進(jìn)行3小時(shí)120000 g的超速離心。將收集的病毒條帶溶解在PBS緩沖溶液中，再在120000 g下超速離心45分鐘除去殘余的蔗糖，得到純化的核衣殼上標(biāo)記了量子點(diǎn)的重組桿狀病毒QDs-RBV。
[0024]二、結(jié)果
1.RBV的western blot表征:在本發(fā)明中，重組桿狀病毒RBV通過(guò)轉(zhuǎn)染構(gòu)建的重組質(zhì)粒而獲得。采用桿狀病毒衣殼蛋白VP39的抗體進(jìn)行western blot實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示重組桿狀病毒RBV樣品同時(shí)在41KDa (VP39AP的大小)和39KDa (VP39的大小)處出現(xiàn)條帶(圖2A)，但野生型桿狀病毒W(wǎng)BV樣品僅在41KDa (VP39AP的大小)處出現(xiàn)條帶(圖2A);采用鏈霉親和素標(biāo)記的堿性磷酸酶進(jìn)行western blot實(shí)驗(yàn),僅重組桿狀病毒RBV樣品在41KDa處出現(xiàn)條帶(圖2B)，表明重組桿狀病毒RBV的核衣殼被成功生物素化。 [0025]2.QDs-RBV的透射電子顯微鏡表征:為了更直觀地證明RBV被標(biāo)記上量子點(diǎn)，采用透射電子顯微鏡對(duì)經(jīng)量子點(diǎn)標(biāo)記的重組桿狀病毒RBV (QDs-RBV)和與量子點(diǎn)孵育的野生型桿狀病毒(WBV)進(jìn)行了觀察。結(jié)果表明量子點(diǎn)被連接在重組桿狀病毒RBV上(圖3A)，而WBV不能被量子點(diǎn)標(biāo)記(圖3B)，說(shuō)明生物素化的重組桿狀病毒核衣殼能夠被量子點(diǎn)標(biāo)記，且該標(biāo)記是特異性的。
[0026]3.一步生長(zhǎng)曲線表征:將QDs-RBV以感染復(fù)數(shù)M0I=5感染Sf9細(xì)胞，分別收集感染不同時(shí)間后的細(xì)胞上清液，采用半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量(TCID50 )方法測(cè)定每個(gè)上清液的滴度。以每個(gè)時(shí)間點(diǎn)平行測(cè)定三次的平均值作為縱坐標(biāo)，時(shí)間點(diǎn)為橫坐標(biāo)繪制一步生長(zhǎng)曲線，對(duì)野生型病毒W(wǎng)BV以相同操作繪制一步生長(zhǎng)曲線作為對(duì)照(圖4)。結(jié)果顯示QDs-RBV與WBV的生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)行為一致,表明本發(fā)明方法能夠保持病毒本身的侵染特性。
[0027]4.標(biāo)記可靠性及標(biāo)記效率的表征:為了進(jìn)一步證明本發(fā)明方法能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)病毒核衣殼的標(biāo)記，將感染復(fù)數(shù)M0I=5的QDs-RBV與Sf9細(xì)胞孵育并采用免疫熒光共定位實(shí)驗(yàn)進(jìn)行觀察。圖5顯示，QDs-RBV樣品中量子點(diǎn)與病毒核衣殼蛋白VP39的共定位效率達(dá)到94%，而對(duì)照組WBV中沒(méi)有量子點(diǎn)與VP39共定位現(xiàn)象，表明量子點(diǎn)被標(biāo)記到了生物素化的重組桿狀病毒核衣殼上，且該標(biāo)記具有很強(qiáng)的特異性和很高的標(biāo)記效率。
【權(quán)利要求】
1.一種量子點(diǎn)標(biāo)記包膜病毒核衣殼的方法，其特征在于，包括如下步驟: 1)將融合了生物素受體肽序列的衣殼蛋白序列和催化受體肽生物素化的酶序列同時(shí)插入到病毒全基因組，得到重組病毒質(zhì)粒； 2)用重組病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，細(xì)胞全部出現(xiàn)病變時(shí)收集細(xì)胞上清液并純化和濃縮得到重組病毒； 3)將重組病毒與細(xì)胞裂解液孵育至病毒液開(kāi)始由渾濁變澄清，得到脫去部分包膜的病毒; 4)將偶聯(lián)有鏈酶親和素的量子點(diǎn)與部分脫膜的重組病毒孵育以標(biāo)記病毒，純化得到核衣殼標(biāo)記了量子點(diǎn)的包膜病毒。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，對(duì)標(biāo)記了量子點(diǎn)的病毒的純化通過(guò)蔗糖密度梯度離心實(shí)現(xiàn)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的酶序列為BirA酶序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述包膜病毒為桿狀病毒，宿主細(xì)胞為Sf9細(xì)胞。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，將濃縮的重組桿狀病毒在含有0.8% NP40的10 mM pH 8.5的Tris緩沖溶液中孵育15 min，得到脫去部分包膜的桿狀病毒。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的方法，其特征在于，將2nM偶聯(lián)有鏈霉親和素的量子點(diǎn)與脫去部分包膜的重組桿狀病毒在4° C下孵育30分鐘,實(shí)現(xiàn)量子點(diǎn)對(duì)重組桿狀病毒核衣殼的標(biāo)記。
【文檔編號(hào)】C12N7/01GK103555681SQ201310592905
【公開(kāi)日】2014年2月5日 申請(qǐng)日期:2013年11月22日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月22日
【發(fā)明者】龐代文, 文莉, 林毅, 張志凌, 王漢中 申請(qǐng)人:武漢大學(xué)