專利名稱：一種蕎麥胰蛋白酶抑制劑的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及胰蛋白酶抑制劑，具體屬于一種胰蛋白酶抑制劑的新用途，即蕎麥胰蛋白酶抑制劑作為細(xì)胞自噬誘導(dǎo)劑的應(yīng)用，蕎麥胰蛋白酶抑制劑在制備抗衰老藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
細(xì)胞自噬是細(xì)胞為了抵抗饑餓和外界壓力而發(fā)展的一種降解機(jī)制，通過細(xì)胞自噬途徑，一些長周期蛋白，胞質(zhì)內(nèi)聚集的蛋白和損傷的細(xì)胞器被降解，為細(xì)胞提供必要的營養(yǎng)，從而使細(xì)胞存活。細(xì)胞自噬在細(xì)胞發(fā)育分化到死亡的全部過程中都起著非常重要的作用。
衰老(aging，senescence)又稱老化，通常是指在正常狀況下生物發(fā)育成熟后，隨 年齡增加，內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定能力與應(yīng)激能力下降，結(jié)構(gòu)、組分逐步退行性變，趨向死亡的不可逆轉(zhuǎn)的現(xiàn)象。衰老是一個持續(xù)的、動態(tài)的、緩慢漸進(jìn)而復(fù)雜的過程。這個過程從生長期結(jié)束后逐漸開始，它的影響要到老年期，通過人體系統(tǒng)功能失調(diào)、器官功能衰退、細(xì)胞變性及蛋白質(zhì)和酶分子結(jié)構(gòu)變化逐漸表現(xiàn)出來。隨著研究的不斷深入，越來越多的資料表明，許多老年人的常見病，如神經(jīng)退行性疾病，心肌衰老，腫瘤，免疫衰老，糖尿病，肌肉疾病等，都伴隨著自曬缺乏。細(xì)胞自噬與衰老有著密切的關(guān)系。近年來的研究表明，生物體衰老過程中伴隨著大量受損大分子，病變細(xì)胞器以及異常蛋白在細(xì)胞內(nèi)的囤積，這些由氧化性損傷或其他因素導(dǎo)致的受損物質(zhì)，得不到及時的清除，將促使細(xì)胞衰老過程的發(fā)展。真核細(xì)胞中存在著兩類主要的蛋白質(zhì)降解途徑，即泛素-蛋白酶體系統(tǒng)和自噬-溶酶體系統(tǒng)。自噬-溶酶體系統(tǒng)參與了衰老的調(diào)控。自噬是廣泛存在于真核細(xì)胞中的生命現(xiàn)象，是指細(xì)胞通過單層或雙層膜包裹待降解物質(zhì)，形成自噬體，然后自噬體和溶酶體融合形成自噬溶酶體，進(jìn)而溶酶體內(nèi)的酶將自噬體的內(nèi)容物降解，以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞本身的代謝需要和某些細(xì)胞器的更新。對防止神經(jīng)退行性病變、腫瘤、心肌病、病原微生物侵入感染等疾病以及對防止老化、延長壽命有積極作用，在真核生物維護(hù)內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定以及應(yīng)對細(xì)胞內(nèi)外代謝壓力起著重要的作用。這些由氧化性損傷或其他因素導(dǎo)致的受損物質(zhì)，得不到及時的清除，將促使細(xì)胞衰老過程的發(fā)展。研究表明，在衰老細(xì)胞內(nèi)和生物體內(nèi)細(xì)胞的自噬水平被抑制，這些受損物質(zhì)不能得到有效清除，如很多老年人皮膚上的老年斑就是脂褐素蓄積的結(jié)果。調(diào)控衰老的信號通路與自噬相互協(xié)調(diào)，負(fù)責(zé)細(xì)胞內(nèi)大分子物質(zhì)和細(xì)胞器的周轉(zhuǎn)代謝，調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長，分化和細(xì)胞在營養(yǎng)匱乏和氧化應(yīng)激條件下的反應(yīng)。目前，一種可以誘導(dǎo)細(xì)胞自噬的誘導(dǎo)劑雷帕霉素已經(jīng)初步應(yīng)用于抗衰老的研究，但是，雷帕霉素副作用較大，對免疫系統(tǒng)會產(chǎn)生毒副作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種蕎麥胰蛋白酶抑制劑的新用途，即將蕎麥胰蛋白酶抑制劑作為細(xì)胞自噬誘導(dǎo)劑的應(yīng)用，蕎麥胰蛋白酶抑制劑在制備抗衰老藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明所述的蕎麥胰蛋白酶抑制劑(rBTI)，其蛋白質(zhì)含有69個氨基酸殘基，屬于PotatoI型蛋白酶抑制劑，其氨基酸序列為SEQ ID NO :1。所述的蕎麥胰蛋白酶抑制劑的氨基酸序列已經(jīng)在中國專利200510012385. 4中公開。本發(fā)明提供的一種蕎麥胰蛋白酶抑制劑作為細(xì)胞自噬誘導(dǎo)劑的應(yīng)用，蛋白酶抑制齊U，當(dāng)培養(yǎng)基中其濃度為20-100 μ g/ml時即可顯著地誘導(dǎo)H印G2等細(xì)胞的自噬水平升高。本發(fā)明提供的一種蕎麥胰蛋白酶抑制劑在制備抗衰老藥物中的應(yīng)用，實(shí)驗(yàn)證明，蕎麥胰蛋白酶抑制劑可以提高果蠅體內(nèi)SOD和CAT的酶活性，在培養(yǎng)基中rBTI的濃度達(dá)到50 μ g/ml時培養(yǎng)20天后，果蠅體內(nèi)SOD和CAT的活性相對于對照組，雄性提高了 33. 23%和35. 30%,雌性提高了 27. 67%, 30. 86%。由rBTI 50 μ g/ml的培養(yǎng)基所飼養(yǎng)的果蠅雌性平均壽命相對與對照組提高了 30. 5%，雄性果蠅平均壽命相對對照組提高了 35. 00%。本發(fā)明將蕎麥胰蛋白酶抑制劑作為細(xì)胞自噬誘導(dǎo)劑，具有良好的誘導(dǎo)細(xì)胞自噬的功能，且無毒副作用，將蕎麥胰蛋白酶抑制劑用在抗衰老，延長壽命方面也具有明顯的作用。


圖I激光共聚焦顯微鏡觀察rBTI誘導(dǎo)H印G2細(xì)胞自噬圖，其中A為對照，B為 50 μ g/mlrBTI 誘導(dǎo) Hep G2 細(xì)胞 2h, C 為 50 μ g/ml rBTI 誘導(dǎo) Hep G2 細(xì)胞 4h.圖2流式細(xì)胞術(shù)定量檢測不同濃度的rBTI誘導(dǎo)H印G2細(xì)胞自噬圖
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I :rBTI可以誘導(dǎo)H印G2細(xì)胞自噬實(shí)驗(yàn)LC3是可以定位于前自噬體和自噬體膜表面，是細(xì)胞自噬泡膜的通用標(biāo)記物。通過構(gòu)建LC3與綠色熒光蛋白(GFP)或其衍生物的融合蛋白，借助于熒光顯微鏡，我們可以很方便的觀察到LC3在細(xì)胞中的定位。pCMV-GFP-LC3在E. coli.DH5a中表達(dá)，經(jīng)無內(nèi)毒素試劑盒提取后進(jìn)行如下轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)(I)轉(zhuǎn)染前一天種板，密度為f4X105cell/ml，保證轉(zhuǎn)染時細(xì)胞匯合度達(dá)到90-95%。(2)轉(zhuǎn)染步驟A:4. O μ g質(zhì)粒DNA用無血清DMEM稀釋至250 μ 1，混合均勻。B: 10 μ I Lipofectamine TM 2000 用無血清 DMEM稀釋至 250 μ I,混合均勻，室溫放置5分鐘。C:將步驟A和B溶液等量混合，室溫放置20分鐘。(3)將上述混合液加入待轉(zhuǎn)染的細(xì)胞培養(yǎng)液中混合均勻。(4) 37°C，5%C02,飽和濕度培養(yǎng)24小時，轉(zhuǎn)染后4_6小時更換新鮮培養(yǎng)液。(5)將轉(zhuǎn)染好的細(xì)胞用胰酶消化后，加入到鋪有蓋玻片的6孔板中，過夜貼壁培養(yǎng)。(6)加入 50 μ g/ml rBTI,分別作用 0-4 小時。(7)取出蓋玻片，干燥，加抗熒光衰減封片劑，用指甲油封避，顯微鏡下觀察。實(shí)驗(yàn)結(jié)果
當(dāng)轉(zhuǎn)染pCMV-GFP-LC3載體的H印G2細(xì)胞，經(jīng)rBTI作用后，GFP-LC3開始聚集，形成明亮的點(diǎn)，即可表明rBTI誘導(dǎo)H印G2細(xì)胞發(fā)生了自噬。當(dāng)H印G2細(xì)胞未經(jīng)誘導(dǎo)時，GFP-LC3以彌散狀態(tài)存在(圖1A)，當(dāng)50 μ g/ml rBTI誘導(dǎo)H印G2細(xì)胞2小時，細(xì)胞內(nèi)GFP-LC3蛋白開始聚集，形成明亮的點(diǎn)(圖1B)。當(dāng)誘導(dǎo)時間為4小時，GFP-LC3蛋白聚集越來越多，分布在整個細(xì)胞胞質(zhì)中(圖1C)。實(shí)施例2 .流式細(xì)胞術(shù)定量檢測Ifep G2細(xì)胞自噬實(shí)驗(yàn)步驟Enzo Life Sciences自曬檢測試劑盒Cyto-ID ,它可以快速,特異,定量地檢測細(xì)胞自噬。人肝癌細(xì)胞株Hep G2，在37°C，5%C02的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞不宜太過擁擠。具體實(shí)驗(yàn)步驟如下(I)接種細(xì)胞用含10%胎牛血清的培養(yǎng)液配成單個細(xì)胞懸液，加入合適數(shù)量的細(xì) 胞接種到6孔板，每孔體積1ml，貼壁后細(xì)胞大概匯合度為90%。(2)加入不同濃度的rBTI及陽性對照藥物(Tamoxifen)，使rBTI的終濃度分別為100，50，25 和 12. 5 μ g/ml, Tamoxifen 終濃度為 5 μ m，在 37°C，5%C02 的培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 18 小時。(3)胰酶消化，收集細(xì)胞，2000rmp離心，用試劑盒中的緩沖液重懸細(xì)胞，加入稀釋好的 Cyto-ID Green Detection Reagent, 37°C暗處孵育 30 小時。(4)流式細(xì)胞儀分析樣品。實(shí)驗(yàn)結(jié)果應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)及細(xì)胞自噬測定試劑盒，可以檢測在不同rBTI濃度作用下，HepG2細(xì)胞的自噬程度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，經(jīng)不同濃度的rBTI誘導(dǎo)后，Hep G2細(xì)胞的自噬活性明顯增強(qiáng)，而且隨著rBTI濃度的增加，細(xì)胞自噬程度也越來越明顯。由圖2可看出，當(dāng)rBTI的濃度從12. 5 μ g/ml增加到100 μ g/ml時，Hep G2細(xì)胞的熒光強(qiáng)度變化不太明顯，但是相比對照，熒光強(qiáng)度有很大的增強(qiáng)，并且rBTI濃度為12. 5 μ g/ml時的熒光強(qiáng)度比陽性對照(Tamoxfen)處理組高出約60%。說明，rBTI可以誘發(fā)細(xì)胞產(chǎn)生很強(qiáng)的自噬活性。實(shí)施例3 rBTI可以明顯延長果蠅壽命并刺激相關(guān)酶的表達(dá)rBTI對果蜆壽命的影響實(shí)驗(yàn)步驟收集4小時內(nèi)新羽化的果蠅成蟲，乙醚麻醉下區(qū)分雌雄，取雌、雄果蠅各240只，隨機(jī)分為對照組和兩個劑量組，每組雌雄各40只。對照組用對照組培養(yǎng)基飼養(yǎng)，劑量組分別用終濃度為20 μ g/ml、50 μ g/ml rBTI的加樣培養(yǎng)基飼養(yǎng)。將果蜆置于生化恒溫培養(yǎng)箱中光照黑暗交替12小時進(jìn)行培養(yǎng)。每天記錄各組果蠅的死亡數(shù)，直至全部死亡。計(jì)算半數(shù)死亡時間、平均壽命和平均最聞壽命等指標(biāo)實(shí)驗(yàn)結(jié)果由統(tǒng)計(jì)結(jié)果可見，采用添加20 μ g/ml rBTI的培養(yǎng)基所飼養(yǎng)的果蠅雌性平均壽命相對與對照組提高了 19. 28%，雄性果蠅平均壽命相對對照組提高了 28.50%。并且雌性和雄性果蠅的半數(shù)死亡時間和最高壽命都有所提高。由含有50 μ g/ml的rBTI培養(yǎng)基所飼養(yǎng)的果蠅雌性平均壽命相對與對照組提高了 30. 5%，雄性果蠅平均壽命相對對照組提高了35. 00%,并且雌性和雄性果蠅的半數(shù)死亡時間和最高壽命都有所提高。(見表I)表IrBTI對果蠅壽命的影響*
組別半數(shù)死亡時間平均壽命最高壽命
~I~~I Im I^~S~
空白對照45 40 47.20 + 5.33 40.30 土 3.65 5547~
rBTI 20μ^ιη1 54 50 56.30土4.03 51.80 + 3.85 6258
rBTI 50pg/ml 60 55 61.60 + 3.72 56.90土3.57 6763*時間和壽命的單位為天數(shù)實(shí)施例4 rBTI對果蠅的SOD和CAT酶活性的影響實(shí)驗(yàn)步驟
收集4小時內(nèi)新羽化的成蟲，乙醚麻醉下區(qū)分雌雄，取雌、雄果蠅各240只，隨機(jī)分為對照組和兩個劑量組，每組雌雄各40只。對照組用對照組培養(yǎng)基飼養(yǎng)，劑量組分別用終濃度為20 μ g/ml>50 μ g/ml rBTI的加樣培養(yǎng)基飼養(yǎng)。將果蜆置于生化恒溫培養(yǎng)箱中光照/黑暗交替12h進(jìn)行培養(yǎng)。在用藥二十天后進(jìn)行麻醉致死，稱重。生理鹽水洗去培養(yǎng)基，用吸水紙吸干，按w (g):v(ml)=l:10加磷酸緩沖(PBS)溶液，冰浴條件下用玻璃勻漿器處理果蠅。4°C條件下，8000rmp離心20min，取上清測定酶活性。SOD活性和CAT活性測定分別采用南京建成生物工程研究所的SOD試劑盒和CAT試劑盒進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)結(jié)果剛羽化的果蠅在用添加了 rBTI的培養(yǎng)基培養(yǎng)二十天后，其SOD和CAT的酶含量相對于對照組都有所升高，并且成劑量效應(yīng)(表2)。雄性果蠅在20 μ g/ml rIBT的培養(yǎng)基培養(yǎng)20天后，SOD和CAT活性相對于對照組分別提高了 27. 08%和12. 13%，在50 μ g/ml rBTI的培養(yǎng)基中培養(yǎng)20天后，SOD和CAT活性相對于對照組分別提高了 33. 23%和35. 30%。雌性果蠅在20 μ g/mlrBTI的培養(yǎng)基培養(yǎng)20天后SOD和CAT活性相對于對照組分別提高了11. 45%，7. 10%。當(dāng)雌性果蠅在培養(yǎng)基中rBTI的濃度達(dá)到50 μ g/ml時培養(yǎng)20天后，SOD和CAT的活性相對于對照組分別提高了 27. 67%，30. 86%。而生物體內(nèi)的高SOD和CAT活性有助于清除各種自由基，可提高其機(jī)體的抗衰能力。表2rBTI對果蠅SOD和CAT活性的影響
組另IjSOD (U/g)CAT (U/mg)
雄性空白對照67. 8 + 4. 35481. 21 + 41. 09
雌性空白對照78. 31 + 3. 38 572.80 + 33.25
雄性 rBTI 20ug/ml 86. 16 + 3. 33 539. 60 + 53. 64雄性 rBTI 50ug/ml 90. 33 + 3. 98 651. 10 + 37. 05雌性 rBTI 20ug/ml 87. 28 + 4. 80 613. 48 + 33. 30
權(quán)利要求
1.一種蕎麥胰蛋白酶抑制劑作為細(xì)胞自噬誘導(dǎo)劑的應(yīng)用。
2.一種蕎麥胰蛋白酶抑制劑在制備抗衰老藥物中的應(yīng)用。
3.如權(quán)利要求I或2所述的蕎麥胰蛋白酶抑制劑，其氨基酸序列為SEQID N0:1。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種蕎麥胰蛋白酶抑制劑的新用途，即蕎麥胰蛋白酶抑制劑作為細(xì)胞自噬誘導(dǎo)劑的應(yīng)用，蕎麥胰蛋白酶抑制劑在制備抗衰老藥物中的應(yīng)用。所述的蕎麥胰蛋白酶抑制劑，其氨基酸序列為SEQ ID NO1。蕎麥胰蛋白酶抑制劑作為細(xì)胞自噬誘導(dǎo)劑，具有良好的誘導(dǎo)細(xì)胞自噬的功能，且無毒副作用，將蕎麥胰蛋白酶抑制劑用在抗衰老，延長壽命方面也具有明顯的作用。
文檔編號A61K38/56GK102727873SQ20121020043
公開日2012年10月17日 申請日期2012年6月15日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月15日
發(fā)明者崔曉東, 王轉(zhuǎn)花 申請人:山西大學(xué)