專利名稱：制備重組抑酶肽的方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及抑酶肽，具體地說，本發(fā)明涉及在甲基營養(yǎng)酵母中生產(chǎn)抑酶肽的方法，特別是使用白蛋白信號肽，以DNA重組技術(shù)在巴斯德畢赤酵母中生產(chǎn)具有天然N末端氨基酸序列(Arg-Pro-Asp)的抑酶肽的方法。
背景技術(shù)：
抑酶肽又稱為“牛胰蛋白酶抑制劑”(BPTI)，屬于Kunitz-型抑制劑家族成員，具有抑制絲氨酸蛋白酶如胰蛋白酶，胰凝乳蛋白酶，纖維蛋白溶酶和血漿激肽釋放酶的基本生物學活性(W.Gebhard，H.Tschesche and H.Fritz，ProteinaseInhibitors，Barrett and Salvesen(eds.)，Elsevier Science Publ.BV 375-387，1986；Tschesche et al.，U.S.Pat.No.4,595,674)。
抑酶肽是由58個氨基酸殘基組成的堿性蛋白。長期以來，抑酶肽主要被用于治療急性胰腺炎，90年代以后，開始在外科手術(shù)特別是胸外科手術(shù)中使用，用于保護血小板，減少出血和滲血，用于治療有凝血障礙的患者(Bistrup et al.，Lancet 1，366-367，1988)。目前市售的抑酶肽主要是由牛肺或胰等器官中提取的，所使用的工藝復雜而且產(chǎn)品純度不高。
酵母生物體可產(chǎn)生許多細胞內(nèi)合成的并在細胞外發(fā)揮功能的蛋白質(zhì)，這樣的細胞外蛋白質(zhì)通常被稱為分泌蛋白質(zhì)。為確保表達產(chǎn)物通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜，這些分泌蛋白質(zhì)最初是以序列前體(前序列)或前蛋白的形式存在的。前序列，即信號肽一般是在轉(zhuǎn)位期間從所需產(chǎn)物上被裂解掉。信號肽可以是所需蛋白質(zhì)自身的信號肽、異源信號肽或雜合信號肽。使用異源信號肽常常遇到的一個問題是異源信號肽并不能保證有效地轉(zhuǎn)位和被裂解。
巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)系統(tǒng)是近年來發(fā)展很快的一個真核表達系統(tǒng)，現(xiàn)已被普遍用于表達許多有活性的蛋白質(zhì)。畢赤酵母在缺乏抑制性碳源如葡萄糖、甘油時，能夠在以甲醇為唯一碳源的培養(yǎng)基中生長。由于畢赤酵母表達系統(tǒng)是真核表達系統(tǒng)，所以可以對表達的蛋白質(zhì)進行加工折疊和修飾，并且具有發(fā)酵方法成熟、發(fā)酵密度高、培養(yǎng)簡單廉價、外源蛋白質(zhì)既可以胞內(nèi)積累又可分泌、以及表達效率高、表達產(chǎn)物易于純化等優(yōu)點。
已有人在大腸桿菌和在酵母中表達了重組抑酶肽或其類似物或變異體(例如參見(Auerswald et at.，Biol.Chem.Hoppe Seyler 369，27-35，1988；以及歐洲專利0419878、美國專利4,894,436、5,164,482、5,258,302、5,618,915、5,707,831、5,770,568和6,482,798)。然而，現(xiàn)有技術(shù)使用酵母系統(tǒng)表達抑酶肽的實踐中，表達載體中連接到抑酶肽N末端的信號肽序列幾乎都是α-交配因子信號序列。通常情況下，如此產(chǎn)生的前原-α因子/抑酶肽融合蛋白的加工需要兩種不同的蛋白水解酶。即第一種蛋白酶首先在融合蛋白的19-20位氨基酸之間進行切割，然后再由特異性識別堿性氨基酸對(Lys-Arg)的蛋白內(nèi)切酶(Kerx2蛋白酶)切割，從而導致抑酶肽的釋放和分泌(A.J.Brake，Methods in Enzymology185，408-421，1990；Das et at.，Biotechn.Progress 3，43-48，1987)。然而，就重組抑酶肽和其變異體而言，Kex2蛋白酶并不能切割具有天然N末端序列“Arg-Pro-Asp”的抑酶肽，以致幾乎不能表達一種被均勻、正確地加工和分泌抑酶肽。另外，試圖改變抑酶肽的N末端序列以實現(xiàn)酵母系統(tǒng)中表達產(chǎn)物的正確加工也是不實際的，因為對抑酶肽的任何修飾都將會引發(fā)有害的免疫反應。
α-交配因子的信號肽部分已被廣泛用于啤酒酵母中合成和分泌異源蛋白質(zhì)(參見歐洲專利申請Nos.0116201A，0123294A，0123544A，0163529A和0123289A)。α-交配因子信號序列在酵母系統(tǒng)中的加工過程是首先在Kex2蛋白酶的作用下完成信號肽的初次切割(在序列Glu-Lys-Arg*Glu-Ala-Glu-Ala中的Arg和Glu之間)；然后，在STE13基因編碼蛋白的作用下，Glu-Ala重復序列再次被切割?？梢?，α-交配因子信號肽的切割特點在于須切掉兩個堿性氨基酸下游的非堿性氨基酸。由于抑酶肽的N端第一個氨基酸為堿性氨基酸(Arg)，所以α-交配因子信號肽無法對抑酶肽進行正確的切割。
因而，使用酵母表達有天然N末端序列的抑酶肽時，表達產(chǎn)物的分泌水平往往很低甚至完全不分泌或蛋白水解加工不正確。推測出現(xiàn)這些情況的部分原因是由于存在于信號肽C末端和抑酶肽N末端之間的加工位點沒有得到充分暴露，以至不能與蛋白水解酶活性中心充分接近所致。
本發(fā)明人在既往長期從事畢赤酵母和人血清白蛋白研究的基礎上，使用已有的巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)系統(tǒng)，并利用加入了適當酶切位點的白蛋白信號/前導肽代替常規(guī)方法中使用的來自啤酒酵母的α-交配因子信號前導序列，構(gòu)建了本發(fā)明的新的重組載體，并成功地分泌表達了被正確加工的抑酶肽蛋白質(zhì)，從而完成了本發(fā)明。
發(fā)明目的本發(fā)明的一個目的是提供一種使用巴斯德畢赤酵母系統(tǒng)分泌表達重組抑酶肽的方法，該方法包括培養(yǎng)包含可復制表達載體的巴斯德畢赤酵母菌株，所說的表達載體攜帶抑酶肽基因和允許在適當?shù)臓I養(yǎng)培養(yǎng)基中表達抑酶肽的DNA序列，然后從培養(yǎng)物上清中回收和純化所需的抑酶肽，特征在于所說的載體中，直接連接在抑酶肽基因上游的前導或信號序列是白蛋白信號序列。
根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，特征在于所說的抑酶肽是具有正確的天然N末端氨基酸序列的抑酶肽。
根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，特征在于所說的白蛋白信號序列的正鏈和負鏈分別具有序列表中SEQ ID NO1和SEQ ID NO2所示的核苷酸序列。
本發(fā)明的另一個目的是提供由按照上述方法表達的具有天然N末端氨基酸序列的抑酶肽和適當?shù)妮d體或賦形劑的藥物組合物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及抑酶肽，具體地說，本發(fā)明涉及在甲基營養(yǎng)酵母中生產(chǎn)抑酶肽的方法，特別是使用白蛋白信號肽，以DNA重組技術(shù)在巴斯德畢赤酵母中生產(chǎn)具有天然N末端氨基酸序列(Arg-Pro-Asp)的抑酶肽的方法。
本發(fā)明的一個目的是提供一種使用巴斯德畢赤酵母系統(tǒng)分泌表達重組抑酶肽的方法，該方法包括培養(yǎng)包含可復制表達載體的巴斯德畢赤酵母菌株，所說的載體攜帶編碼抑酶肽的基因和允許在適當?shù)臓I養(yǎng)培養(yǎng)基中表達抑酶肽的DNA序列，然后從培養(yǎng)物上清中回收和純化所需的抑酶肽，特征在于所說的載體中，直接連接在抑酶肽基因上游的前導或信號序列是白蛋白信號序列。
根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，特征在于所說的抑酶肽是具有正確的天然N末端氨基酸序列的抑酶肽。
根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，特征在于所說的白蛋白信號序列正鏈和負鏈分別具有序列表中SEQ ID NO1和SEQ ID NO2所示的核苷酸序列。
通過DNA重組技術(shù)在酵母細胞內(nèi)表達產(chǎn)生的蛋白質(zhì)只有被分泌到細胞外才能發(fā)揮其功能，這些在細胞內(nèi)表達的分泌蛋白以含有前序列(信號肽)的前體形式存在，從而有效地指導被表達的產(chǎn)物通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜，而前序列(信號肽)則通常的產(chǎn)物轉(zhuǎn)位期間被裂解掉。進入分泌途徑的蛋白質(zhì)被運輸?shù)礁郀柣掀?，并進而被分泌到細胞外培養(yǎng)基中(Pfeffer，S.R.and Rothman，J.E.Ann.Rev.Biochem.56，829-852，1987)。
可以使用幾種方法在酵母中表達和分泌各種異源蛋白質(zhì)。一般說來，可以按照常規(guī)方法構(gòu)建攜帶編碼所需蛋白質(zhì)和信號肽的DNA，然后用該構(gòu)建體轉(zhuǎn)化酵母宿主細胞并制備被轉(zhuǎn)化細胞的培養(yǎng)物，在適當?shù)臓I養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)所說的酵母細胞培養(yǎng)物并從培養(yǎng)物上清中回收和純化所需的蛋白質(zhì)。
作為構(gòu)建表達載體的必要元件，用于促進所需蛋白質(zhì)分泌表達的信號或前導序列可以是所需蛋白質(zhì)自身的信號肽、異源信號肽或固有與異源信號肽的雜合體。
使用酵母異源信號肽時所遇到的一個主要問題是，異源信號肽往往不能確保產(chǎn)物的有效轉(zhuǎn)位和裂解。如前所述，在使用啤酒酵母α-交配因子信號肽制備重組抑酶肽情況下，幾乎不可能制得被正確加工和分泌的具有天然N末端序列的抑酶肽蛋白質(zhì)產(chǎn)物。為此，本發(fā)明人在利用畢赤酵母酵母系統(tǒng)表達抑酶肽的實踐中，以白蛋白信號序列替代酵母載體本身的α-交配因子信號序列，并利用預先引入的適當酶切位點將該信號序列連接到具有正確N末端序列的抑酶肽基因的上游。結(jié)果令人驚奇地發(fā)現(xiàn)，使用如此構(gòu)建的重組載體轉(zhuǎn)化巴斯德畢赤酵母細胞后，成功地以高產(chǎn)率得到了被正確切割、加工和分泌的抑酶肽。
本文中所使用的術(shù)語“信號肽”是指作為酵母細胞中表達的細胞外蛋白質(zhì)前體形式的N末端序列存在親水前序列。信號肽是能夠使所表達的蛋白質(zhì)被分泌到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，并使信號肽在此過程中被裂解掉。
人或哺乳動物血漿白蛋白基因位于第4號染色體上，其初級翻譯產(chǎn)物為前白蛋白原。在分泌過程中切除信號肽，生成白蛋白原。繼而在高爾基氏體經(jīng)弗林蛋白酶(Furin)切除N末端的一個6肽片段(精-甘-纈-苯丙-精-精)，變成成熟的白蛋白。
白蛋白的運輸途徑是從粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通過滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到高爾基復合體，然后通過中間膜囊進入高爾基體，最后通過胞吐作用被分泌至胞外。新合成的白蛋白首先在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)被切割形成前白蛋白，即以氨基端的六個氨基酸殘基序列(在大多數(shù)哺乳動物中，序列是Arg-Gly-Val-Phe-Arg-Arg)命名的沒有活性的蛋白前體。
前體白蛋白被酶解轉(zhuǎn)變成成熟的蛋白分子是在分泌小泡中進行的。在弗林蛋白酶(furin)的作用下，前白蛋白在高爾基體或膜泡中被加工成成熟白蛋白，最后被運送到細胞外。
當利用此白蛋白信號肽表達其自身白蛋白時，首先在切點P1處切割前蛋白。產(chǎn)物進入血循環(huán)后，融合體前蛋白在切點P2處被蛋白內(nèi)切酶切割，從而產(chǎn)生成熟的白蛋白(參見附圖1A)。由于切點P1處的第一個氨基酸是精氨酸(Arg)，而抑酶肽的N端第一個氨基酸也是Arg，所以抑酶肽基因序列可直接連接在白蛋白信號肽切點P1的下游(參見附圖1B)，從而得以確保表達產(chǎn)物的正確切割。由于切割點P2處的原有序列已被抑酶肽序列取代，所以在產(chǎn)物被分泌入血后即不可能再進行第二次切割。由此保證了具有正確N末端抑酶肽的正確切割和分泌。
在酵母系統(tǒng)中表達抑酶肽時，通常是將酵母分泌蛋白的信號序列例如α-交配因子的信號序列連接到抑酶肽的N末端，用以引導抑酶肽的表達。前原-α因子/抑酶肽融合蛋白的加工需要兩種不同的蛋白水解酶。定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的信號肽首先在融合蛋白的19-20位氨基酸之間被切割掉(由此產(chǎn)生的前-α因子/抑酶肽已在原位被糖基化)。然后再被能夠特異性地識別二堿性氨基酸的蛋白內(nèi)切酶(為一種Kex2蛋白酶)切割，從而導致抑酶肽的釋放和分泌(A.J.Brake，Methods in Enzymology 185，408-421，1990；Das et at.，Biotechn.Progress 3，43-48，1987)。
然而，在通常情況下，由于Kex2蛋白酶不能切割具有天然N末端序列“Arg-Pro-Asp”的抑酶肽，因此很難得到被均勻地、正確地加工和分泌的抑酶肽。
為了解決這個難題，我們在使用在酵母系統(tǒng)表達抑酶肽時，利用白蛋白信號序列引導切割堿性氨基酸的特征，用該信號序列替代α-交配因子的信號序列，并將具有天然N末端序列的抑酶肽連接到白蛋白信號肽的下游，從而成功地分泌表達了具有天然N末端氨基酸序列(Arg-Pro-Asp)的抑酶肽。
本發(fā)明中使用的白蛋白信號肽具有下示氨基酸序列MetLysTrpValThrPheIleSerLeuLeuPheLeuPheSerSerAlaTyrSer(P1)ArgGlyValPheArgArg(P2)AspAlaHisLysSer。其相應的核苷酸序列是5′-ATG AAG TGG GTAACC TTT ATT TCC CTT CTT TTT CTC TTT AGC TCG GCT TAT TCC(P1)AGGGGT GTG TTT CGT CGA(P2)GAT GCA CAC AAG AGT-3′。為本發(fā)明的目的，我們對該信號肽進行了必要的修飾，即在白蛋白信號肽正鏈和負鏈編碼序列的5’和3’端分別加入了有利于繼后序列連接的BstB I和Xho I酶切位點，得到如下所示的的白蛋白信號肽編碼序列5’--CGAAACGATGAAGTGGGTAACCTTTATTTCCCTTCTTTTTCTCTTTAGCTCGGCTTAC-3’(其中的BstBI和XhoI酶切位點以下劃線標示)(SEQ ID NO1)；5’-TCGAGTAGCCGAGCTAAAGAGAAAAAGAAGGGAAATAAAGGTTACCCACTTCATCGTTT-3’(其中的BstBI和XhoI酶切位點以下劃線標示)(SEQ ID NO2)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中被切割(切點為P1)后的前白蛋白第一個氨基酸為精氨酸(Arg)，而天然抑酶肽的N端第一個氨基酸也為精氨酸，所以我們可以用白蛋白信號肽來引導具有正確N末端的抑酶肽的表達。將抑酶肽基因連接到白蛋白信號肽序列的下游，同樣在信號肽酶的作用下，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)進行第一步切割。當分泌蛋白到達高爾基體或膜泡時，由于在白蛋白信號肽C端沒有了識別序列Arg-Arg，致使弗林蛋白酶(Furin)無法再進行第二次切割，從而保證了具有正確N末端序列的抑酶肽被分泌至細胞外。另外，考慮到在白蛋白信號肽下游連入抑酶肽，所以我們在確保不改變信號肽下游氨基酸序列的情況下，設計并加入了一個有利于下一步基因操作的Xho I位點(CTCGAG)。
本發(fā)明方法中所使用的質(zhì)粒pPICZaC購自Invitrogen公司；T載體和核酸內(nèi)切酶均購自TakaRa公司。
本發(fā)明所涉及的核酸序列和用于實現(xiàn)本發(fā)明的其他核酸，包括RNA、cDNA、基因組DNA、載體均可從各種來源中分離得到并可經(jīng)受遺傳操作、擴增，和/或被重組表達。
另外，也可以使用已知的化學合成技術(shù)體外合成這些(單鏈)核酸(例如參見Adams，J.Am.Chem.Soc.105661，1983；Belousov，Nucleic Acids Res.253440-3444，1997；Blommers，Biochemistry 337886-7896，1994；Narang，Meth.Enzymol.6890，1997)。然后再合成其互補鏈并在適當條件下將它們一起退火?；蛘呤褂肈NA聚合酶，將互補鏈與適當?shù)囊镄蛄屑雍希缘玫剿璧碾p鏈DNA片段。
核酸操作技術(shù)，例如亞克隆、探針標記、測序、雜交等在科學文獻和專利文獻都已有充分描述(如參見Sambrook，ed.Molecular CloningA LaboratoryManul(2nd.ed.)，Vols.1-3，Cold Spring Harbor Laboratory(1998)；Current ProtocolsIn Molecular Biology，Ausubel，ed.John wiley&Sons，Inc.，New York(1997))。
可以使用許多已知的方法完成核酸、載體、多肽和蛋白質(zhì)等的定性和定量分析，例如這些方法包括分光光度法、放射顯影法、電泳、高效液相層析(HPLC)、免疫沉淀、免疫擴散、免疫電泳、放射免疫、酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)、免疫熒光試驗、Southern分析、Northern分析、點印跡分析、凝膠電泳(SDS-PAGE)、RT-PCR、定量PCR、其他核酸或靶或信號擴增技術(shù)等。
我們的實驗結(jié)果表明，由于用白蛋白信號序列替代通常使用α-交配因子的信號序列引導目的蛋白質(zhì)的表達，不僅使修飾或突變的抑酶肽在巴斯德畢氏酵母中表達成為可能，而且能夠在畢氏酵母系統(tǒng)以高產(chǎn)率表達具有天然N末端氨基酸序列(Arg-Pro-Asp)的抑酶肽。檢測結(jié)果顯示，使用本發(fā)明方法表達的天然抑酶肽的產(chǎn)率高達約900mg/L。
已報道了抑酶肽在大腸桿菌系統(tǒng)中的表達，然而，由于抑酶肽含有三對二硫鍵，體外復性時很容易發(fā)生二硫鍵的錯配，所以在大腸桿菌中，抑酶肽難以完整復姓的活性形式被表達，且在分泌表達體系中的產(chǎn)量亦普遍較低(10mg/L)。另外，抑酶肽在釀酒酵母系統(tǒng)中分泌表達亦有報道，但如前所述，由于α-交配因子信號肽切割酶(Kex2)不能切割N末端序列“精氨酸-脯氨酸-天冬氨酸”，因此該表達體系分泌表達抑酶肽的產(chǎn)量同樣是很低的。與上述現(xiàn)有技術(shù)不同，本發(fā)明利用畢氏酵母系統(tǒng)，利用白蛋白信號肽的前導信號肽來引導抑酶肽的表達與分泌，結(jié)果成功地分泌型表達并得到了具有正確N末端氨基酸序列的重組抑酶肽，不僅產(chǎn)物的產(chǎn)量比其它任何表達體系都高，而且表達產(chǎn)物也更易于純化。
作為一種絲氨酸蛋白酶抑制劑和活性藥物成分，抑酶肽的基本作用在于將病理性升高的蛋白水解酶活性降低到正常水平，例如用于治療急性胰腺炎、創(chuàng)傷出血性休克、抑制纖溶酶活性、保護血小板，減少出血和滲血等(J.McMichanet al.，Circulatory Shock 9，107，1982；L.M.Auer et al.，Acta Neurochir.49，207，1979)。另外，抑酶肽也可用于治療各種原因?qū)е碌牟±硇愿谓M織損傷(參見03135997.3號中國專利申請)。
本發(fā)明涉及的抑酶肽可以單獨使用，也可以作為有各種不同劑型的藥物組合物的形式使用。可以使用制藥工業(yè)領域已知的方法(參見Remington′sPharmaceutical Sciences，Mack Pub.Co.，Easton，Pa.，1980)，以適于口服或非口服給藥的單位計量形式制備本發(fā)明的藥物組合物。例如，可將作為活性成分的有效量的抑酶肽與醫(yī)藥上可接受的載體或賦形劑均勻地混合，制成溶液或懸浮液形式的適于靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、器官腔內(nèi)、皮內(nèi)和皮下等胃腸道外途徑給藥的藥物組合物；或者也可以制成片劑、膠囊劑、粉末劑、乳劑、顆粒劑等形式的適于經(jīng)胃腸道途徑給藥的藥物組合物。
根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物，其中所使用的醫(yī)藥上可接受的載體或賦形劑將依據(jù)所制備的本發(fā)明藥物組合物的劑型而有不同的選擇。
適于胃腸道外給藥的制劑可含有無菌水或鹽水、聚乙二醇、油和氫化萘等常用的賦形劑。特別是，可以使用生物相容的、生物可降解的丙交酯聚合物、丙交酯/乙交酯共聚物、聚氧乙烯/聚氧丙烯共聚物作為賦形劑，以控制活性成分的緩慢釋放。在其他適于胃腸道外給藥的制劑中，還包括含有水楊酸的直腸給藥制劑和含有甘膽酸鹽的含服給藥制劑。
具體地說，可以使用乳糖、葡萄糖、蔗糖、甘露醇和甲基纖維素等賦形劑，淀粉、海藻酸鈉、羧甲基纖維素鈣和結(jié)晶纖維素等崩解劑，硬脂酸鎂和滑石等潤滑劑，明膠、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、甲基纖維素和羥丙基纖維素等黏結(jié)劑，和蔗糖脂肪酸酯、山梨醇脂肪酸酯等表面活性劑，以及著色劑、甜味劑、香料、分散劑等輔助成分，以常規(guī)方法制備片劑。
可以使用乳糖和甘露醇等賦形劑，淀粉等崩解劑，明膠等黏結(jié)劑，以常規(guī)方法制備顆粒劑。
或者，可以使用乳糖和蔗糖等賦形劑，以常規(guī)方法制備粉末劑。使用明膠、水、蔗糖、阿拉伯膠、山梨醇、甘油、結(jié)晶纖維素、硬脂酸鎂和滑石等，以常規(guī)方法制備膠囊劑。
可以使用水、生理鹽水、植物油(如橄欖油和花生油)、油酸乙酯和丙二醇等溶劑，苯甲酸鈉，水楊酸鈉和氨基甲酸乙酯等增溶劑，氯化鈉和葡萄糖等等滲劑，青霉素和鏈霉素及其他抗真菌劑等抗生素，苯酚、甲酚、對位羥基苯甲酸酯、三氯叔丁醇、度米酚和山梨酸等防腐劑，抗壞血酸和焦磷酸鈉等抗氧化劑，以常規(guī)方法制備可注射劑。
另外，也可使用制藥工業(yè)中已知的方法和輔助成份，將本發(fā)明的藥物組合物制成微膠囊劑或脂質(zhì)體包裹劑。
本發(fā)明的藥物組合物除含有作為基本活性成分的天然或重組產(chǎn)生的抑酶肽或其類似物或突變體外，還可含有一種或多種合成的、天然的或重組來源的具有協(xié)同或輔助作用的其他活性成分。在用于治療肝組織損傷(例如急性或亞急性肝壞死、急性病毒性肝炎、活動期慢性病毒性肝炎、中毒性肝炎以及其他原因?qū)е碌睦^發(fā)性肝損傷和肝衰竭等)的情況下，這些活性成分包括但不只限于具有免疫刺激或調(diào)節(jié)活性、病毒復制抑制活性、功能性肝細胞修復活性的其他成分，例如可以是干擾素、白介素、胸腺素、肝細胞生長因子和成纖維細胞生長因子等。
一般說來，本發(fā)明藥物組合物的口服給藥劑量為0.1-100單位/kg/天，較好為1-80單位/kg/天，最好為5-60單位/kg/天；腹腔內(nèi)或肌肉內(nèi)注射給藥劑量為0.05-100單位/kg/天，較好為0.1-80單位/kg/天，最好為0.5-50單位/kg/天；靜脈內(nèi)注射給藥劑量為0.1-100單位/kg/天，較好為0.5-80單位/kg/天，最好為1-50單位/kg/天。當然，本領域技術(shù)人員可以理解到，為有效地治療病人所需的確切的給藥劑量應根據(jù)待治療的病癥或病理狀態(tài)的性質(zhì)、嚴重程度、病人的年齡、體重和一般健康狀態(tài)，所用藥物的劑型、病人對所用藥物的敏感性和耐受性，以及所使用給藥途徑等因素，按照個體化的原則由臨床醫(yī)生確定。


圖1A顯示白蛋白的信號肽序列與白蛋白的切割方式；圖1B顯示白蛋白的信號肽序列與抑酶肽的連接方式。
圖2顯示用于表達抑酶肽分泌蛋白質(zhì)的重組表達質(zhì)粒pPICZC-HSAsp-BPTI的構(gòu)建。
圖3顯示連接了白蛋白信號肽編碼序列的重組質(zhì)粒的1％瓊脂糖凝膠電泳圖譜。其中泳道1是用BstB I和Xho I酶切后再與白蛋白信號肽編碼序列連接的質(zhì)粒(pPICZC-HSAsp)；泳道2是DNA分子量標志物。泳道3是用BstB I和Xho I酶切但未連接白蛋白信號肽編碼序列的原始質(zhì)粒。
圖4顯示抑酶肽基因序列的1％瓊脂糖凝膠電泳圖譜。其中泳道1是編碼抑酶肽的DNA序列；泳道2是DNA分子量標志物。
圖5顯示附加有酶切位點的抑酶肽基因序列的1％瓊脂糖電泳圖譜。其中泳道1是編碼抑酶肽的DNA序列；泳道2是DNA分子量標志物。
圖6顯示分泌表達的抑酶肽產(chǎn)物的SDS-PAGE分析。其中泳道1是濃縮的培養(yǎng)物上清部分；泳道2是經(jīng)過陽離子交換層析的純化產(chǎn)物；泳道3是抑酶肽標準品。
具體實施例方式
下列實施例旨在進一步舉例說明而不是限制本發(fā)明。本領域技術(shù)人員可以理解到，在不背離本發(fā)明的精神和原則的前提下，對本發(fā)明的任何平行改變和改動都將落入本發(fā)明的待批權(quán)利要求范圍內(nèi)。
實施例1重組質(zhì)粒pPICZC-HSAsp-BPTI的構(gòu)建本實施例舉例描述用于表達本發(fā)明抑酶肽的重組表達質(zhì)粒pPICZC-HSAsp-BPTI的構(gòu)建策略和基本方法(參見附圖2)。
首先，合成兩條(正鏈和負鏈)如下所示的，5’和3’端都包括BstB I和XhoI酶切位點的白蛋白信號肽編碼序列5’--CGAAACGATGAAGTGGGTAACCTTTATTTCCCTTCTTTTTCTCTTTAGCTCGGCTTAC-3’(其中的BstBI和XhoI酶切位點以下劃線標示)(SEQ IDNO1)5’-TCGAGTAAGCCGAGCTAAAGAGAAAAAGAAGGGAAATAAAGGTTACCCACTTCATCGTTT-3’(其中的BstBI和XhoI酶切位點以下劃線標示)(SEQ ID NO2)。
兩條單核苷酸鏈經(jīng)體外退火后，得到兩末端分別帶有BstB I和Xho I酶切位點的白蛋白信號肽雙股核苷酸編碼序列。經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳回收后，在T4 DNA連接酶存在下將此片段連接到預先用BstB I和Xho I內(nèi)切酶切割的質(zhì)粒pPICZaC(Invitrogen)中，得到含有白蛋白信號肽(HSAsp)的載體pPICZC-HSAsp，即加入了白蛋白信號肽的重組質(zhì)粒。BstB I和Xho I酶切鑒定結(jié)果顯示，去掉原有的α-交配因子并連接了信號肽序列后的酶切片段長度約為60bp，而未在相應位點進行信號肽序列置換的片段長度則為大約300bp(參見附圖3)。
其次，使用適當?shù)囊镆跃酆厦告湻磻?PCR)方法從黃牛肺總DNA擴增得到含抑酶肽全基因序列的DNA片段。PCR反應的兩條引物分別為P15’--CTGTGATGACCTTCCCTCTTTAACCG-3’(SEQ ID NO3)P25’-TTCTGAGCGCCACCACTTTCCCTA-3’(SEQ ID NO4)。
(1)PCR反應194℃變性4分鐘。(2)PCR反應2，94℃變性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸1分鐘，28個循環(huán)。(3)PCR反應394℃變性45秒，72℃延伸2分鐘。PCR擴增產(chǎn)物的長度為300bp(參見附圖4)。然后，將其連接到T載體(TakaRa)中，得到質(zhì)粒T-BPTI。
然后，使用合成的寡核苷酸引物P15’-CAAAGCCTCGAGACCTGACTTCTGCCTA-3’(含有XhoI酶切位點)(SEQ ID NO5)；P25’-GGTTCTAGAGCCCTTAAGCACC-3’(含有XbaI酶切位點)(SEQ ID NO6)以T-BPTI為模板PCR擴增得到編碼BPTI、長度約203bp的DNA片段。
(1)PCR反應194℃變性4分鐘。(2)PCR反應2，94℃變性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸1分鐘，28個循環(huán)。(3)PCR反應394℃變性45秒，72℃延伸2分鐘。經(jīng)29個循環(huán)得到擴增產(chǎn)物BPTI編碼序列。(參見附圖4)PCR產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳回收后，用核酸內(nèi)切酶XhoI和XbaI雙酶切，并在T4 DNA連接酶存在下將此片段連接到已用同樣內(nèi)切酶消化的質(zhì)粒pPICZC-HSAsp中，從而得到重組表達質(zhì)粒pPICZC-HSAsp-BPTI。用美國Beckman公司測序儀CEQ2000測序，結(jié)果表明，白蛋白信號肽和BPTI均具有和已知相同的核苷酸編碼序列。
實施例2重組抑酶肽的表達及發(fā)酵生產(chǎn)本實施列舉描述本發(fā)明的抑酶肽蛋白質(zhì)在畢氏酵母宿主細胞中的誘導表達及其菌體的高密度發(fā)酵。
用限制性內(nèi)切酶PmeI消化實施例1中制得的重組質(zhì)粒pPICZC-HSAsp-BPTI后，用所得到的消化產(chǎn)物轉(zhuǎn)化生長于BMGY培養(yǎng)基(1％酵母提取物，2％蛋白胨，1％甘油，100mM磷酸鉀緩沖液PH6.0，1.34％YNB，4×10-5％生物素)中的畢氏酵母菌株X-33(Invitrogen)，并按常規(guī)方法30℃培養(yǎng)被轉(zhuǎn)化的酵母宿主細胞。然后，挑取并培養(yǎng)陽性單克隆菌落。當OD600nm達到2～6時，凍存部分菌種，將BMGY培養(yǎng)基(1％酵母提取物，2％蛋白胨，1％甘油，100mM磷酸鉀緩沖液PH6.0，1.34％YNB，4×10-5％生物素)更換成BMMY培養(yǎng)基(1％酵母提取物，2％蛋白胨，0.5％甲醇，100mM磷酸鉀緩沖液PH6.0，1.34％YNB，4×10-5％生物素)誘導表達。誘導過程中每隔24小時取樣，以SDS-PAGE電泳法監(jiān)測蛋白質(zhì)表達產(chǎn)物。SDS-PAGE分析顯示，表達產(chǎn)物中存在一條分子量約6KDa的條帶(參見附圖5)。在表達期間，利用已知的胰蛋白酶抑制實驗定量分析表達產(chǎn)物的生物學活性(參見Cara B，Marks V，Peter N，et al，[J].JBC，1986，261(16)7115-7118)。
然后，于28℃，以30L規(guī)模發(fā)酵培養(yǎng)陽性菌株。為此，配制30L FM21基本鹽培養(yǎng)基(H3PO43.5ml/L，CaSO4·2H2O 0.15g/L，K2SO42.4g/L，MgSO4·7H2O1.95g/L，KOH 0.65g/L)，121℃高壓滅菌30分鐘，待溫度下降至30℃左右時加入混合的微量元素(PTM1)和生物素，并將菌體接種于80升發(fā)酵罐(New Brunswick scientific)中，進行常規(guī)的高密度發(fā)酵。發(fā)酵條件是溫度28-30℃；攪拌器旋轉(zhuǎn)速率600轉(zhuǎn)/分(rpm)；pH3.30(用NH4OH和/或H3PO4校正)。
通過對攪拌速率、罐內(nèi)壓力、通氣量等條件的控制，使培養(yǎng)物中溶氧量保持在20％以上，并使其他參數(shù)維持在穩(wěn)定狀態(tài)。
誘導開始后，于不同時間取樣，稱取菌體的濕重或干重，并留取上清進行產(chǎn)物活性和SDS-PAGE電泳分析，從而來確定蛋白質(zhì)產(chǎn)物隨時間延長的累計效應。發(fā)酵約持續(xù)30小時。發(fā)酵結(jié)束時菌體濕重約為300g/L，重組抑酶肽的濃度約為900mg/L。
實施例3重組抑酶肽的純化培養(yǎng)完成后，利用標準的離心技術(shù)將酵母細胞與培養(yǎng)液分離，棄去酵母菌體后，收集上清。上清內(nèi)添加約1/10體積的200mM NaAc-HAc PH4.0緩沖液，使其終濃度達到約20mM。經(jīng)預先用20mM NaAc-HAc(pH4.0)平衡的Sepharose SP FF陽離子交換層析柱層析分離，并依次用溶液A(20mMNaAc-HAc PH4.0)和溶液B(2M Nacl，20mM NaAc-HAc PH4.0)進行洗脫。洗脫后，收集各組分峰進行SDS-PAGE和抑酶肽活性分析。
經(jīng)Sepharose SP FF陽離子交換層析分離的抑酶肽粗品再經(jīng)SoureceTM30RPC反相疏水層析進一步純化。含抑酶肽活性的樣品加入1/10體積1％TFA后加入用起始緩沖液A(0.1％TFA)平衡SoureceTM30RPC反相疏水層析柱，用溶液A(0.1％TFA)和溶液B(100％乙腈)進行梯度洗脫，收集各組分峰進行SDS-PAGE和抑酶肽活性分析，并根據(jù)OD280吸收值測定蛋白濃度。
質(zhì)譜檢測結(jié)果表明，本發(fā)明制備的抑酶肽的分子量為6508.7Da。用Edman水解法測定蛋白質(zhì)N-端序列，結(jié)果表明，蛋白質(zhì)N末端15個氨基酸序列與天然抑酶肽序列完全一致。
實施例4表達產(chǎn)物的生物學活性分析利用胰蛋白酶抑制實驗(參照Cara B，Marks V，Peter N，et al)來定量分析表達產(chǎn)物的生物學活性。簡單地說，該方法包括首先向600μl緩沖體系(50mMTris-HCl，PH 8.0，10mM MgCl2，10mM CaCl2)中加入200μl胰蛋白酶溶液(100U/mlBuffer)，然后再加入200μl不同濃度的表達物上清。將此混合物置于室溫下反應約20～30分鐘后，加入50μl底物N-苯甲酰-L精氨酸-β萘酰胺溶液(BAPNA)(20mM，溶于DMSO)。反應5分鐘后，于405nm處測量吸光度的變化(相對于對照管)。結(jié)果，可見本發(fā)明方法制得的具有天然N末端氨基酸序列(Arg-Pro-Asp)的抑酶肽表現(xiàn)有十分顯著的胰蛋白酶抑制活性(抑制率約為80％)。另外，使用該方法測得本發(fā)明的具有天然N末端氨基酸序列的重組抑酶肽的產(chǎn)率約為900mg/L。
序列表<110>吉林圣元科技有限責任公司<120>制備重組抑酶肽的方法<140>
<141>
<160>6<210>1<211>58<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的白蛋白信號肽DNA編碼序列正鏈。
<400>1CGAAACGATG AAGTGGGTAA CCTTTATTTC CCTTCTTTTT CTCTTTAGCT CGGCTTAC<210>2<211>60<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的白蛋白信號肽DNA編碼序列負鏈。
<400>2TCGAGTAAGC CGAGCTAAAG AGAAAAAGAA GGGAAAIAAA GGTTACCCACTTCATCGTTT<210>3<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)特定核苷酸序列設計，以用作PCR擴增的引物。
<400>3CTGTGATGAC CTTCCCTCTT TAACCG<210>4<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)特定核苷酸序列設計，以用作PCR擴增的引物。
<400>4
TTCTGAGCGC CACCACTTTC CCTA<210>5<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)特定核苷酸序列設計，以用作PCR擴增的引物。
<400>4CAAAGCCTCG AGACCTGACT TCTGCCT A<210>6<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)特定核苷酸序列設計，以用作PCR擴增的引物。
<400>4GGTTCTAGAG CCCTTAAGCA CC
權(quán)利要求
1.一種使用巴斯德畢赤酵母系統(tǒng)分泌表達重組抑酶肽的方法，該方法包括培養(yǎng)包含可復制表達載體的巴斯德畢赤酵母菌株，所說的載體攜帶編碼抑酶肽的基因和允許在適當?shù)臓I養(yǎng)培養(yǎng)基中表達抑酶肽的DNA序列，然后從培養(yǎng)物上清中回收和純化所需的抑酶肽，特征在于，所說的載體中直接連接在抑酶肽基因上游的信號序列是人或哺乳動物白蛋白信號序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，特征在于所說的抑酶肽是具有正確的天然N末端氨基酸序列的抑酶肽。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，特征在于所說的白蛋白信號序列具有序列表中SEQ ID NO1和SEQ ID NO2所示的核苷酸序列。
4.含有按照權(quán)利要求1的方法表達的具有天然N末端氨基酸序列的抑酶肽和適當?shù)妮d體或賦形劑的藥物組合物。
全文摘要
本發(fā)明涉及抑酶肽，具體地說，本發(fā)明涉及在甲基營養(yǎng)酵母中生產(chǎn)抑酶肽的方法，特別是使用白蛋白信號肽，以DNA重組技術(shù)在巴斯德畢赤酵母中生產(chǎn)具有天然N末端氨基酸序列(Arg－Pro－Asp)的抑酶肽的方法。
文檔編號C12N15/81GK1880451SQ20051001687
公開日2006年12月20日 申請日期2005年6月14日 優(yōu)先權(quán)日2005年6月14日
發(fā)明者顏煒群, 楊莉莉 申請人:吉林圣元科技有限責任公司