專利名稱：作為穿過血腦屏障的載體的抑酶肽及類似物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及藥物傳遞領(lǐng)域的改進(jìn)。更特別地，本發(fā)明涉及用于將化合物或藥物運(yùn)送穿過個體的血腦屏障的非-侵入性和柔性的方法與載體。
背景技術(shù)：
在腦病理學(xué)新療法的開發(fā)中，血腦屏障(BBB)被認(rèn)為是潛在使用治療中樞神經(jīng)系·統(tǒng)(CNS)疾病的藥物的主要障礙。1998年CNS藥物的全球市場為$330億美金，為心血管藥物全球市場的大致一半，既便在美國，CNS障礙患者也幾乎是心血管疾病患者人數(shù)的兩倍。這種不平衡的原因是超過98%潛在的CNS藥物不能穿過血腦屏障。此外，全球超過99%的CNS藥物的開發(fā)僅僅涉及CNS藥物發(fā)現(xiàn)，僅有不到1%的開發(fā)涉及CNS藥物的傳遞。這個比例可以證明為什么對主要的神經(jīng)學(xué)疾病諸如腦瘤、阿耳茨海默氏病和中風(fēng)沒有有效的治療現(xiàn)行可使用。通過兩個屏障系統(tǒng)保護(hù)腦抵抗?jié)撛诙拘晕镔|(zhì)，這兩個屏障系統(tǒng)是血腦屏障(BBB)和血腦脊液屏障(BCSFB)。BBB被認(rèn)為是攝取血清配體的主要途徑，因?yàn)槠浔砻娣e比BCSFB的大大約5000倍。腦內(nèi)皮，它構(gòu)成BBB，表示抗CNS多種疾病的潛在藥物使用的主要障礙。作為一般規(guī)則，只有小于約500道爾頓的親脂性分子能夠穿過BBB，即從血液至腦。然而，用于治療CNS疾病的在動物研究中顯示有希望的效果的很多藥物的尺寸相當(dāng)?shù)馗?。由此，因?yàn)槟X毛細(xì)管內(nèi)皮壁對所述藥物幾乎沒有滲透性，肽和蛋白質(zhì)治療劑通常被排除從血液運(yùn)送到腦。腦毛細(xì)管內(nèi)皮細(xì)胞(BCECs)被緊密連接所密封，與其它器官的毛細(xì)管相t匕，幾乎沒有開口和細(xì)胞內(nèi)的囊泡。BCECs被細(xì)胞外基質(zhì)、星形膠質(zhì)細(xì)胞、外膜細(xì)胞和小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞所包圍。內(nèi)皮細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞足突和毛細(xì)管的基底膜的緊密結(jié)合，對于形成和維持BBB的性質(zhì)(它允許嚴(yán)格控制血-腦交換)是重要的。至今還沒有有效的可用于腦的藥物傳遞方法。研究中的將肽和蛋白藥物傳遞到腦的方法可以分為三種主要策略。首先，侵入性的方法包括通過手術(shù)方法直接腦室內(nèi)給予藥物，以及通過頸動脈內(nèi)輸注高摩爾滲透壓的溶液短暫破壞BBB。其次，藥理學(xué)-基礎(chǔ)的策略表現(xiàn)為通過增加肽或蛋白的脂溶性來促使其穿過BBB。第三，生理學(xué)-基礎(chǔ)的策略利用BBB的各種載體機(jī)制，這是最近幾年被表征的。在此方法中，藥物連接在蛋白質(zhì)載體上，其表現(xiàn)如同在BBB上的受體-靶向的傳遞介質(zhì)。此方法非常特異，并且表現(xiàn)出高功效，對具有不定靶標(biāo)的臨床適應(yīng)癥具有非常的柔性。在本發(fā)明中，研究最后一種方法。人們非常希望在藥物傳遞領(lǐng)域提供改進(jìn)。人們還非常希望提供一種非-侵入性的且柔性的方法和載體，該方法和載體用于運(yùn)送化合物或藥物穿過個體的BBB。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的是提供一項(xiàng)藥物傳遞領(lǐng)域的改進(jìn)。本發(fā)明的另一個目的是提供一種非-侵入性的且靈活的方法和載體，該方法和載體用于運(yùn)送化合物或藥物穿過個體的血腦屏障。根據(jù)本發(fā)明的一項(xiàng)實(shí)施方案，其中提供了一種用于運(yùn)送藥劑穿過患者血腦屏障的方法，該方法包括以下步驟向患者給予一種化合物，該化合物含有與抑酶肽、抑酶肽的藥學(xué)可接受的鹽、抑酶肽片段或抑酶肽片段的藥學(xué)可接受的鹽相連接的所述藥劑。根據(jù)本發(fā)明進(jìn)一步的一項(xiàng)實(shí)施方案，其中提供提供了抑酶肽、抑酶肽的藥學(xué)可接受的鹽、抑酶肽片段或抑酶肽片段的藥學(xué)可接受的鹽在運(yùn)送與之相連接的化合物穿過患者血腦屏障中的用途。根據(jù)本發(fā)明的另一項(xiàng)實(shí)施方案，其中提供了抑酶肽、抑酶肽的藥學(xué)可接受的鹽、抑 酶肽片段或抑酶肽片段的藥學(xué)可接受的鹽在制備用于穿過患者血腦屏障治療神經(jīng)學(xué)疾病的藥物中的用途。根據(jù)本發(fā)明的還另一個實(shí)施方案，其中提供提供了抑酶肽、抑酶肽的藥學(xué)可接受的鹽、抑酶肽片段或抑酶肽片段的藥學(xué)可接受的鹽在制備穿過患者血腦屏障治療中樞神經(jīng)系障礙的藥物中的用途。根據(jù)本發(fā)明的另一項(xiàng)實(shí)施方案，其中提供了一種式為R-L-M的化合物或其藥學(xué)可接受的鹽，其中R是抑酶肽或其片段，L是一種連接體或一條鍵，且M是選自小分子藥物、蛋白、肽和酶的藥劑或藥物。根據(jù)本發(fā)明的另一項(xiàng)實(shí)施方案，其中提供了一種治療患者神經(jīng)學(xué)疾病的方法，該方法包括向患者給予一種藥物，該藥物含有抑酶肽、抑酶肽的藥學(xué)可接受的鹽、抑酶肽片段或抑酶肽片段的藥學(xué)可接受的鹽，以及一種適于治療該疾病的化合物，所述化合物連接在抑酶肽上。根據(jù)本發(fā)明進(jìn)一步的一項(xiàng)實(shí)施方案，其中提供提供了一種治療患者中樞神經(jīng)系統(tǒng)障礙的方法，該方法包括向患者給予一種藥物，該藥物含有抑酶肽、抑酶肽的藥學(xué)可接受的鹽、抑酶肽片段或抑酶肽片段的藥學(xué)可接受的鹽，以及一種適于治療該疾病的化合物，所述化合物連接在抑酶肽上。根據(jù)本發(fā)明的一項(xiàng)實(shí)施方案，其中提供提供了一種用于運(yùn)送與之相連接的藥劑穿過血腦屏障的載體，其中所述載體在與藥劑相連接后能夠穿過血腦屏障，并由此將藥劑運(yùn)送穿過血腦屏障。在本發(fā)明的一項(xiàng)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述運(yùn)送不會影響血腦屏障的完整性。在本發(fā)明的一項(xiàng)優(yōu)選的實(shí)施方案中，載體選自抑酶肽、抑酶肽的功能性衍生物、血管肽I (Angio-Ρ印I)和血管肽I的功能性衍生物。在本發(fā)明的一項(xiàng)優(yōu)選的實(shí)施方案中，藥劑選自由藥品、藥物、蛋白、肽、酶、抗生素、抗癌藥劑、中樞神經(jīng)系統(tǒng)水平上活性的分子、放射顯影劑、抗體、細(xì)胞毒素、可檢測標(biāo)記和抗血管生成化合物組成的組。在本發(fā)明的一項(xiàng)優(yōu)選的實(shí)施方案中，抗癌劑是紫杉醇。在本發(fā)明的一項(xiàng)優(yōu)選的實(shí)施方案中，可測標(biāo)記選自放射性標(biāo)記、綠色熒光蛋白、組氨酸標(biāo)簽(histag)蛋白和β-半乳糖苷酶。
在本發(fā)明的一項(xiàng)優(yōu)選的實(shí)施方案中，藥劑的最大分子量為160，000道爾頓。在本發(fā)明的一項(xiàng)優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過受體-介導(dǎo)的胞轉(zhuǎn)或吸附-介導(dǎo)的胞轉(zhuǎn)而實(shí)現(xiàn)所述運(yùn)送。在本發(fā)明的一項(xiàng)優(yōu)選的實(shí)施方案中，藥劑用于治療神經(jīng)學(xué)疾病。在本發(fā)明的一項(xiàng)優(yōu)選的實(shí)施方案中，神經(jīng)學(xué)疾病選自由腦瘤、腦轉(zhuǎn)移瘤、精神分裂癥、癲癇、阿爾茨海默氏病、帕金森氏病、亨廷頓舞蹈病、中風(fēng)以及血腦屏障相關(guān)的機(jī)能障礙組成的組。在本發(fā)明的一項(xiàng)優(yōu)選的實(shí)施方案中，血腦屏障相關(guān)的機(jī)能障礙疾病是肥胖。在本發(fā)明的一項(xiàng)優(yōu)選的實(shí)施方案中，運(yùn)送導(dǎo)致藥劑傳遞至個體的中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)。 在本發(fā)明的一項(xiàng)優(yōu)選的實(shí)施方案中，藥劑在運(yùn)送穿過血腦屏障之后，可從載體中釋放出來。在本發(fā)明的一項(xiàng)優(yōu)選的實(shí)施方案中，藥劑在運(yùn)送穿過血腦屏障之后，從載體中被釋放出來。在本發(fā)明的一項(xiàng)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種用于將藥劑運(yùn)送穿過血腦屏障的藥物組合物，該組合物含有與藥學(xué)可接受的賦形劑結(jié)合的本發(fā)明實(shí)施方案的載體。根據(jù)本發(fā)明的另一項(xiàng)實(shí)施方案，其中提供了一種用于治療神經(jīng)學(xué)疾病的藥物組合物，該組合物含有與藥學(xué)可接受的賦形劑結(jié)合的本發(fā)明實(shí)施方案的載體。根據(jù)本發(fā)明的另一項(xiàng)實(shí)施方案，其中提供了一種用于將藥劑運(yùn)送到個體CNS的藥物組合物，該組合物含有與藥學(xué)可接受的賦形劑結(jié)合的本發(fā)明實(shí)施方案的載體。根據(jù)本發(fā)明的另一項(xiàng)實(shí)施方案，其中提供了一種用于將藥劑運(yùn)送穿過血腦屏障的綴合物，該綴合物包含(a)載體；和(b)連接到載體上的藥劑，其中，所述綴合物能夠穿過血腦屏障并由此將藥劑運(yùn)送穿過血腦屏障。根據(jù)本發(fā)明的另一項(xiàng)實(shí)施方案，其中提供了一種用于將藥劑運(yùn)送穿過血腦屏障的藥物組合物，該組合物含有與藥學(xué)可接受的賦形劑結(jié)合的本發(fā)明實(shí)施方案的綴合物。根據(jù)本發(fā)明的一項(xiàng)實(shí)施方案，其中提供提供了一種用于治療神經(jīng)學(xué)疾病的藥物組合物，該組合物含有與藥學(xué)可接受的賦形劑結(jié)合的本發(fā)明實(shí)施方案的綴合物。根據(jù)本發(fā)明的另一項(xiàng)實(shí)施方案，其中提供了一種用于將藥劑運(yùn)送到個體CNS的藥物組合物，該組合物含有與藥學(xué)可接受的賦形劑結(jié)合的本發(fā)明實(shí)施方案的綴合物。根據(jù)本發(fā)明的另一項(xiàng)實(shí)施方案，其中提供了一種載體在制備用于將藥劑運(yùn)送穿過血腦屏障的藥物中的用途，所述載體用于運(yùn)送與之相連的藥劑穿過血腦屏障。根據(jù)本發(fā)明的另一項(xiàng)實(shí)施方案，其中提供了一種用于運(yùn)送藥劑穿過血腦屏障的藥物組合物，該組合物中含有與藥學(xué)可接受的賦形劑結(jié)合的按照本發(fā)明實(shí)施方案中定義的制備的藥物。根據(jù)本發(fā)明的另一項(xiàng)實(shí)施方案，其中提供了一種載體在制備用于治療個體神經(jīng)學(xué)疾病的藥物中的用途，所述載體用于運(yùn)送與之相連接的藥劑穿過血腦屏障。根據(jù)本發(fā)明的另一項(xiàng)實(shí)施方案，其中提供了一種用于治療神經(jīng)學(xué)疾病的藥物組合物，所述組合物含有與藥物可接受的賦形劑結(jié)合的按照本發(fā)明實(shí)施方案中定義的制備的藥物。
根據(jù)本發(fā)明的另一項(xiàng)實(shí)施方案，其中提供了一種載體在制備用于治療個體中樞神經(jīng)系統(tǒng)障礙的藥物中的用途，所述載體用于運(yùn)送與之相連的藥劑穿過血腦屏障。根據(jù)本發(fā)明的另一項(xiàng)實(shí)施方案，其中提供了一種用于治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)障礙的藥物組合物，所述組合物含有與藥物可接受的賦形劑結(jié)合的按照本發(fā)明實(shí)施方式中定義的所制備的藥物。根據(jù)本發(fā)明的另一項(xiàng)實(shí)施方案，其中提供了式R-L-M的綴合物或其藥學(xué)可接受的鹽，其中的R是一種在與L-M連接后能穿過血腦屏障的載體，從而可以將M運(yùn)送穿過血腦屏障，L是一種連接體或者化學(xué)鍵，M是選自由藥品、藥物、蛋白、肽、酶、抗生素、抗癌劑、中樞神經(jīng)系統(tǒng)水平上活性的分子、放射顯影劑、抗體、細(xì)胞毒素、可檢測標(biāo)記和抗血管生成化合物組成的組。根據(jù)本發(fā)明的另一項(xiàng)實(shí)施方案，其中提供了本發(fā)明實(shí)施方案的綴合物在運(yùn)送與之 根據(jù)本發(fā)明的另一項(xiàng)實(shí)施方案，其中提供了本發(fā)明實(shí)施方案的綴合物在治療個體中神經(jīng)學(xué)疾病中的用途。根據(jù)本發(fā)明的另一項(xiàng)實(shí)施方案，其中提供了本發(fā)明實(shí)施方案的綴合物在治療個體中樞神經(jīng)系統(tǒng)障礙中的用途。根據(jù)本發(fā)明的另一項(xiàng)實(shí)施方案，其中提供了一種運(yùn)送藥劑穿過血腦屏障的方法，該方法包括向個體給予本發(fā)明實(shí)施方案的藥物組合物的步驟。在本發(fā)明一項(xiàng)優(yōu)選的方法中，藥物組合物通過動脈內(nèi)、鼻內(nèi)、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、透皮或口服給予個體。根據(jù)本發(fā)明的另一項(xiàng)實(shí)施方案，其中提供了一種治療個體中神經(jīng)學(xué)疾病的方法，該方法包括向需要它的個體給予治療有效量的本發(fā)明實(shí)施方案的藥物組合物。 根據(jù)本發(fā)明的另一項(xiàng)實(shí)施方案，其中提供了一種治療個體中樞神經(jīng)系統(tǒng)障礙的方法，該方法包括向需要它的個體給予治療有效量的本發(fā)明實(shí)施方案的藥物組合物。為了本發(fā)明目的，對以下術(shù)語作如下定義。術(shù)語“載體”指的是能夠穿過血腦屏障，并且能夠與另一種化合物或藥劑相連接或綴合，并由此能夠運(yùn)送另一種化合物或藥劑穿過血腦屏障的化合物或分子。例如，此種載體可以與腦內(nèi)皮細(xì)胞上存在的受體相結(jié)合，并由此通過胞轉(zhuǎn)被運(yùn)送穿過血腦屏障。優(yōu)選地，載體是獲得很高的透內(nèi)皮運(yùn)送水平，對血腦屏障的完整性沒有任何影響的蛋白質(zhì)或分子。載體可以是，但是不限于蛋白、肽或肽模擬物，并可以是自然產(chǎn)生或通過化學(xué)合成或重組基因技術(shù)(基因工程)得到的。術(shù)語“載體-藥劑綴合物”指的是載體和另一種化合物或藥劑的綴合物。綴合可以是化學(xué)性質(zhì)的，例如用鍵；或者是基因性質(zhì)的，例如通過重組基因技術(shù)，諸如以與例如綠色熒光蛋白，β_半乳糖苷酶或組氨酸標(biāo)簽蛋白的融合蛋白形式。詞語“小分子藥物”指的是分子量等于或小于lOOOg/mol的藥物。術(shù)語“治療”等等指的是獲得了希望的藥理學(xué)和/或生理學(xué)效果，例如，抑制了癌細(xì)胞的生長，癌細(xì)胞死亡或改善了神經(jīng)學(xué)疾病或病況。所述效果從完全或部分預(yù)防疾病或其癥狀來說可以是預(yù)防性的，和/或從完全或部分治愈疾病和/或疾病導(dǎo)致的不良作用來說可以是治療性的。此處的“治療”涵蓋了哺乳動物，特別是人的疾病的任何治療，包括(a)在容易患病但是尚未診斷出患病的個體中防止疾病或病況的發(fā)生(例如，預(yù)防癌癥)；(b)抑制疾病(例如，阻止疾病發(fā)展)；或者，(C)緩解疾病(例如,減輕與疾病相關(guān)的癥狀)。此文所用的“治療”涵蓋了任何向個體給予藥物物質(zhì)或化合物以治療、治愈、緩解、改善、減輕或抑制個體中的病況，其包括但不限于向個體給予載體-藥劑綴合物。術(shù)語“癌癥”指的是任何細(xì)胞惡性，其獨(dú)有特征在于正常控制的喪失(導(dǎo)致無調(diào)節(jié)的生長)，分化的缺少以及侵入局部組織和遷移的能力。癌癥可在任何器官的任何組織中發(fā)生。更特別地，癌癥意指包括，但不限于腦的癌。術(shù)語“給予”和“給藥”指的是傳遞的方式，其包括但不限于動脈內(nèi)、鼻內(nèi)、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、透皮或口服。優(yōu)選的是口服。每日劑量可以分成適宜形式的一份、兩份或更多份劑量，以在整個時間段以一次、兩次或更多次給藥。術(shù)語“治療有效”指的是足以實(shí)質(zhì)上改善某些與疾病或醫(yī)學(xué)病況相關(guān)的癥狀的一定量的化合物。例如，在癌癥或精神病況或神經(jīng)學(xué)或CNS疾病的治療中，減少、預(yù)防、延緩、 抑制或阻止任何疾病或病況的癥狀的藥劑或化合物將是治療有效的。治療有效量的藥劑或化合物并不需要治愈疾病或病況，但將對疾病或病況提供治療，以便延緩、阻斷、預(yù)防疾病或病況的發(fā)生，或者，緩解疾病或病況的癥狀，或者改變疾病或病況的期限或者，例如不太嚴(yán)重，或者加速個體的恢復(fù)。本發(fā)明的載體和載體-藥劑綴合物可與常規(guī)治療方法和/或療法相結(jié)合使用，或者可與常規(guī)治療方法和/或療法分開使用。當(dāng)本發(fā)明載體-藥劑綴合物與用其他藥劑的療法聯(lián)合使用時，它們可以順序或同時給予個體?？商娲?，如本申請所述，本發(fā)明藥物組合物可以由與藥學(xué)可接收的賦形劑以及另一種本領(lǐng)域公知的治療或預(yù)防劑結(jié)合的本發(fā)明載體-藥劑綴合物的組合組成。將理解，對于任何特定個體的特定“有效量”將取決于多種因素，所述因素包括使用的特定藥劑的活性、個體的年齡、體重、一般健康、性別和/或飲食、給藥時間、給藥途徑、排泄速率、藥物結(jié)合以及經(jīng)受預(yù)防或治療的特定疾病的嚴(yán)重程度。藥學(xué)可接收的酸加成鹽可以通過本領(lǐng)域公知的方法制備。如本文所使用的，“藥學(xué)可接受的載體”包括任何以及所有的溶劑(諸如磷酸鹽緩沖鹽水緩沖劑、水、鹽水)、分散介質(zhì)、包衣劑、抗細(xì)菌劑以及抗真菌劑、等滲劑和吸收延遲劑等等。這類介質(zhì)和藥劑用于藥學(xué)活性物質(zhì)的用途是本領(lǐng)域非常公知的。任何的常規(guī)介質(zhì)或藥劑在治療組合物中的使用都被想到，除了其與活性成分不相容。也可將補(bǔ)加的活性成分摻入到組合物中。術(shù)語“功能性衍生物”指的是本發(fā)明的載體或藥劑或載體-藥劑綴合物或它們的鹽的“化學(xué)衍生物”、“片段”或“變體”生物學(xué)活性序列或部分。載體功能性衍生物能夠與另一種化合物或藥劑相連接或綴合，并穿過血腦屏障，從而能夠?qū)⑵渌幕衔锘蛩巹┺D(zhuǎn)運(yùn)穿過血腦屏障。術(shù)語“化學(xué)衍生物”指的是本發(fā)明的載體、藥劑或載體-藥劑綴合物，其含有附加的化學(xué)部分，該化學(xué)部分不是載體、藥劑或載體-藥劑綴合物的一部分。共價修飾也包括在本發(fā)明的范圍之內(nèi)?；瘜W(xué)衍生物可以通過直接的化學(xué)合成，使用本領(lǐng)域公知的方法方便制備。這類修飾可以是，例如，通過將靶氨基酸殘基與能夠與經(jīng)選擇的側(cè)鏈或末端殘基發(fā)生反應(yīng)的有機(jī)衍生化劑進(jìn)行反應(yīng)，導(dǎo)入到蛋白或肽載體、藥劑或載體-藥劑綴合物中。載體化學(xué)衍生物能夠穿過血腦屏障并能與另一種化合物或藥劑相連接或綴合，并由此將另一種化合物或藥劑運(yùn)送穿過血腦屏障。在一項(xiàng)優(yōu)選的實(shí)施方案中，獲得了非常高水平的穿過血腦屏障的透內(nèi)皮運(yùn)送，對血腦屏障的完整性不產(chǎn)生任何影響。術(shù)語“片段”指的是載體、藥劑或載體-藥劑綴合物的任何碎片或部分。蛋白或肽的片段，例如，可以是構(gòu)成整個蛋白或肽的亞組氨基酸。載體片段能與另一種化合物或藥劑相連接或發(fā)生綴合并穿過血腦屏障，并由此能夠?qū)⒘硪环N化合物或藥劑運(yùn)送穿過血腦屏障。術(shù)語“變體”指的是與本發(fā)明載體、藥劑或載體-藥劑綴合物或他們的任何片段的任一結(jié)構(gòu)實(shí)質(zhì)上類似的載體、藥劑或載體-藥劑綴合物。載體變體能與另一種化合物或藥劑相連接或發(fā)生綴合并穿過血腦屏障，并由此將另一種化合物或藥劑運(yùn)送穿過血腦屏障。設(shè)想到了變體蛋白、肽、肽模擬物和本發(fā)明載體的化學(xué)結(jié)構(gòu)。術(shù)語“抑酶肽片段”指的是仍然能將化合物運(yùn)送穿過BBB的抑酶肽的部分。這 樣的片段可含有至少12個氨基酸，優(yōu)選至少25個氨基酸，更優(yōu)選至少35個氨基酸。Hussain, M.，Strickland, D. K.，Bakillah, A.,在The mammalian low-density lipoproteinreceptor family. (Anno. Rev. Nutr. 1999, 19, 141-172) 一文中進(jìn)行了測定有效的與巨蛋白相互作用的抑酶肽的最小序列的研究。例如，抑酶肽與巨蛋白受體相互作用的最小序列被確定為CRAKRNNFKSA(序列號NO: I)。因此，意味著含有該最小序列的片段也包括在該術(shù)語中。術(shù)語“藥劑”無差別地指的是藥物或化合物,諸如治療劑或化合物、標(biāo)記、示蹤物或
顯影化合物。術(shù)語“治療劑”或“藥劑”指的是用于治療疾病、身體或精神病況、創(chuàng)傷或感染的癥狀的藥劑和/或藥物和/或藥品，包括但不限于抗生素、抗癌劑、抗血管生成藥物和中樞神經(jīng)系統(tǒng)水平上活性的分子，例如紫杉醇，可以通過靜脈給藥以治療腦癌。術(shù)語“患者”或“治療的個體”指的是任何接受某種醫(yī)學(xué)治療的患者或個體，包括為了檢測、追蹤、標(biāo)記或顯影某種病況，諸如腫瘤，被進(jìn)行載體-藥劑或化合物綴合物的給藥。優(yōu)選地，患者或治療的個體是哺乳動物，更優(yōu)選的是人類。術(shù)語“病況”指的是任何對或在個體中造成疼痛、不舒服、惡心、疾病或殘疾(精神或身體上的)的狀況，包括神經(jīng)學(xué)疾病、損傷、感染、或慢性或急性疼痛。可以用本發(fā)明治療的神經(jīng)學(xué)疾病包括但不限于腦瘤、腦轉(zhuǎn)移瘤、精神分裂癥，癲癇，阿爾茨海默氏病，帕金森氏病，亨廷頓舞蹈病和中風(fēng)。優(yōu)選實(shí)施方式的詳述本發(fā)明涉及新的運(yùn)送藥劑、藥物或其它分子至腦和/或中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)的載體。該載體允許與所述載體連接或偶聯(lián)(綴合)并且它們本身不能穿過血腦屏障的藥劑、藥物或其它分子通過，以被運(yùn)送穿過血腦屏障。載體-綴合物可以是載體-治療劑綴合物。這樣的綴合物可以呈組合物形式，諸如藥物組合物，用于治療疾病或病況。本發(fā)明基于抑酶肽以非常有效的方式與腦毛細(xì)管內(nèi)皮壁相結(jié)合并穿過腦毛細(xì)管內(nèi)皮壁的發(fā)現(xiàn)而作出。在本領(lǐng)域中已知抑酶肽是有效抑制各種絲氨酸蛋白酶包括胰蛋白酶、糜蛋白酶、激肽釋放酶和胃蛋白酶的堿性多肽。抑酶肽的透內(nèi)皮運(yùn)送比其它蛋白質(zhì)包括轉(zhuǎn)鐵蛋白或血漿銅藍(lán)蛋白高約10-50倍。這種高通過速率不是由破壞血腦屏障完整性而導(dǎo)致的，因?yàn)檎崽堑耐感韵禂?shù)并沒有受到抑酶肽的影響。這種方法是多用途的，因?yàn)樗试S具有非常多樣的治療靶點(diǎn)的小以及大分子的綴
口 ο根據(jù)本發(fā)明，運(yùn)送藥劑穿過血腦屏障的方法包括向個體給予一種藥劑，該藥劑含有與載體諸如抑酶肽或其功能性衍生物相連接的活性成分或藥物物質(zhì)。根據(jù)本發(fā)明，化合物可以動脈內(nèi)、鼻內(nèi)、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、透皮或口服給予患者。藥劑優(yōu)選的是抗血管生成藥物。藥劑可能具有最大分子量160，000道爾頓。優(yōu)選地，藥劑是一種標(biāo)記或藥物，諸如小分子藥物、蛋白、肽或酶。藥物優(yōu)選適于治療患者的神經(jīng)學(xué)疾病或中樞神經(jīng)系統(tǒng)障礙。藥物可以是細(xì)胞毒藥物，標(biāo)記物可以是可檢測的標(biāo)記，諸如放射性標(biāo)記、綠色熒光蛋白、組氨酸標(biāo)簽蛋白或β-半乳糖苷酶。所述藥劑優(yōu)選被傳遞進(jìn)入患 者的中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)。根據(jù)本發(fā)明還另一項(xiàng)優(yōu)選的實(shí)施方案，本發(fā)明的用途、方法、化合物、藥劑、藥物或藥劑不改變患者血腦屏障的完整性。根據(jù)本發(fā)明進(jìn)一步的一項(xiàng)優(yōu)選實(shí)施方案，抑酶肽可以連接到藥劑或化合物上，用以將藥劑或化合物運(yùn)送穿過患者血腦屏障，所述藥劑和化合物適于治療神經(jīng)學(xué)疾病或治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)障礙。本發(fā)明的載體或其功能性衍生物或它們的混合物可以與可檢測的標(biāo)記相連接或用它進(jìn)行標(biāo)記，可檢測的標(biāo)記諸如放射顯影劑，諸如發(fā)射輻射的那些，用于檢測疾病或病況，例如，通過使用放射顯影劑-抗體-載體綴合物而實(shí)施，其中的抗體與疾病或病況特異性抗原相結(jié)合。除了抗體之外的在本領(lǐng)域公知并且使用的其它結(jié)合分子也被本發(fā)明想到?？商娲?，本發(fā)明的載體或其功能性衍生物或者它們的混合物可以與治療劑相連接，以治療疾病或病況，或者可以與它們的混合相連接，或者用它們的混合物標(biāo)記。在允許藥劑運(yùn)送穿過血腦屏障的條件下，通過向個體給予一種本發(fā)明的載體-藥劑綴合物，完成治療。本發(fā)明治療劑可以是讓細(xì)胞殺滅的藥品、藥物、發(fā)出輻射的物質(zhì)、細(xì)胞毒素(例如，化療劑)和/或它們的生物活性片段，和/或它們的混合物，或者它可以是治療、治愈、緩解、改善、減小或抑制所治療個體的疾病或病況的藥劑。治療劑可以是合成產(chǎn)物或者是真菌、細(xì)菌或其它微生物諸如支原體、病毒等等，動物，諸如爬行動物，或者植物來源的產(chǎn)物。治療劑和/或它們的生物活性片段可以是酶活性物質(zhì)和/或它們的片段，或者可通過抑制或阻斷重要和/或必需的細(xì)胞路徑，或者通過與重要和/或必需的天然存在的組分競爭而起作用。本發(fā)明中使用的發(fā)射輻射的放射顯影劑(可檢測的放射標(biāo)記)示例性的為銦-lllj#(technitium_99),或低劑量的碘-131。用于本發(fā)明的可檢測的標(biāo)記可以是放射標(biāo)記、熒光標(biāo)記、核磁共振活性標(biāo)記、發(fā)光標(biāo)記、發(fā)色團(tuán)標(biāo)記、用于PET掃描儀的發(fā)射正電子的同位素、化學(xué)發(fā)光標(biāo)記或者酶標(biāo)記。熒光標(biāo)記包括但不限于綠色熒光蛋白(GFP)、熒光素和若丹明?；瘜W(xué)發(fā)光標(biāo)記包括但不限于，螢光素酶和半乳糖苷酶。酶標(biāo)記包括但不限于，過氧化物酶和磷酸酶。組氨酸標(biāo)簽也可以是可檢測標(biāo)記。設(shè)想到，藥劑在穿過血腦屏障之后可以從載體中釋放出來，例如通過載體和藥劑之間化學(xué)鍵的酶裂解或斷裂。隨后釋放藥劑可以在不存在載體的情況下發(fā)揮其預(yù)期的能力。附圖簡要說明圖I是顯示抑酶肽(·)、p97( )和血漿銅藍(lán)蛋白(■)穿過牛腦毛細(xì)管內(nèi)皮細(xì)胞(BBCECs)的胞轉(zhuǎn)試驗(yàn)的結(jié)果圖；圖2是顯示抑酶肽(·)和轉(zhuǎn)鐵蛋白(O)穿過牛腦毛細(xì)管內(nèi)皮細(xì)胞(BBCECs)的胞轉(zhuǎn)試驗(yàn)的結(jié)果團(tuán)；圖3是說明在血腦屏障模型中，抑酶肽的胞轉(zhuǎn)能力高于轉(zhuǎn)鐵蛋白的條形圖；圖4是SDS-PAGE分析，它說明了抑酶肽完整性不受其穿過BBECE單層的胞轉(zhuǎn)的影響；圖5是以時間的函數(shù)形式表達(dá)的[14C]-蔗糖的清除率的圖。在含有和不含250nM抑酶肽的情況下測定蔗糖的清除率；圖6是顯示牛腦毛細(xì)管內(nèi)皮細(xì)胞(BBCECs)的蔗糖滲透性測試的結(jié)果圖。圖7是以時間的函數(shù)形式表達(dá)的[14C]-蔗糖的清除率的圖，該圖說明抑酶肽不影響血腦屏障完整性。在含有和不含5 μ M抑酶肽的情況下測定蔗糖的清除率；圖8是說明[125I]-抑酶肽在人和大鼠毛細(xì)管中的蓄積條形圖。圖9是說明在人和大鼠毛細(xì)管中抑酶肽攝取的時間過程圖。

圖10是說明抑酶肽-生物素綴合物和抑酶肽具有相同的胞轉(zhuǎn)能力的條形圖；圖11是說明抑酶肽和抑酶肽-生物素綴合物胞轉(zhuǎn)是溫度-依賴型和構(gòu)象依賴型的；圖12Α和12Β是一組說明溫度和加熱對BBCEC細(xì)胞中的㈧抑酶肽和⑶抑酶肽-生物素綴合物胞轉(zhuǎn)的影響的圖；圖13是說明在存在抑酶肽-生物素綴合物的情況下，鏈霉抗生物素胞轉(zhuǎn)的增加的條形圖；圖14是說明LRP拮抗劑、受體-相關(guān)蛋白(RAP)抑制抑酶肽胞轉(zhuǎn)的條形圖；圖15是說明原位腦灌流試驗(yàn)中抑酶肽攝取的條形圖；圖16說明了一種合成的抑酶肽序列；圖17說明了抑酶肽和三種具有相似域的人類蛋白質(zhì)之間的序列比較；圖18是說明轉(zhuǎn)鐵蛋白、抑酶肽和血管肽I的原位腦灌流的條形圖；圖19是說明血管肽I與抑酶肽比較的胞轉(zhuǎn)圖；以及圖20是血管肽I穿過體外血腦屏障模型的胞轉(zhuǎn)圖。
具體實(shí)施例方式通過參考以下的實(shí)施例將更容易地理解本發(fā)明，給出所述實(shí)施例以舉例說明本發(fā)明，而不是限制本發(fā)明的范圍。試驗(yàn)部分適宜載體的確定證明體內(nèi)特征的可重現(xiàn)血腦屏障體外模型已被用于篩選試驗(yàn)以及藥物向腦運(yùn)送的機(jī)理性研究。這種有效的血腦屏障體外模型是由CELLIAL Technologies公司開發(fā)的，其對于可靠評估不同載體到達(dá)腦的能力是最重要的。該模型由牛腦毛細(xì)管內(nèi)皮細(xì)胞和大鼠神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的共培養(yǎng)物組成。它代表了腦內(nèi)皮包括緊密連接的超微結(jié)構(gòu)特征，缺乏膜孔、缺乏透內(nèi)皮通道、對親水性分子的低滲透性以及高電阻。進(jìn)而，該模型在寬范圍的被測試分子的體外和體內(nèi)分析之間顯示了好的相關(guān)系數(shù)。迄今為止，所有獲得的數(shù)據(jù)顯示，這種BBB模型通過再現(xiàn)某些體內(nèi)存在的細(xì)胞環(huán)境的復(fù)雜性而緊密地模擬了體內(nèi)狀況，同時保留了與組織培養(yǎng)物相關(guān)的試驗(yàn)優(yōu)點(diǎn)。由此，很多研究已證實(shí)所述細(xì)胞共培養(yǎng)物是BBB最可重現(xiàn)的體外模型之一。通過使用BBCECs和星形膠質(zhì)細(xì)胞的共培養(yǎng)物建立BBB體外模型。在細(xì)胞培養(yǎng)之前，平板插入物(Millicell-PC 3. O μ M ;直徑30_mm)的上側(cè)用大鼠尾膠原蛋白涂敷。然后將它們置于六-孔含有星形膠質(zhì)細(xì)胞的微量培養(yǎng)板中，并且將BBCECs置于2mL的共培養(yǎng)基中的過濾器的上側(cè)。此BBCEC培養(yǎng)基每周換三次。在這些條件下，7天之后，分化后的BBCECs形成了匯合的單層。在達(dá)到合之后的第5和第7天之間進(jìn)行試驗(yàn)。測定蔗糖的透性系數(shù)以驗(yàn)證內(nèi)皮的滲透性。混合星形膠質(zhì)細(xì)胞的原代培養(yǎng)物是從新生大鼠大腦皮層制備的 (Dehouck M. P. ,Meresse S·，Delorme P. , Fruchart J. C. , Cecchelli, R. AnEasier, Reproductible, and Mass-Production Method to Study Blood-Brain Barrier InVitro. J. Neurochem, 54, 1798-1801, 1990)。簡單的說,在除去腦膜之后，輕輕地使腦組織通過82 μ m尼龍篩網(wǎng)。將星形膠質(zhì)細(xì)胞以在2mL的最佳培養(yǎng)基(DMEM)中的I. 2xl05細(xì)胞/mL濃度置于六-孔微量培養(yǎng)板上，所述培養(yǎng)基補(bǔ)充有10%的熱滅活的胎牛血清。每周換兩次培養(yǎng)基。牛腦毛細(xì)管內(nèi)皮細(xì)胞(BBCECs)是從Cellial Technologies得到的。在存在DMEM培養(yǎng)基的情況下培養(yǎng)細(xì)胞，所述培養(yǎng)基補(bǔ)充有10%(v/v)馬血清和10%熱滅活的小牛血清、2mM的谷酰胺、50 μ g/mL的慶大霉素和Ing/mL的堿性成纖維細(xì)胞生長因子,每隔一天添加。為了確定本發(fā)明的適合載體，使用BBB體外模型進(jìn)行測試。如圖I中所示，進(jìn)行了不同蛋白(抑酶肽(·)、ρ97(^)和血漿銅藍(lán)蛋白(■))穿過牛腦毛細(xì)管內(nèi)皮細(xì)胞(BBCECs的胞轉(zhuǎn)試驗(yàn)。圖2和3顯示了用抑酶肽(·)和轉(zhuǎn)鐵蛋白(ο)并使用和圖I試驗(yàn)中相同的方法進(jìn)行的胞轉(zhuǎn)試驗(yàn)的結(jié)果。將被BBCECs覆蓋的一個插入物置入具有2mL的Ringer-H印es的六-孔微量培養(yǎng)板中，并在37° C下預(yù)孵化2小時。將[125I]-抑酶肽、[125I]-p97、[125I]-血漿銅藍(lán)蛋白或[125I]-轉(zhuǎn)鐵蛋白(最終濃度250nM)加入到被細(xì)胞覆蓋的濾器的上側(cè)。在不同的時間，將插入物轉(zhuǎn)移到另一個孔中以避免可能的[125I]-蛋白被BBECEs的近(abluminal)側(cè)再胞吞。試驗(yàn)?zāi)┢?，通過TCA沉淀作用，[125I]-蛋白在500 μ L孔的較低腔室進(jìn)行測試。所得結(jié)果顯示，在血腦屏障模型中，抑酶肽比轉(zhuǎn)鐵蛋白、Ρ97或血漿銅藍(lán)蛋白具有更高的胞轉(zhuǎn)能力。抑酶肽、ρ97和牛全-轉(zhuǎn)鐵蛋白使用碘-珠(得自Sigma )采用標(biāo)準(zhǔn)操作進(jìn)行碘化。將牛全-轉(zhuǎn)鐵蛋白在O. 1M，pH6. 5(PB)的磷酸鹽緩沖液中稀釋。來自于SynapseTechnologies在pH7. O的中和朽1檬酸鹽中的P97使用這種PB進(jìn)行透析。每種蛋白使用兩顆碘珠。這些珠在Whatman 濾器上使用3mL的PB洗滌兩次，并在60 μ L的PB中重新混懸。將得自于Amersham-Pharmacia biotech的125I(ImCi)在室溫下加入到珠子的混懸液中，保持5分鐘。通過加入100 μ g (80-100 μ L)來啟動每種蛋白的碘化。在室溫下孵化10分鐘之后，將上清液應(yīng)用到預(yù)裝了 5mL交聯(lián)葡聚糖(得自于Pierce)的脫鹽柱上，并且用IOmL的PBS洗脫125I-蛋白質(zhì)。收集O. 5mL的級分，并測定每一 5μ L級分中的放射性。混合與125I-蛋白相應(yīng)的級分，用ρΗ7· 4的Ringer-Hepes透析。放射標(biāo)記的效率在O. 6-1 X 108cpm/100 μ g蛋白之間。從圖1-3中，清楚的是，抑酶肽的胞轉(zhuǎn)能力遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其它的測試蛋白。圖1-3的數(shù)據(jù)總結(jié)在表I中，其中針對不同的蛋白作了比較。M I125I-蛋白(250nM)穿過BBCEC單層的胞轉(zhuǎn)的比較
比較的蛋白_比例(X-倍)_抑酶肽/p978.2 抑酶肽/'血漿銅藍(lán)蛋白44.0抑酶肽/轉(zhuǎn)鐵蛋白_11^6_表2總結(jié)了另一項(xiàng)試驗(yàn)，在該試驗(yàn)中對添加的不同蛋白進(jìn)行了比較。魅抑酶肽穿過血腦屏障的效率
,..^ ,胞轉(zhuǎn)·比例 比較的蛋白
_(pmol/h/cm2) 抑酶肽,蛋白
抑酶肽 2.7 I黑轉(zhuǎn)鐵蛋白(p97) 0.28 10轉(zhuǎn)鐵蛋白 0.14 19乳鐵蛋白 0.05 50鏈霉抗生物素_0,09_30_鑒于表I和表2，可以看出，關(guān)于抑酶肽，與其它的測試蛋白相比，獲得了優(yōu)良的透內(nèi)皮運(yùn)送，并且抑酶肽胞轉(zhuǎn)比這些其它蛋白高約10至50-倍。其穿過BBCEC單層的胞轉(zhuǎn)不影響抑酶肽完整性將最終濃度為250nM的[125I]_蛋白(O. 5-1. 5 μ Ci/檢測)加入到濾器上側(cè)，濾器中含有或不含有置于6-孔平板中的BBCEC細(xì)胞。在每一時間點(diǎn)，將濾器放入6-孔平板的下一個孔中。在試驗(yàn)結(jié)束時，在每一孔中取等份試樣，置于SDS-PAGE。然后通過放射自顯影法測定凝膠。示于圖4中的結(jié)果，顯示其穿越BBCEC單層的胞轉(zhuǎn)不影響抑酶肽完整性。抑酶肽不影響血腦屏障完整性通過測定BBB模型中[14C]蔗糖在生長于濾器上(在星形膠質(zhì)細(xì)胞存在的情況下)的BBCEC單層上的滲透性，進(jìn)行進(jìn)一步的試驗(yàn)以確定抑酶肽在250ηΜ時對BBB完整性的影響，為了實(shí)現(xiàn)該試驗(yàn)，將在插入物上生長的腦內(nèi)皮細(xì)胞單層轉(zhuǎn)移到每孔含有2mL的Ringer-Hepes6-孔平板(基底外側(cè)隔室)，在37° C下保持2小時。Ringer-Hepes溶液是由 150mM NaCl,5. 2mM KC1、2. 2mM Cal2,0. 2mM MgCl2、6mM NaHCO3,5mM H印es、2. 8mM Hepes組成的，pH為7. 4。在每一頂室中，培養(yǎng)基被替換為ImL的含有標(biāo)記了 [14C]的蔗糖的Ringer-ifepes。在不同的時間，將插入物置于另一個孔中。在37° C下，在不含細(xì)胞(□)或具有用BBCEC細(xì)胞涂敷的濾器上，在不含有5 μ M抑酶肽(Λ )或含有5 μ M抑酶肽(O )(圖6)的情況下測定[14C]蔗糖的通過。所得結(jié)果被作圖為作為時間(分鐘)的函數(shù)的蔗糖清除率(μ I)。然后確定蔗糖透性系數(shù)。透性系數(shù)(Pe)計(jì)算如下
權(quán)利要求
1.一種載體，其選自序列為TFFYGGCRGKRNNFKTEEY的血管肽I，及其功能性衍生物。
2.權(quán)利要求I所述的載體，其中所述功能性衍生物包含所述肽的片段。
3.權(quán)利要求I所述的載體，其中所述肽的片段是所述肽的亞組氨基酸。
4.權(quán)利要求I 3任一項(xiàng)所述的載體，其中所述載體穿過血腦屏障的腦滲透作用或胞吞轉(zhuǎn)運(yùn)作用大于抑酶肽和轉(zhuǎn)鐵蛋白的腦滲透作用或胞吞轉(zhuǎn)運(yùn)作用。
5.權(quán)利要求I 4任一項(xiàng)所述的載體，其中所述載體包含與巨蛋白結(jié)合的結(jié)構(gòu)域。
6.權(quán)利要求I所述的載體,其中該載體是血管肽I。
7.一種綴合物，它包含 (a)權(quán)利要求I 6任一項(xiàng)所述的載體；以及 (b)與所述載體連接的藥劑，其中所述綴合物能夠穿過血腦屏障。
8.權(quán)利要求7所述的綴合物，其中所述藥劑的最大分子量為160，000道爾頓。
9.權(quán)利要求8所述的綴合物，其中所述藥劑是小分子藥物，具有l(wèi)OOOg/mol或更小的分子量。
10.權(quán)利要求7所述的綴合物，其中所述藥劑選自由藥品、藥物、蛋白、肽、酶、抗生素、抗癌藥劑、中樞神經(jīng)系統(tǒng)水平上活性的分子、放射顯影劑、抗體、細(xì)胞毒素、可檢測標(biāo)記和抗血管生成化合物組成的組。
11.權(quán)利要求10所述的綴合物，其中所述藥劑是抗癌藥劑。
12.權(quán)利要求11所述的綴合物，其中所述抗癌藥劑是紫杉醇。
13.權(quán)利要求10所述的綴合物，其中所述藥劑是抗體。
14.權(quán)利要求7 13任一項(xiàng)所述的綴合物，其中所述綴合物穿過血腦屏障的轉(zhuǎn)運(yùn)不影響血腦屏障的完整性。
15.一種藥物組合物，它包含權(quán)利要求7 14任一項(xiàng)所述的綴合物，以及藥學(xué)上可接受的賦形劑。
16.權(quán)利要求15所述的藥物組合物，其中該組合物可以通過動脈內(nèi)、鼻內(nèi)、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、透皮或口服給藥。
17.權(quán)利要求7 16任一項(xiàng)所述的綴合物或組合物在制備藥物中的用途，其中所述藥物用于治療患者中的神經(jīng)學(xué)疾病。
18.權(quán)利要求17所述的用途，其中所述神經(jīng)學(xué)疾病選自由腦瘤、腦轉(zhuǎn)移瘤、精神分裂癥、癲癇、阿爾茨海默氏病、帕金森氏病、亨廷頓舞蹈病、中風(fēng)以及血腦屏障相關(guān)的機(jī)能障礙疾病組成的組。
19.權(quán)利要求18所述的用途，其中所述神經(jīng)學(xué)疾病是腦瘤或腦轉(zhuǎn)移瘤。
全文摘要
本發(fā)明涉及作為穿過血腦屏障的載體的抑酶肽及類似物。更特別地，本發(fā)明涉及一種非-侵入性和柔性的方法和載體，該方法和載體用于運(yùn)送化合物或藥物穿過個體的血腦屏障。特別地，本發(fā)明涉及將與之相連接的藥劑運(yùn)送穿過血腦屏障的載體，其中，載體在與藥劑相連接后能夠穿透血腦屏障并由此將藥劑運(yùn)送穿過血腦屏障。
文檔編號A61P25/08GK102775472SQ20121024869
公開日2012年11月14日 申請日期2004年1月5日 優(yōu)先權(quán)日2003年1月6日
發(fā)明者M·德默勒, R·貝利奧 申請人:安吉奧開米公司