專利名稱：雞新城疫、傳染性法氏囊病、病毒性關(guān)節(jié)炎三聯(lián)滅活疫苗的生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是一種用于預(yù)防雞的新城疫、傳染性法氏囊病、病毒性關(guān)節(jié)炎三種疫病油乳劑疫苗的制備方法，屬于獸用生物制品領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
雞新城疫(newcastle disease, ND)具有很高的發(fā)病率和病死率，世界各地多有發(fā)生，且一旦爆發(fā)將給禽養(yǎng)殖業(yè)帶來毀滅性打擊，是危害養(yǎng)禽業(yè)的ー種主要傳染病。OIE將其列為A類疫病。 雞傳染性法氏囊病(Infectiousbursal disease virus, IBD)是由雙 RNA 病毒科中的傳染性法氏囊病病毒引起的ー種特殊疾病，損害幼雞法氏囊。特征是腹瀉、衰竭，法氏囊先發(fā)生顯著炎癥和増大，繼之以萎縮，最后患雞死亡。本病除造成一些雛雞死亡外，還常引起病愈雞免疫抑制，導(dǎo)致免疫接種失敗，増加雛雞對雞新城疫等許多疾病的易感性。雞病毒性關(guān)節(jié)炎(Avian viral arthritis, AVA)是由禽呼腸孤病毒雞病毒性關(guān)節(jié)炎病毒(Avian viralarthritis virus, AVAV)引起的主要發(fā)生于肉用雞的ー種傳染病，以侵害脛跖關(guān)節(jié)、趾關(guān)節(jié)及其肌腱為特征，故又稱傳染性腱鞘炎、腱裂綜合癥或腱滑膜炎等。目前本病分布廣泛，世界各地均有發(fā)生。在急性發(fā)病雞群中，特別是種雞群，常因生長緩慢或停滯、體重減輕，飼養(yǎng)利用率低以及死淘率高等，給養(yǎng)雞業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失。國內(nèi)外現(xiàn)在上市的商品化產(chǎn)品品種很多，但都是很單ー的傳統(tǒng)疫苗，多次使用疫苗尤其是滅活疫苗，不僅增加雞場人力和物カ負(fù)擔(dān)，同時多次抓雞的注射應(yīng)激，還會影響生產(chǎn)性能，致使雞群對疾病的易感性増大。加之近年來毒株的不斷變異，使得雖然推出的多種選擇的疫苗，但仍然出現(xiàn)控制不住疫情發(fā)展的局面。所以迫使我們在以往具有不散毒、抗體滴度高、免疫保護(hù)期長、受母源抗體影響小等優(yōu)點的油乳劑滅活疫苗的基礎(chǔ)上開發(fā)出更新更好更適合預(yù)防這三種流行性疾病的產(chǎn)品。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是制備雞新城疫、傳染性法氏囊病、病毒性關(guān)節(jié)炎的三種抗原，并進(jìn)行合理復(fù)配制成雞新城疫、傳染性法氏囊病、病毒性關(guān)節(jié)炎三種疫病油乳劑疫苗，可以有效預(yù)防雞新城疫、傳染性法氏囊病、病毒性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生，同時也可以大大減少人們的勞動強度，降低養(yǎng)禽業(yè)養(yǎng)殖戶的風(fēng)險，而且保證了公眾健康。該三聯(lián)苗技術(shù)的主要相關(guān)內(nèi)容和所采用的技術(shù)手段(I)在傳統(tǒng)全病毒滅活疫苗的基礎(chǔ)上結(jié)合基因工程亞單位疫苗的復(fù)配，并且保證各単一病毒在聯(lián)苗中均有和單苗一祥的效果。(2)利用美國進(jìn)ロ的Millipore濃縮機將抗原經(jīng)過超強濃縮，抗體產(chǎn)生快，效價高，保護(hù)期長，降低疫病的發(fā)生及蔓延。(濃縮機的生產(chǎn)廠家，美國密理博。型號為CUP50)。(3)技術(shù)方案主要包括以下步驟
I)生產(chǎn)用菌毒種為La Sota株雞新城疫病毒、表達(dá)雞傳染性法氏囊病病毒VP2蛋白的大腸桿菌基因工程菌CCTCC M204038 (E. coli BL21/pET28a_VP2)株和AV2311株病毒性關(guān)節(jié)炎病毒；2)分別按常規(guī)方法用雞胚繁殖La Sota株雞新城疫病毒和AV2311株病毒性關(guān)節(jié)炎病毒，收獲病毒液后經(jīng)濃縮和滅活エ藝制備成滅活病毒液；用加卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)表達(dá)雞傳染性法氏囊病病毒VP2蛋白的大腸桿菌基因工程菌CCTCC M204038CE. coliBL21/pET28a-VP2)株，經(jīng)過破菌、硫酸銨提取和滅菌エ藝制備成表達(dá)的傳染性法氏囊病毒VP2蛋白；3)將以上制備的三種滅活抗原混合后按常規(guī)方法制備滅活佐劑疫苗；以上混合后滅活抗原制成的水相，每O. Iml中含雞新城疫病毒含量不低于IO8 ciEID5tl，每O. Iml中含病毒性關(guān)節(jié)炎病毒含量不低于105_qEID5ci ;，每O. Iml中含傳染性法氏囊病毒VP2蛋白效價按與雞傳染性法氏囊病毒標(biāo)準(zhǔn)陽性血清的瓊擴(kuò)效價計不低于1:16。 本發(fā)明的詳細(xì)描述I.疫苗生產(chǎn)用菌毒種的來源(I)雞新城疫病毒La Sota株(CVCC AV1615)和效檢用雞新城疫強毒北京株(CVCCAV1611株)均購于北京市海淀區(qū)中關(guān)村南大街8號中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，中國獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心.中國獸醫(yī)菌種目錄第二版，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)出版社，2002，pl42-143)；(2)表達(dá) Infectious bursal disease virus (IBDV) VP2 蛋白的大腸桿菌基因エ程菌CCTCCM204038 (E. coli BL21/pET28a_VP2)株(武漢市武昌珞珈山，武漢大學(xué)中國典型培養(yǎng)物保藏中心保管，菌株保藏編號為CCTCC M204038，本專利權(quán)人所持有的專利號為ZL200410080065. 8的發(fā)明專利“一種傳染性法氏囊病基因工程亞單位疫苗的制備方法和應(yīng)用”；榮俊.IBDV VP2基因重組質(zhì)粒Pbv220表達(dá)條件的優(yōu)化。《動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展》2007年第4期；榮俊.傳染性法氏囊病重組亞單位疫苗免疫效カ及安全性試驗.《浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)》2007年第 6 期);傳染性法氏囊病病毒 BC6-85 株(Infectious bursal disease virus, CVCC AV7株)購于北京市海淀區(qū)中關(guān)村南大街8號中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，中國獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心.中國獸醫(yī)菌種目錄第二版，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)出版社，2002，pl35)；(3)禽正呼腸孤病毒(Avian orthoreovirus,本發(fā)明又稱雞病毒性關(guān)節(jié)炎病毒)CVCCAV2311株購于北京市海淀區(qū)中關(guān)村南大街8號中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，中國獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心.中國獸醫(yī)菌種目錄第二版，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)出版社，2002，pl51)。2.生產(chǎn)用種毒的制備雞新城疫病毒La Sota株生產(chǎn)用毒種制備將毒種用滅菌生理鹽水作適當(dāng)稀釋(如10_4或1°_5)，尿囊腔內(nèi)接種10日齡SPF雞胚，每胚0. lml。選接種后72 120小時死亡且病痕明顯的雞胚，分別收獲雞胚液(尿囊液及羊水)，裝于滅菌容器內(nèi)。將檢驗無菌、對1%雞紅細(xì)胞凝集價不低于1:512(微量法)的雞胚液混合，定量分裝于無菌安瓿中，冷凍保存。注明收獲日期、毒種代次等。表達(dá)雞傳染性法氏囊病病毒VP2蛋白的生產(chǎn)用菌種制備一級種子繁殖和鑒定將CCTCC M204038株凍干菌種接種于加卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，35 36°C培養(yǎng)24小時，然后劃線接種于加卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，選取符合標(biāo)準(zhǔn)的典型菌落10個混合于少量LB培養(yǎng)液中，接種于LB瓊脂斜面若干支、置35 36°C培養(yǎng)20 24小時，作為ー級種子。在2 8°C保存，不超過14日；在培養(yǎng)基上傳代，應(yīng)不超過4代。ニ級種子繁殖取一級種子接種于加卡那霉素的LB培養(yǎng)液中，35 36°C培養(yǎng)20 24小吋。置2 8°C保存，應(yīng)不超過3日。雞病毒性關(guān)節(jié)病毒AV2311株生產(chǎn)用毒種制備將毒種用滅菌生理鹽水作適當(dāng)稀釋(如10_3或10_4)，尿囊腔接種10日齡SPF雞胚，每胚O. lml。選擇接種后48 72小時的活胚，分別收獲雞胚液(尿囊液及羊水)，裝于滅菌容器內(nèi)。收獲時應(yīng)逐個檢查胚體，應(yīng)有皮下出血、水腫、發(fā)育小等特異性病痕。將檢驗無菌的雞胚液混合，定量分裝于安瓿中，冷凍保存。注明收獲日期、毒種代次等。3.制苗用病毒液的制備(I)雞新城疫病毒液的制備 接種取生產(chǎn)用毒種，用滅菌生理鹽水作適當(dāng)稀釋(如10_4或10_5)，接種10 11日齡易感雞胚，每胚O. 1ml，接種后密封針孔，置36 37°C繼續(xù)孵育，不必翻胚。孵育與觀察雞胚接種后，毎日照胚I次，將60小時前死亡的雞胚棄去。此后，每4 6小時照胚I次，死亡的胚隨時取出，至96小吋，無論死亡與否，全部取出，氣室向上，置于2 8°C冷卻12 24小時。收獲將冷卻的雞胚取出，收獲雞胚尿囊液(先收活胚后收死胚)。吸取胚液放于50000ml滅菌容器內(nèi)，抽樣測定紅細(xì)胞凝集價。凝集價低于1:256 (微量法)者應(yīng)棄去。同時按現(xiàn)行《中國獸藥典》進(jìn)行無菌檢驗(可不移植)，應(yīng)無菌生長。收獲的胚液滅活前在2 8°C保存，應(yīng)不超過5日。濃縮將收獲的胚液在2 8°C條件下，用超濾濃縮機濃縮，至少濃縮3倍，抽樣測定紅細(xì)胞凝集價，凝集價不低于1:1024 (微量法)時停止?jié)饪s，按中華人民共和國獸藥典(中國獸藥典委員會.中華人民共和國獸藥典ニ〇〇五年版三部.中國農(nóng)業(yè)出版社，2005，本發(fā)明以下簡稱為《中國獸藥典》)規(guī)定的方法進(jìn)行無菌檢驗(可不移植)，應(yīng)無菌生長，并留樣備測毒價。濃縮后的胚液隨即進(jìn)行滅活。滅活將雞新城疫病毒液導(dǎo)入滅活罐內(nèi)，計量加入10%甲醛溶液，開啟攪拌機攪拌，使其充分混合，甲醛的最終濃度為O. 1%。加甲醛溶液后導(dǎo)入另一滅活罐中，以避免罐ロ附近粘附的病毒未能接觸滅活劑。37°c滅活16小時(以罐內(nèi)溫度達(dá)到37°C開始計時，開啟攪拌機連續(xù)攪拌)后取出，放2 8°C保存，應(yīng)不超過I個月。(2)雞傳染性法氏囊病病毒VP2蛋白的制備菌液培養(yǎng)用培養(yǎng)罐通氣培養(yǎng)，按容積裝入70%培養(yǎng)基(加卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基)及花生油消泡劑。滅菌后按培養(yǎng)基量的2% 4%接種CCTCC M204038 ニ級種子菌液，37 °C培養(yǎng)，待菌液的0D600值達(dá)到O. 6 I. 0，加入O. 2mol/La-乳糖，使終濃度達(dá)到O. 02mol/L，再繼續(xù)培養(yǎng)5 8h。開始小量通氣，逐漸增大氣量。破菌培養(yǎng)結(jié)束后，離心收集菌體。收集的菌體用PBS液清洗2次，將收集的菌體加適量PBS液進(jìn)行重懸，在4°C下用超聲波破碎。破碎后的菌液，3000r/min,離心30min，收集上清液。經(jīng)硫酸銨沉淀后，收集VP2蛋白液隨即進(jìn)行滅活。
滅菌將收集的上清液中按比例加入10%的甲醛溶液，開啟攪拌機攪拌，使其充分混合，甲醛溶液的最終濃度為O. 2%，然后將胚液導(dǎo)入另ー滅活罐內(nèi)，37°C滅活12小時(以罐內(nèi)液體溫度達(dá)到37°C開始計吋)，以滅活殘存的大腸桿菌及毒素。2 8°C保存，不超過7日；_15°C以下保存，不超過60日。(3)雞病毒性關(guān)節(jié)炎病毒液的制備接種取生產(chǎn)用毒種，用滅菌生理鹽水作適當(dāng)稀釋(如10_2或10_3)，接種9 10日齡易感雞胚，每胚O. 1ml，接種后密封針孔，置36 37°C繼續(xù)孵育，不必翻胚。孵育和觀察雞胚接種后，毎日照胚I次，將30小時前死亡的雞胚棄去。此后，每4 6小時照胚I次，死亡雞胚隨時取出，直至96小時，無論死亡與否，全部取出，氣室向上直立，置于2 8°C冷卻12 24小時。收獲將冷卻的雞胚取出，收獲雞胚尿囊液(先收活胚后收死胚)。吸取胚液放于50000ml滅菌容器內(nèi)，抽樣測定病毒含量，應(yīng)彡105 0EID50/0. lml。同時按現(xiàn)行《中國獸藥典》 進(jìn)行無菌檢驗(可不移植)，應(yīng)無細(xì)菌生長。收獲的胚液滅活前在2 8°C保存，應(yīng)不超過5曰。濃縮將收獲的雞胚病毒液在2 8°C條件下，用超濾濃縮機濃縮，至少濃縮3倍，抽樣測定病毒含量，病毒含量不低于105 5EID5Q/0. Iml時停止?jié)饪s。按現(xiàn)行《中國獸藥典》進(jìn)行無菌檢驗(可不移植)，應(yīng)無細(xì)菌生長，并留樣備測毒價。濃縮后的胚液隨即進(jìn)行滅活。滅活將病毒性關(guān)節(jié)炎病毒液導(dǎo)入滅活罐內(nèi)，計量加入10%甲醛溶液，開啟攪拌機攪拌，使其充分混合，甲醛的最終濃度為O. 1%。加甲醛溶液后導(dǎo)入另一滅活罐中，以避免罐ロ附近粘附的病毒未能接觸滅活劑。37°c滅活16小時(以罐內(nèi)溫度達(dá)到37°C開始計時，開啟攪拌機連續(xù)攪拌)后取出，放2 8°C保存，應(yīng)不超過I個月。4.滅活疫苗的制備經(jīng)過檢驗合格后的半成品抗原進(jìn)行疫苗制備。油相制備取優(yōu)質(zhì)注射用白油94份，硬脂酸鋁2份，在油相制備罐中混合均勻并加熱至80°C后，再加司本-80 6份，至溫度達(dá)到125°C時維持30分鐘，冷卻后備用。水相制備將檢驗合格的雞新城疫病毒液、雞傳染性法氏囊病病毒VP2蛋白、病毒性關(guān)節(jié)炎病毒液等量混合，每O. Iml水相中雞新城疫病毒含量不低于IO8 tlEID5tl，病毒性關(guān)節(jié)炎病毒含量不低于IO5 tlEID5tl，傳染性法氏囊病毒VP2蛋白與雞傳染性法氏囊病毒標(biāo)準(zhǔn)陽性血清的瓊擴(kuò)效價不低于1:16。取滅菌后的吐溫-804份，加入配液罐中，同時加混合抗原液96份，充分振搖，開動攪拌電機攪拌20 30分鐘，使吐溫-80完全溶解。乳化取油相2份放入乳化罐中，開動電機，慢速轉(zhuǎn)動攪拌，同時徐徐加入水相I份后，再以4000r/min攪拌30 40分鐘，在終止攪拌前加入1%硫柳汞溶液，使其最終濃度為O. 01%。乳化后，取疫苗IOml加入離心管中，以3000r/min離心15分鐘，管底析出的水相應(yīng)^ O. 5ml。5成品檢驗( I)性狀外觀乳白色乳剤。劑型油包水型。取一清潔吸管，吸取少量疫苗滴入冷水中，除第I滴外，均不擴(kuò)散。
穩(wěn)定性吸取疫苗IOml加入離心管中，以3000r/min離心15分鐘，管底析出的水相為O. Imlo黏度按現(xiàn)行《中國獸藥典》附錄進(jìn)行，黏度為52cP，符合規(guī)定。(2)裝量檢查按現(xiàn)行《中國獸藥典》附錄進(jìn)行，測定3瓶結(jié)果為251. 3ml,252. lml、251. 5ml,符合規(guī)定。(3)無菌檢驗按現(xiàn)行《中國獸藥典》進(jìn)行，無菌生長。(4)安全檢驗用7日齡SPF雞10只，每只肌肉或頸部皮下注射疫苗1ml，觀察14日，結(jié)果試驗雞均健活，無任何局部和全身不良反應(yīng)。(5)效カ檢驗I)雞新城疫部分效カ檢驗采用血清學(xué)方法進(jìn)行檢驗，結(jié)果不符合規(guī)定吋，可采用 免疫攻毒法進(jìn)行檢驗。血清學(xué)方法用30日齡SPF雞15只，10只各皮下或肌肉注射疫苗20 μ 1，另5只不免疫作對照。接種后21日，每只雞分別采血，分離血清，按現(xiàn)行《中國獸藥典》進(jìn)行HI抗體效價測定。免疫組HI抗體效價的幾何平均值應(yīng)不低于1:16 (微量法)，未免疫對照組HI抗體效價的幾何平均值應(yīng)不高于1:4 (微量法)。免疫攻毒法用30日齡SPF雞15只，10只各皮下或肌肉注射疫苗20 μ 1，另5只不免疫作對照。接種后21日，每只雞各肌肉注射雞新城疫病毒北京株強毒(CVCC AV1611株)IO5tlELD5tl，觀察14日。對照組應(yīng)全部死亡，免疫組應(yīng)保護(hù)至少7只。2)雞傳染性法氏囊病部分效カ檢驗以下方法任擇其一。血清學(xué)方法取21日齡SPF雞20只，其中10只各肌肉或頸部皮下注射疫苗O. 2ml,另外10只不免疫作為對照，同群飼養(yǎng)。接種后21日，每只雞分別采血，分離血清，做瓊脂免疫擴(kuò)散試驗。免疫雞應(yīng)至少有8只瓊擴(kuò)效價不低于1:8，對照雞應(yīng)全部陰性。免疫攻毒法取21日齡SPF雞20只，其中10只各肌肉或頸部皮下注射疫苗O. 2ml,另外10只不免疫作為對照，同條件下隔離飼養(yǎng)。接種后21日，所有免疫雞和對照雞，每只點眼途徑接種100倍稀釋的雞傳染性法氏囊病強毒BC6-85株毒液O. Iml (實含毒量> 100個BID)。攻毒后，每天觀察雞只的臨床表現(xiàn)，記錄發(fā)病和死亡雞數(shù)，至72 96小吋，撲殺存活雞，逐只剖解，觀察法氏囊等病變。免疫雞應(yīng)至少8只正常，不出現(xiàn)法氏囊病變；對照雞應(yīng)至少8只發(fā)病，出現(xiàn)明顯的法氏囊病變(如胸肌或腿肌條狀出血、法氏囊腫大或萎縮、發(fā)黃、內(nèi)有膠凍樣分泌物等ー種以上病變)。3)病毒性關(guān)節(jié)炎部分效カ檢驗以下方法任擇其一。血清學(xué)方法取21日齡SPF雞15只，其中10各頸部皮下或肌肉注射疫苗O. 2ml,另外5只不免疫作為對照，同群飼養(yǎng)。21日后，每只雞分別采血、分離血清，做瓊脂免疫擴(kuò)散試驗，免疫雞抗體陽性數(shù)應(yīng)不少于9只，對照雞應(yīng)全部陰性。免疫攻毒法取21日齡SPF雞15只，其中10各頸部皮下或肌肉注射疫苗O. 2ml,另外5只不免疫作為對照，同群飼養(yǎng)。21 28日后，每只雞經(jīng)腳墊接種雞病毒關(guān)節(jié)炎病毒AV2311株強毒，O. 2ml (含2X IO4ELD50)/只，觀察120小時，檢查趾、跗關(guān)節(jié)病變。對照組應(yīng)至少有8只雞發(fā)病，免疫組應(yīng)全部保護(hù)。(6)甲醛、汞類防腐劑殘留量測定按現(xiàn)行《中國獸藥典》進(jìn)行測定，結(jié)果應(yīng)符合規(guī)定。
本發(fā)明的積極意義本發(fā)明涉及ー種雞新城疫、傳染性法氏囊病、病毒性關(guān)節(jié)炎三聯(lián)滅活疫苗的生產(chǎn)方法。本發(fā)明采用新城疫病毒La Sota株(CVCCAV1615)、表達(dá)雞傳染性法氏囊病病毒VP2蛋白的大腸桿菌基因工程菌E. coli BL21/pET28a-VP2株(CCTCC M204038株)和病毒性關(guān)節(jié)炎CVCC AV2311株作為生產(chǎn)菌毒種，超強濃縮エ藝和優(yōu)質(zhì)佐劑制備成滅活疫苗，免疫動物后抗體產(chǎn)生快，效價高，保護(hù)期長，降低了疫病的發(fā)生及蔓延。本發(fā)明涉及的微生物信息(I)雞新城疫病毒La Sota株(CVCC AV1615)和效檢用雞新城疫強毒北京株(CVCCAV1611株)均購于北京市海淀區(qū)中關(guān)村南大街8號中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，中國獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心.中國獸醫(yī)菌種目錄第二版，中國農(nóng)業(yè)科學(xué) 技術(shù)出版社，2002，pl42-143)；(2)表達(dá) Infectious bursal disease virus (IBDV) VP2 蛋白的大腸桿菌基因工程菌E. coliBL21/pET28a-VP2株(武漢市武昌珞珈山，武漢大學(xué)中國典型培養(yǎng)物保藏中心保管，菌株保藏編號為CCTCC M204038，本專利權(quán)人所持有的專利號為ZL200410080065. 8的發(fā)明專利“一種傳染性法氏囊病基因工程亞單位疫苗的制備方法和應(yīng)用”；榮俊.IBDV VP2基因重組質(zhì)粒Pbv220表達(dá)條件的優(yōu)化?！秳游镝t(yī)學(xué)進(jìn)展》2007年第4期；榮俊.傳染性法氏囊病重組亞單位疫苗免疫效カ及安全性試驗.《浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)》2007年第6期)；傳染性法氏囊病病毒 BC6-85 株(Infectious bursal disease virus, CVCC AV7 株)購于北京市海淀區(qū)中關(guān)村南大街8號中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，中國獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心.中國獸醫(yī)菌種目錄第二版，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)出版社，2002，pl35);(3)禽正呼腸孤病毒(Avian orthoreovirus,本發(fā)明又稱雞病毒性關(guān)節(jié)炎病毒)CVCCAV2311株購于北京市海淀區(qū)中關(guān)村南大街8號中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，中國獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心.中國獸醫(yī)菌種目錄第二版，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)出版社，2002，pl51)。


圖I本發(fā)明エ藝流程圖Al熏蒸消毒是指消毒劑采用熏蒸的方法對培養(yǎng)雞胚的孵化器進(jìn)行徹底消毒。A3NDV、AVA接種雞胚指雞胚在孵化至10 11日齡時接種雞新城疫病毒、病毒性關(guān)節(jié)炎病毒在雞胚內(nèi)進(jìn)行繁殖。A4收毒在培養(yǎng)到規(guī)定的時期，將雞胚中繁殖的雞胚液病毒進(jìn)行收獲。A5病毒濃縮將收獲的含毒雞胚液在2 8°C條件下采用美國Millipore超濾濃縮機進(jìn)行抗原的濃縮，使其提高抗原含量，并同時對抗原做了進(jìn)ー步的純化。A6測毒價測NDV抗原的血凝價、AVA抗原的病毒含量。B5破碎指傳染性法氏囊的VP2蛋白離心后收集菌體，加適量的PBS液進(jìn)行重懸，在4°C下用超聲波破碎，使其菌體內(nèi)的蛋白充分釋放出來。C滅活將A組和B組的抗原液都用適量的甲醛溶液進(jìn)行滅活，滅活掉抗原活性及細(xì)菌外毒素。D半成品檢驗是指要進(jìn)行滅活檢驗、VP2蛋白含量檢測、無菌檢驗、內(nèi)毒素檢驗，使其各個指標(biāo)在半成品時合格，才能進(jìn)行下一歩。E抗原配比指水相中雞新城疫、傳染性法氏囊病、病毒性關(guān)節(jié)炎的抗原配比是1:1:1。F乳化指將含有抗原的水相和油相按照一定的配比方法充分的混合在一起，即成為成品的疫苗狀態(tài)。最佳實施方式實施例I
(一)抗原制備以及半成品檢驗I.雞新城疫病毒液的制備(I)接種取生產(chǎn)用毒種，用滅菌生理鹽水作10_4稀釋，接種10日齡易感雞胚200枚，每胚O. 1ml，接種后密封針孔，置37°C繼續(xù)孵育，不翻胚。(2)孵育與觀察雞胚接種后，毎日照胚I次，將60小時前死亡的雞胚11枚棄去。此后，每4 6小時照胚I次，死亡的胚隨時取出，至96小時，共死亡155枚，全部取出，氣室向上，置于2 8°C冷卻12小時。(3)收獲將冷卻的雞胚取出，收獲雞胚尿囊液(先收活胚后收死胚)。共收雞胚189枚，約2450ml尿囊液，抽樣測定紅細(xì)胞凝集價。凝集價為1:256(微量法)。按現(xiàn)行《中國獸藥典》進(jìn)行無菌檢驗。收獲的胚液滅活前在2 8°C保存。(4)濃縮將收獲的胚液在2 8°C條件下，用超濾濃縮機濃縮，濃縮至800ml，抽樣測定紅細(xì)胞凝集價，凝集價為1:1024 (微量法)，按《中國獸藥典》進(jìn)行無菌檢驗，并留樣備測毒價。濃縮后的胚液隨即進(jìn)行滅活。(5)滅活將雞新城疫病毒液導(dǎo)入滅活罐內(nèi)，加入10%甲醛溶液8ml，開啟攪拌機攪拌，使其充分混合，甲醛的最終濃度為O. 1%。加甲醛溶液后導(dǎo)入另一滅活罐中，以避免罐ロ附近粘附的病毒未能接觸滅活劑。37°c滅活16小時(以罐內(nèi)溫度達(dá)到37°C開始計時，開啟攪拌機連續(xù)攪拌)后取出，放2 8°C保存。2.雞傳染性法氏囊病病毒VP2蛋白的制備(I)菌液培養(yǎng)用培養(yǎng)罐通氣培養(yǎng)，按容積裝入70%培養(yǎng)基(加卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基)及花生油消泡劑。滅菌后按培養(yǎng)基量的4%接種ニ級種子菌液，37°C培養(yǎng)，待菌液的0D600值達(dá)到O. 8，加入O. 2mol/L α -乳糖，使終濃度達(dá)到O. 02mol/L,再繼續(xù)培養(yǎng)8h。開始小量通氣，逐漸增大氣量。(2)破菌培養(yǎng)結(jié)束后，離心收集菌體。收集的菌體用PBS液清洗2次，將收集的菌體加適量PBS液進(jìn)行重懸，在4°C下用超聲波破碎。破碎后的菌液，3000r/min,離心30min，收集上清液1000ml。經(jīng)硫酸銨沉淀后，收集VP2蛋白液隨即進(jìn)行滅活。(3)滅菌將收集的上清液中按比例加入10%的甲醛溶液，開啟攪拌機攪拌，使其充分混合，甲醛溶液的最終濃度為O. 2%，然后將胚液導(dǎo)入另ー滅活罐內(nèi)，37°C滅活12小時(以罐內(nèi)液體溫度達(dá)到37°C開始計吋)，以滅活殘存的大腸桿菌及毒素。2 8°C保存。3.雞病毒性關(guān)節(jié)炎病毒液的制備(I)接種取生產(chǎn)用毒種，用滅菌生理鹽水作10_3稀釋，接種10日齡易感雞胚200枚，每胚O. 1ml，接種后密封針孔，置37°C繼續(xù)孵育。(2)孵育和觀察雞胚接種后，毎日照胚I次，將30小時前死亡的雞胚5枚棄去。此后,姆4 6小時照胚I次,死亡雞胚隨時取出，直至96小時,死亡168枚,全部取出，氣室向上直立，置于2 8°C冷卻12小時。(3)收獲將冷卻的雞胚取出，收獲195枚雞胚的尿囊液(先收活胚后收死胚)共2500ml。抽樣測定病毒含量。同時按現(xiàn)行《中國獸藥典》進(jìn)行無菌檢驗，收獲的胚液滅活前在2 8°C保存。(4)濃縮將收獲的雞胚病毒液在2 8°C條件下，用超濾濃縮機濃縮至800ml，抽樣測定病毒含量。按現(xiàn)行《中國獸藥典》進(jìn)行無菌檢驗。濃縮后的胚液隨即進(jìn)行滅活。(5)滅活將病毒性關(guān)節(jié)炎病毒液導(dǎo)入滅活罐內(nèi)，加入10%甲醛溶液8ml，開啟攪拌機攪拌，使其充分混合。加甲醛溶液后導(dǎo)入另一滅活罐中，以避免罐ロ附近粘附的病毒未能接觸滅活劑。37°C滅活16小時(以罐內(nèi)溫度達(dá)到37°C開始計吋，開啟攪拌機連續(xù)攪拌)后取出，放2 8°C保存。 5.半成品檢驗(I)雞新城疫病毒液I)病毒含量測定將濃縮后滅活前取出的胚液進(jìn)行10倍系列稀釋，取10_7、10_8、10_93個稀釋度，各尿囊腔內(nèi)接種10日齡SPF雞胚5個，每胚O. 1ml，置37°C繼續(xù)孵育，毎日照胚2次，觀察5日，無論死胚、活胚均應(yīng)測定紅細(xì)胞凝集價，凝集價不低于1:128 (微量法)者，判為感染，計算EID5tl，結(jié)果O. Iml病毒含量為IO8 7EID5tl的胚液。2)紅細(xì)胞凝集價測定取濃縮后滅活前的胚液，按現(xiàn)行《中國獸藥典》進(jìn)行測定，其凝集價為1:1024 (微量法)。3)滅活檢驗取10日齡SPF雞胚6個，尿囊腔內(nèi)接種滅活病毒液，每個O. 2ml，置37°C繼續(xù)孵育，每日照胚2次，觀察5日。雞胚健活，對所有胚液分別測定紅細(xì)胞凝集價，均不出現(xiàn)凝集，將胚液收獲再盲傳一代，仍無凝集價，滅活完全。4)無菌檢驗取滅活的胚液按現(xiàn)行《中國獸藥典》進(jìn)行檢驗，結(jié)果無菌生長。(2)雞傳染性法氏囊病病毒VP2蛋白I) VP2含量檢測將制苗用VP2蛋白液對雞傳染性法氏囊病病毒陽性血清(購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所)按常規(guī)方法進(jìn)行瓊脂擴(kuò)散試驗，上清液中表達(dá)產(chǎn)物VP2的滴度(AGP效價)為1:64。2)無菌檢驗按《中國獸藥典》進(jìn)行，結(jié)果無菌生長。3)內(nèi)毒素檢測將滅菌后的VP2蛋白液按“附注”方法進(jìn)行內(nèi)毒素檢測，用內(nèi)毒素< O. 125EU/ml的氯化鈉注射液將VP2蛋白稀釋1000倍，鱟試劑盒檢測為陰性。(3)病毒性關(guān)節(jié)炎病毒液I)無菌檢驗取滅活的胚液按現(xiàn)行《中國獸藥典》進(jìn)行檢驗，結(jié)果無菌生長。2)滅活檢驗取7日齡SPF雞胚6個，卵黃囊接種滅活濃縮胚液，每胚O. 2ml，置37°C繼續(xù)孵育，每日照胚2次，觀察5日。雞胚均健活，收獲胚液并逐個檢查胎兒，沒有任何病變。將陰性樣品的胚液混合，再盲傳一代，仍無特異性病痕，滅活完全。3)病毒含量測定將濃縮后滅活前的病毒也用滅菌生理鹽水作10倍系列稀釋，取10_4、10_5、10_63個稀釋度，分別卵黃囊接種7曰齡SPF雞胚5個，每胚O. lml，記錄24 168小時內(nèi)死亡且胎兒病變明顯的雞胚數(shù)，結(jié)果每O. Iml病毒含量為IO5 7EID5tl，可用于制苗。(ニ)疫苗制備
(I)油相制備取優(yōu)質(zhì)注射用白油3760ml，硬脂酸鋁80ml，在油相制備罐中混合均勻并加熱至80°C后，再加司本-80240ml，至溫度達(dá)到125°C時維持30分鐘，冷卻后備用。(2)水相制備將檢驗合格的雞新城疫病毒液、傳染性法氏囊病病毒VP2蛋白、病毒性關(guān)節(jié)炎病毒液各700ml混合(混合后每O. Iml中含雞新城疫病毒含量不低于108_0EID50,每O. Iml中含病毒性關(guān)節(jié)炎病毒含量不低于IO5 ciEID5tl ;，每O. Iml中含傳染性法氏囊病毒VP2蛋白效價按與雞傳染性法氏囊病毒標(biāo)準(zhǔn)陽性血清的瓊擴(kuò)效價計不低于1:16)。取滅菌后的吐溫-80 28ml，加入配液罐中，同時加混合抗原液2100ml，充分振搖，開動攪拌電機攪拌30分鐘，使吐溫-80完全溶解。(3)乳化取油相4200ml放入乳化罐中，開動電機，慢速轉(zhuǎn)動攪拌，同時徐徐加入水相I份后，再以4000r/min攪拌30分鐘，在終止攪拌前加入1%硫柳汞溶液60ml。乳化后，取疫苗IOml加入離心管中，以3000r/min離心15分鐘，管底無析出的水相。(4)分裝分裝IOOml/瓶，共60瓶，加蓋密封。實施例2成品檢驗——實驗室試制ー批三聯(lián)滅活疫苗約6000ml，批號為2010001。I.性狀外觀乳白色乳剤。劑型油包水型。取一清潔吸管，吸取少量疫苗滴入冷水中，除第I滴外，均不擴(kuò)散。穩(wěn)定性吸取疫苗IOml加入離心管中，以3000r/min離心15分鐘，管底析出的水相為O. Imlo黏度按現(xiàn)行《中國獸藥典》附錄進(jìn)行，黏度為52cP，符合規(guī)定。2.裝量檢查按現(xiàn)行《中國獸藥典》附錄進(jìn)行，測定3瓶結(jié)果為251. 3ml,252. lml、251. 5ml,符合規(guī)定。3.無菌檢驗按現(xiàn)行《中國獸藥典》進(jìn)行，無菌生長。4.安全檢驗用7日齡SPF雞10只，每只肌肉或頸部皮下注射疫苗1ml，觀察14日，結(jié)果試驗雞均健活，無任何局部和全身不良反應(yīng)。5.效カ檢驗(I)雞新城疫部分效カ檢驗采用血清學(xué)方法進(jìn)行檢驗，結(jié)果不符合規(guī)定時，可采用免疫攻毒法進(jìn)行檢驗。I)血清學(xué)方法用30日齡SPF雞15只，10只各皮下或肌肉注射疫苗20 μ 1，另5只不免疫作對照。接種后21日，每只雞分別采血，分離血清，按現(xiàn)行《中國獸藥典》進(jìn)行HI抗體效價測定。免疫組HI抗體效價的幾何平均值應(yīng)不低于1:24.3 (微量法)，未免疫對照組HI抗體效價的幾何平均值均不高于1:2 (微量法)。2)免疫攻毒法用30日齡SPF雞15只，10只各皮下或肌肉注射疫苗20 μ 1，另5只不免疫作對照。接種后21日，每只雞各肌肉注射雞新城疫病毒北京株強毒(CVCCAV1611株)IO5tlELD5tl，觀察14日。對照組5只全部死亡，免疫組10只全部保護(hù)。(2)雞傳染性法氏囊病部分效カ檢驗以下方法任擇其一。、
I)血清學(xué)方法取21日齡SPF雞20只，其中10只各肌肉或頸部皮下注射疫苗O. 2ml，另外10只不免疫作為對照，同群飼養(yǎng)。接種后21日，每只雞分別采血，分離血清，做瓊脂免疫擴(kuò)散試驗。免疫雞10只瓊擴(kuò)效價為1:21，對照雞全部陰性。2)免疫攻毒法取21日齡SPF雞20只，其中10只各肌肉或頸部皮下注射疫苗O. 2ml，另外10只不免疫作為對照，同條件下隔離飼養(yǎng)。接種后21日，所有免疫雞和對照雞，每只點眼途徑接種100倍稀釋的雞傳染性法氏囊病強毒BC6-85株毒液O. Iml (實含毒量> 100個BID)。攻毒后，每天觀察雞只的臨床表現(xiàn)，記錄發(fā)病和死亡雞數(shù)，至72 96小吋，撲殺存活雞，逐只剖解，觀察法氏囊等病變。免疫雞10只均為正常，未出現(xiàn)法氏囊病變；對照雞10只均發(fā)病(死亡？)，剖檢出現(xiàn)明顯的法氏囊病變(如胸肌或腿肌條狀出血、法氏囊腫大或萎縮、發(fā)黃、內(nèi)有膠凍樣分泌物等ー種以上病變)。(3)病毒性關(guān)節(jié)炎部分效カ檢驗以下方法任擇其一。I)血清學(xué)方法取21日齡SPF雞15只，其中10各頸部皮下或肌肉注射疫苗O. 2ml，另外5只不免疫作為對照，同群飼養(yǎng)。21日后，每只雞分別采血、分離血清，做瓊脂免疫擴(kuò)散 試驗，免疫雞10只雞血清抗體全部陽性，對照雞全部陰性。2)免疫攻毒法取21日齡SPF雞15只，其中10各頸部皮下或肌肉注射疫苗O. 2ml，另外5只不免疫作為對照，同群飼養(yǎng)。21 28日后，每只雞經(jīng)腳墊接種雞病毒關(guān)節(jié)炎病毒AV2311株強毒，O. 2ml (含2X IO4ELD50)/只，觀察120小時，檢查趾、跗關(guān)節(jié)病變。對照組5只雞發(fā)病，免疫組10只雞保護(hù)。2010001批疫苗的效檢結(jié)果見表I。表I 2010001批疫苗的效檢結(jié)果
權(quán)利要求
1.ー種雞新城疫、傳染性法氏囊病、病毒性關(guān)節(jié)炎三聯(lián)滅活疫苗，其特征在于該疫苗主要成分是滅活的La Sota株雞新城疫病毒、AV2311株病毒性關(guān)節(jié)炎病毒和CCTCC M204038(E. coli BL21/pET28a-VP2)株大腸桿菌基因工程菌表達(dá)的傳染性法氏囊病毒VP2蛋白和疫苗佐劑。
2.如權(quán)利要求I所述ー種雞新城疫、傳染性法氏囊病、病毒性關(guān)節(jié)炎三聯(lián)滅活疫苗的生產(chǎn)方法，其特征在于 (1)生產(chǎn)用菌毒種為LaSota株雞新城疫病毒、表達(dá)雞傳染性法氏囊病病毒VP2蛋白的大腸桿菌基因工程菌CCTCC M204038 (E. coli BL21/pET28a_VP2)株和AV2311株病毒性關(guān)節(jié)炎病毒； (2)分別按常規(guī)方法用雞胚繁殖LaSota株雞新城疫病毒和AV2311株病毒性關(guān)節(jié)炎病毒，收獲病毒液后經(jīng)濃縮和滅活エ藝制備成滅活病毒液；用加卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)表達(dá)雞傳染性法氏囊病病毒VP2蛋白的大腸桿菌基因工程菌CCTCC M204038 (E. coliBL21/pET28a-VP2)株，經(jīng)過破菌、硫酸銨提取和滅菌エ藝制備成表達(dá)的傳染性法氏囊病毒VP2蛋白； (3)將以上制備的三種滅活抗原混合后按常規(guī)方法制備滅活佐劑疫苗。
3.如權(quán)利要求2所述ー種雞新城疫、傳染性法氏囊病、病毒性關(guān)節(jié)炎三聯(lián)滅活疫苗的生產(chǎn)方法，其特征在于混合后滅活抗原制成的水相，每O. Iml中含雞新城疫病毒含量不低于IO8 tlEID5tl，每O. Iml中病毒性關(guān)節(jié)炎病毒含量不低于105_°EID5(I。
4.如權(quán)利要求2所述ー種雞新城疫、傳染性法氏囊病、病毒性關(guān)節(jié)炎三聯(lián)滅活疫苗的生產(chǎn)方法，其特征在于混合后滅活抗原制成的水相，每O. Iml中含傳染性法氏囊病毒VP2蛋白效價按與雞傳染性法氏囊病毒標(biāo)準(zhǔn)陽性血清的瓊擴(kuò)效價計不低于1:16。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種雞新城疫、傳染性法氏囊病、病毒性關(guān)節(jié)炎三聯(lián)滅活疫苗的生產(chǎn)方法。本發(fā)明采用新城疫病毒La Sota株、表達(dá)雞傳染性法氏囊病病毒VP2蛋白的大腸桿菌基因工程菌E.coli BL21/pET28a-VP2株和病毒性關(guān)節(jié)炎AV2311株作為生產(chǎn)菌毒種，超強濃縮工藝和優(yōu)質(zhì)佐劑制備成滅活疫苗，免疫動物后抗體產(chǎn)生快，效價高，保護(hù)期長，降低了疫病的發(fā)生及蔓延。
文檔編號A61K39/295GK102688486SQ201210199909
公開日2012年9月26日 申請日期2012年6月18日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月18日
發(fā)明者宮曉, 左青山, 李曉林, 李芳 , 王紅, 范根成, 郭偉偉 申請人:青島易邦生物工程有限公司