金鯧魚(yú)內(nèi)臟蛋白酶的分離方法、蛋白酶及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及魚(yú)類(lèi)加工領(lǐng)域，具體涉及金鯧魚(yú)內(nèi)臟蛋白酶的分離方法，還涉及采用上述分離方法得到的蛋白酶及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]隨著金鯧魚(yú)需求量的大量增加，加工過(guò)程有大量下腳料產(chǎn)生并且基本都沒(méi)有開(kāi)發(fā)利用，其中占金鯧魚(yú)體重的5%?8%的內(nèi)臟更是如此。這不僅造成了水產(chǎn)資源的巨大浪費(fèi)還造成了嚴(yán)重的環(huán)境污染。因此，金鯧魚(yú)內(nèi)臟的高值利用是一個(gè)亟待解決的問(wèn)題。
[0003]蛋白酶是生物體內(nèi)的一類(lèi)酵素(酶)，它們能夠分解蛋白質(zhì)，廣泛存在于動(dòng)物內(nèi)臟、植物莖葉、果實(shí)和微生物中。蛋白酶的提取主要來(lái)自植物，動(dòng)物和微生物中，但是在海洋和水產(chǎn)資源中提取的蛋白酶沒(méi)有得到廣泛應(yīng)用。如今，魚(yú)類(lèi)蛋白水解酶在食品加工的需求日益增大。內(nèi)臟作為漁業(yè)產(chǎn)業(yè)中主要的副產(chǎn)品之一，在提取和應(yīng)用消化酶方面具有廣泛的生物技術(shù)潛能，尤其是在寬范圍PH和溫度條件下具有高活性和在較低濃度下表現(xiàn)出高的催化活性的蛋白酶。魚(yú)類(lèi)蛋白酶的這些特征使它們?cè)谑称芳庸み^(guò)程中有廣泛的應(yīng)用前景。
[0004]明膠是動(dòng)物體內(nèi)的膠原蛋白經(jīng)過(guò)降解處理后獲得的分子量主要分布在2-20萬(wàn)道爾頓之間的動(dòng)物蛋白，它廣泛應(yīng)用于食品、化工、醫(yī)藥等行業(yè)。根據(jù)明膠用途的不同，對(duì)明膠分子量的要求也不同。如醫(yī)藥工業(yè)和組織工程上使用的明膠，要求分子量較大，而在保健食品和化妝品領(lǐng)域需求的是分子量較小的膠原蛋白肽。但明膠具有特殊的氨基酸結(jié)構(gòu)不易被蛋白酶分解，所以研宄開(kāi)發(fā)降解明膠能力強(qiáng)且價(jià)廉的蛋白酶，是目前生產(chǎn)膠原蛋白肽生產(chǎn)過(guò)程中亟待解決的技術(shù)難題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供金鯧魚(yú)內(nèi)臟蛋白酶的分離方法，解決了現(xiàn)有技術(shù)中降解明膠的蛋白酶降解能力低的技術(shù)問(wèn)題，初次從金鯧魚(yú)內(nèi)臟中提取到了高效降解明膠且價(jià)廉的蛋白酶。
[0006]本發(fā)明的第二目的是提供上述分離方法得到的蛋白酶。
[0007]本發(fā)明的第三目的是提供上述分離方法得到的蛋白酶的應(yīng)用。
[0008]本發(fā)明所采用的第一技術(shù)方案是，金鯧魚(yú)內(nèi)臟蛋白酶的分離方法，按以下步驟進(jìn)行:
[0009]步驟1:對(duì)新鮮金鯧魚(yú)的內(nèi)臟脫脂、浸提、離心后得到蛋白酶粗酶液；
[0010]步驟2:采用硫酸銨對(duì)蛋白酶粗酶液進(jìn)行粗分離得到復(fù)合蛋白酶液；
[0011]步驟3:采用SephadexG-1OO凝膠分離步驟2得到的復(fù)合蛋白酶液，得到三種不同的蛋白酶，根據(jù)出峰時(shí)間依次記為:蛋白酶組分1、蛋白酶組分2、蛋白酶組分3。
[0012]本發(fā)明所采用的第一技術(shù)方案的特點(diǎn)還在于，
[0013]步驟I的具體過(guò)程為:
[0014]將洗干凈的新鮮金鯧魚(yú)的內(nèi)臟切成段，按照固液體積比1:2-3的比例將內(nèi)臟放在4°C的丙酮中脫脂10-20min，去除脂肪，脫脂結(jié)束后用4°C的蒸餾水洗干凈內(nèi)臟上的丙酮；
[0015]然后將脫脂后的內(nèi)臟加入到3-5倍體積的4°C的pH = 7.5的Tris-HCl緩沖溶液中，用打漿機(jī)將其充分打碎后在4°C條件下浸提2-5小時(shí)；
[0016]最后在4°C，10000-20000rpm下離心15_30min，取上清液，上清液即為蛋白酶粗酶液。
[0017]步驟2的具體過(guò)程為:
[0018]2.1，首先將硫酸銨研磨成細(xì)粉末，分別加入到蛋白酶粗酶液中至以下質(zhì)量分?jǐn)?shù):25%,35%,45%,55%,65%,鹽析得到粗復(fù)合蛋白酶液；
[0019]2.2，然后以酪蛋白為標(biāo)準(zhǔn)底物，利用紫外分光光度法測(cè)定不同硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)下鹽析得到的粗復(fù)合蛋白酶液的酶活性，選取活性最高的粗復(fù)合蛋白酶液；
[0020]2.3，將步驟2.2得到的活性最高的粗復(fù)合蛋白酶液在4°C條件下靜置2-5小時(shí)，然后于4°C、10000-15000r/min下離心10_20min，丟棄上清液，沉淀用1/5-1/4蛋白酶粗酶液體積的PH7.5的Tris-Hcl緩沖溶液溶解，然后在4°C條件下，以蒸餾水為透析外液在磁力攪拌下透析24-48h，期間換蒸餾水多次，透析袋中的液體即為復(fù)合蛋白酶液。
[0021]步驟3的具體過(guò)程為:
[0022]將復(fù)合蛋白酶液用S^hadexG-1OO凝膠進(jìn)行分離，分別收集每個(gè)峰的洗脫組分，得到三種不同的蛋白酶，分別用透過(guò)分子量為8000道爾頓-14000道爾頓的透析袋，對(duì)三種不同的蛋白酶透析，得到最終的蛋白酶組分1、蛋白酶組分2、蛋白酶組分3 ;其中，SephadexG-1OO凝膠分離條件為:樣品濃度5_20mg/mL，上樣量為l_2mL，蒸餾水為洗脫液，洗脫流速為1.5-2.0mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為280nmo
[0023]本發(fā)明所采用的第二技術(shù)方案是，根據(jù)上述金鯧魚(yú)內(nèi)臟蛋白酶的分離方法制備的蛋白酶。
[0024]本發(fā)明所采用的第三技術(shù)方案是，根據(jù)上述金鯧魚(yú)內(nèi)臟蛋白酶的分離方法制備的蛋白酶在分解明膠上的應(yīng)用。
[0025]本發(fā)明的有益效果為，本發(fā)明方法充分利用金鯧魚(yú)加工過(guò)程中的生產(chǎn)殘?jiān)?，在金鯧魚(yú)內(nèi)臟中提取到了明膠降解能力強(qiáng)且專一的蛋白酶，為分解明膠的蛋白酶提取開(kāi)辟了新的途徑，提高了金鯧魚(yú)的利用率，實(shí)現(xiàn)了金鯧魚(yú)的高附加值利用。此外，本發(fā)明方法原料成本低，生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單。
【附圖說(shuō)明】
[0026]圖1是采用本發(fā)明的方法得到復(fù)合蛋白酶的最適pH測(cè)定實(shí)驗(yàn)結(jié)果曲線；
[0027]圖2是采用本發(fā)明的方法得到蛋白酶各組分與胃蛋白酶及去離子水對(duì)明膠的分解效果圖；其中，I為用蛋白酶組分3酶解明膠后的試樣；2為用蛋白酶組分2酶解明膠后的試樣；3為用蛋白酶組分I酶解明膠后的試樣；4為用胃蛋白酶處理的明膠試樣；5為沒(méi)有經(jīng)過(guò)酶解即添加去離子水的明膠試樣；
[0028]圖3是采用本發(fā)明的方法得到蛋白酶各組分與胃蛋白酶對(duì)牛血清蛋白的分解效果圖；其中I為沒(méi)有經(jīng)過(guò)酶解即添加去離子水的牛血清蛋白樣品；2為牛血清蛋白經(jīng)胃蛋白酶酶解后的試樣；3為用蛋白酶組分I酶解后的牛血清蛋白試樣；4為用蛋白酶組分2酶解后的牛血清蛋白試樣；5為用蛋白酶組分3酶解后的牛血清蛋白試樣；
[0029]圖4是采用S印hadexG-100凝膠色譜分離蛋白酶各組分的色譜圖；
[0030]圖5是本發(fā)明得到的蛋白酶各組分的酶活性比較圖。
【具體實(shí)施方式】
[0031]下面結(jié)合附圖和【具體實(shí)施方式】對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。
[0032]本發(fā)明的金鯧魚(yú)內(nèi)臟蛋白酶的分離方法，為了保證后續(xù)步驟中酶的活性不喪失，整個(gè)分離提取蛋白酶的過(guò)程在低溫下進(jìn)行:采用丙酮除脂、PH7.5的Tris-Hcl緩沖溶液勻楽法從金娼魚(yú)內(nèi)臟中提出粗蛋白酶，并依次通過(guò)硫酸錢(qián)沉淀、透析、SephadexG-1OO凝膠方法對(duì)粗蛋白酶進(jìn)行純化，得到高活性并且對(duì)明膠分解具有專一性強(qiáng)的蛋白酶；該方法按以下步驟進(jìn)行:
[0033]步驟1:原料處理
[0034]將新鮮金鯧魚(yú)的內(nèi)臟洗干凈并切成段，按照固液體積比1:2-3的比例將內(nèi)臟放在4°C的丙酮中脫脂10-20min，去除脂肪，脫脂結(jié)束后用4°C的蒸餾水洗干凈內(nèi)臟上的丙酮；
[0035]然后將脫脂后的內(nèi)臟加入到3-5倍體積的4°C的pH = 7.5的Tris-HCl緩沖溶液中，用打漿機(jī)將其充分打碎后在4°C條件下浸提2-5小時(shí)；
[0036]最后在4°C，10000-20000rpm下離心15_30min，取上清液，上清液即為蛋白酶粗酶液。
[0037]步驟2:采用硫酸銨對(duì)蛋白酶粗酶液進(jìn)行粗分離得到復(fù)合蛋白酶液，具體過(guò)程如下:
[0038]2.1，首先將硫酸銨研磨成細(xì)粉末，分別加入到蛋白酶粗酶液中至以下質(zhì)量分?jǐn)?shù):25%,35%,45%,55%,65%,鹽析得到粗復(fù)合蛋白酶液；
[0039]2.2，然后以酪蛋白為標(biāo)準(zhǔn)底物，利用紫外分光光度法測(cè)定不同硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)下鹽析得到的粗復(fù)合蛋白酶液的酶的活性，選取活性最高的粗復(fù)合蛋白酶液；
[0040]測(cè)試結(jié)果表明，當(dāng)硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)為55%時(shí)，鹽析得到的粗復(fù)合蛋白