一種重組糖苷水解酶用于生物轉(zhuǎn)化制備人參二醇型皂苷的工藝的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域中一種制備人參皂苷的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 人參二醇型皂苷Gyp XVII、compound 0、Mb和F2,被報道具有良好的藥理學(xué)活性， 例如抗腫瘤活性、抗炎活性等，具有一定的應(yīng)用潛力。但是這些人參皂苷在天然人參中含量 甚微甚至根本不存在，從天然人參中進行提取分離十分困難，這極大地限制了它們的應(yīng)用。
[0003] 在人參總皂苷中，二醇型人參皂苷Rbl、Rb2、Rc和Rd的含量，超過人參總皂苷含量 的60%以上。對比人參皂苷Rbl與Gyp XVII、Rb2與compound 0、Rc與Mb、Rd與F2的結(jié) 構(gòu)可知，它們的皂苷元結(jié)構(gòu)相同，只是連接在C-3位置上的糖基數(shù)目有所不同。因此，可以 通過水解人參二醇型皂苷Rbl、Rb2、Rc和Rd的C-3位的外側(cè)葡萄糖基，來分別得到人參皂 苷 Gyp XVII、compound 0、Mb 和 F2。
[0004] 以往有研宄者通過部分酸水解人參總皂苷來制備一些糖基數(shù)目較少的人參皂苷。 但酸水解的穩(wěn)定性差，不同批次之間質(zhì)量不穩(wěn)定。此外，酸水解的專一性差，容易產(chǎn)生副產(chǎn) 物，造成了目標產(chǎn)物的產(chǎn)率偏低，且后續(xù)的產(chǎn)品分離純化比較困難。也有研宄者利用細菌、 真菌等微生物分泌的糖苷水解酶來生物轉(zhuǎn)化人參總皂苷、人參二醇型皂苷混合物或某種人 參二醇型皂苷單體，制備Gyp XVII、compound 0、Mb和F2,或其中的一種或幾種。生物轉(zhuǎn)化 與酸水解相比，具有條件溫和、專一性好等優(yōu)越性。但是由于細菌或真菌分泌的糖苷水解酶 數(shù)量較少，而且微生物容易變異、退化，造成了這一生物轉(zhuǎn)化過程的效率很低，這一生產(chǎn)過 程不適合放大，給生產(chǎn)過程增添了不穩(wěn)定性，不適用于工業(yè)規(guī)模的應(yīng)用?，F(xiàn)在急需通過基因 工程的手段，直接克隆和表達所需要的酶的基因，實現(xiàn)人參皂苷Gyp XVII、compound 0、Mb 和F2的穩(wěn)定制備。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種制備人參皂苷Gyp XVII、compound 0、Mb和F2的方法。
[0006] 本發(fā)明提供的制備人參皂苷Gyp XVII、compound 0、Mb和F2的方法，包括以人 參二醇型皂苷為底物用蛋白質(zhì)進行催化反應(yīng)得到含有人參皂苷Gyp XVII、compound 0、Mb 和F2反應(yīng)物的步驟，所述蛋白質(zhì)的名稱為CcBgllA，來源于纖維菌（Cellulosimicrobium sp. )21，是如下a)或b)或c)或d)的蛋白質(zhì)：
[0007] a)氨基酸序列是SEQIDNo. 2的蛋白質(zhì)；
[0008] b)氨基酸序列是SEQIDNo. 4的蛋白質(zhì)；
[0009] c)將SEQIDNo. 2所示的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺 失和/或添加得到的具有人參皂苷水解酶活性的蛋白質(zhì)；
[0010] d)將SEQ ID No. 4所示的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺 失和/或添加得到的具有人參皂苷水解酶活性的蛋白質(zhì)。
[0011] 其中，SEQ ID No. 2由390個氨基酸殘基組成，是天然人參皂苷水解酶CcBgl 1A (名 稱為N CcBgllA)的氨基酸序列；SEQ ID No. 4由410個氨基酸殘基組成，是重組人參皂苷 水解酶CcBgllA(名稱為R CcBgllA)的氨基酸序列；SEQ ID No. 4是在SEQ ID No. 2的氨 基末端添加氨基酸序列：MGSSHHHHHHSSGLVPRGSH得到的氨基酸序列。
[0012] 上述c)中的蛋白質(zhì)可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進行生物表達得到。
[0013] 上述c)中的蛋白質(zhì)的編碼基因可通過將SEQ ID No. 1所示的DNA序列中缺失一 個或幾個氨基酸殘基的密碼子，和/或進行一個或幾個堿基對的錯義突變得到。上述d)中 的蛋白質(zhì)可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進行生物表達得到。上述d)中的蛋白質(zhì) 的編碼基因可通過將SEQ ID No. 3所示的DNA序列中缺失一個或幾個氨基酸殘基的密碼 子，和/或進行一個或幾個堿基對的錯義突變，和/或在其5'端和/或3'端連上SEQ ID No. 3所不的His-Tag的編碼序列得到。
[0014] 上述方法中，所述方法包括從所述反應(yīng)物中純化得到人參皂苷Gyp XVII、 compound 0、Mb 和 F2 的步驟。
[0015] 上述方法中，所述以人參二醇型皂苷為底物用CcBgllA進行催化反應(yīng)在液體中進 行，所述液體中CcBgllA和所述人參二醇型皂苷的配比為1IU CcBgllA :0. 5-2mg所述人參 二醇型皂苷（如〇? 8IU CcBgl 1A : lmg所述人參二醇型皂苷），所述IU為CcBgl 1A的0 -葡 萄糖苷酶酶活。
[0016] 上述方法中，所述催化反應(yīng)進行1-3小時，所述1-3小時可為1-2小時或1. 5-2小 時或2-3小時或2-2. 5小時或2小時。
[0017] 上述方法中，所述催化反應(yīng)在25-35 °C，所述25-35 °C可為25-30 °C或30-35 °C。
[0018] 上述方法中，所述純化包括以下步驟：將所述反應(yīng)物進行離心，使人參皂苷進入上 清液中，收集上清液，得到含有人參皂苷Gyp XVIIcompound 0、Mb和F2的上清液，將所述 上清液干燥，得到含有人參皂苷Gyp XVIIcompound 0、Mb和F2的干燥粉，除去所述干燥粉 中的雜質(zhì)，得到人參皂苷Gyp XVII、compound 0、Mb和F2。
[0019] 上述方法中，除去所述干燥粉中的雜質(zhì)包括以下步驟：將所述干燥粉溶于溶液A 中，得到含有人參皂苷Gyp XVIIcompound 0、Mb和F2的液體混合物，將所述液體混合物進 行硅膠柱層析，用所述溶液A洗脫，分別收集含有人參皂苷Gyp XVII、c〇mp〇und 0、Mb和F2 的級分，將所述級分干燥，得到人參皂苷Gyp XVII、compound 0、Mb和F2。
[0020] 上述方法中，所述離心在常溫、6000rpm條件下進行10min ;所述溶液A由氯仿、甲 醇、水組成，所述溶液A中氯仿、甲醇、水的體積比為65:35:10 (下層溶液）。
[0021] CcBgllA在制備人參皂苷Gyp XVII、compound 0、Mb和F2中的應(yīng)用也在本發(fā)明的 保護范圍，如CcBgllA生物轉(zhuǎn)化人參二醇型皂苷和/或Rbl和/或Rb2和/或Rc和/或Rd 制備人參皂苷Gyp XVII、compound 0、Mb和F2,或其中的一種或幾種。
[0022] 與CcBgllA相關(guān)的生物材料在制備人參皂苷Gyp XVII、compound 0、Mb和F2中的 應(yīng)用也在本發(fā)明的保護范圍，如所述生物材料生物轉(zhuǎn)化人參二醇型皂苷和/或Rbl和/或 Rb2和/或Rc和/或Rd制備人參皂苷Gyp XVII、compound 0、Mb和F2,或其中的一種或幾 種。所述生物材料為下述B1)至B16)中的任一種：
[0023] B1)編碼CcBgllA的核酸分子；
[0024] B2)含有B1)所述核酸分子的表達盒；
[0025] B3)含有B1)所述核酸分子的重組載體；
[0026] B4)含有B2)所述表達盒的重組載體；
[0027] B5)含有B1)所述核酸分子的重組微生物；
[0028] B6)含有B2)所述表達盒的重組微生物；
[0029] B7)含有B3)所述重組載體的重組微生物；
[0030] B8)含有B4)所述重組載體的重組微生物；
[0031] B9)含有B1)所述核酸分子的轉(zhuǎn)基因動物細胞系；
[0032] B10)含有B2)所述表達盒的轉(zhuǎn)基因動物細胞系；
[0033] B11)含有B3)所述重組載體的轉(zhuǎn)基因動物細胞系；
[0034] B12)含有B4)所述重組載體的轉(zhuǎn)基因動物細胞系；
[0035] B13)含有B1)所述核酸分子的轉(zhuǎn)基因植物細胞系；
[0036] B14)含有B2)所述表達盒的轉(zhuǎn)基因植物細胞系；
[0037] B15)含有B3)所述重組載體的轉(zhuǎn)基因植物細胞系；
[0038] B16)含有B4)所述重組載體的轉(zhuǎn)基因植物細胞系。
[0039] 其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因組DNA或重組DNA;所述核酸分子也 可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。
[0040] 上述生物材料中，B1)所述核酸分子具體可為如下1)或2)或3)或4)或5)所示 的核酸分子：
[0041] 1)編碼序列是序列表中SEQ ID No. 1的第1-1173位核苷酸的DNA分子或cDNA分 子；
[0042] 2)編碼序列是序列表中SEQ ID No. 3的第1-1233位核苷酸的DNA分子或cDNA分 子；
[0043] 3)與1)或2)限定的核苷酸序列具有75%或75%以上同一性，且編碼CcBgllA的 cDNA分子或基因組DNA分子；
[0044] 4)在嚴格條件下與1)或2)或3)限定的核苷酸序列雜交，且編碼CcBgllA的cDNA 分子或基因組DNA分子。
[0045] 其中，SEQ ID No. 1由1173個核苷酸組成，SEQ ID No. 1的第1-1173位核苷酸編 碼3￡〇10 1')〇.2所不的氨基酸序列。纖維菌（〇611111〇8；[111；[(31'013；[111118。.21)中的（^1^11八 基因的基因組基因編碼SEQ ID No. 2的蛋白質(zhì)。SEQ ID No. 3由1233個核苷酸組成，編碼 5￡010此.4所示的氨基酸序列，56010此.3的第1-60位核苷酸為？￡1'-28 &(+)載體上的 序列，SEQ ID No. 3的第13-30位核苷酸編碼His-Tag，SEQ ID No. 3的