一種無信號肽胞外生產(chǎn)淀粉分支酶的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種無信號肽胞外生產(chǎn)淀粉分支酶的方法，屬于基因工程和酶工程領(lǐng)域。本發(fā)明將來源于熱葡糖苷酶地芽孢桿菌(Geobacillus thermoglueosidan)的不含自身信號肽序列的淀粉分支酶基因表達于大腸桿菌中，并采用一些培養(yǎng)策略，實現(xiàn)了淀粉分支酶的無信號肽胞外生產(chǎn)。相比于淀粉分支酶的胞內(nèi)生產(chǎn)，產(chǎn)量明顯提高，并簡化了分離純化步驟，重組淀粉分支酶在E.coli中的胞外表達有利于其工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)。
【專利說明】
一種無信號肽胞外生產(chǎn)淀粉分支酶的方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及一種無信號肽胞外生產(chǎn)淀粉分支酶的方法，屬于基因工程和酶工程領(lǐng) 域。
【背景技術(shù)】
[0002] 淀粉分支酶（1，4-a-glucan branching enzyme;GBE;EC 2·4· 1 · 18)是一種屬于糖 苷水解酶家族13的糖基轉(zhuǎn)移酶，是合成糖原及支鏈淀粉的關(guān)鍵酶。它首先將底物分子上某 一 α_1，4糖苷鍵水解，切下一個直鏈葡聚糖片段，繼而通過轉(zhuǎn)糖基作用將該片段轉(zhuǎn)移至余下 底物分子上某一葡萄糖殘基的第6位碳原子上，形成α_1，6糖苷鍵。由于經(jīng)淀粉分支酶改性 的淀粉即高支化淀粉具有特殊理化特性、生理功能及更高的安全性，因此在食品、醫(yī)藥等工 業(yè)中具有廣闊的應(yīng)用前景。
[0003] 大腸桿菌表達系統(tǒng)與其它表達系統(tǒng)相比，具有較清楚的遺傳性狀、操作簡便、生長 快、表達量大、培養(yǎng)成本低，適于大規(guī)模發(fā)酵培養(yǎng)的特點，是現(xiàn)階段最常用的表達系統(tǒng)。目前 已有大量有關(guān)重組蛋白在該系統(tǒng)高效表達的研究，但是異源蛋白表達的同時，容易出現(xiàn)被 宿主蛋白酶降解或者形成包涵體、表達效率難以較大程度的提高、活性不夠等問題，而分泌 到細胞周質(zhì)或培養(yǎng)基中要比定位于細胞質(zhì)有多個優(yōu)點，包括簡化蛋白下游加工、促進蛋白 折疊與穩(wěn)定、提高蛋白可溶性與生物學(xué)活性等。微生物來源的淀粉分支酶是胞內(nèi)酶，本身不 含信號肽，因此，目前淀粉分支酶的異源表達主要是在大腸桿菌中的胞內(nèi)表達，鮮有報道淀 粉分支酶融合了分泌信號肽后的胞外表達，更沒有關(guān)于無信號肽的淀粉分支酶胞外表達的 報道。
[0004] 異源表達淀粉分支酶突出的問題是，蛋白表達量低、淀粉分支酶酶活低。因此，構(gòu) 建重組大腸桿菌進行胞外分泌淀粉分支酶，對于滿足淀粉分支酶工業(yè)化成產(chǎn)需求和降低生 產(chǎn)成本有重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明要解決的第一個技術(shù)問題是提供一種產(chǎn)淀粉分支酶的重組大腸桿菌。
[0006] 所述重組大腸桿菌是將淀粉分支酶基因插入去除了 pelB信號肽的質(zhì)粒pET-20b ( + )，將重組質(zhì)粒在大腸桿菌中進行表達得到的重組大腸桿菌。
[0007] 在本發(fā)明的一種實施方式中，編碼所述淀粉分支酶的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0008] 在本發(fā)明的一種實施方式中，所述大腸桿菌是E.coli BL21(DE3)。
[0009] 編碼所述淀粉分支酶的基因來源于Geobacillus thermoglueosidan STB02。
[0010] 本發(fā)明要解決的第二個技術(shù)問題是提供一種獲得所述重組大腸桿菌的方法，是將 淀粉分支酶基因插入質(zhì)粒PET-20M + )的T7啟動子序列下游，構(gòu)建了不含pelB信號肽表達載 體pET-20b( + )/gbe，并將其轉(zhuǎn)化至宿主E.coli BL21(DE3)中進行表達。
[0011] 在本發(fā)明的一種實施方式中，所述方法包括以下步驟：
[0012] (1)獲取不含信號肽的序列如SEQ ID NO.1所示的基因片段，將目的基因連接至 pMD18_T simple vector，獲得質(zhì)粒pMD18_T simple/gbe;
[0013] (2)將質(zhì)粒pMD18-T simple/gbe和pET-20b( + )進行雙酶切，用連接酶連接得到重 組質(zhì)粒 pET_20b( + )/gbe;
[0014] (3)將步驟(2)得到的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到宿主E. coli BL21 (DE3)，即得到重組大腸桿 菌。
[0015] 本發(fā)明還提供一種應(yīng)用所述重組大腸桿菌發(fā)酵產(chǎn)淀粉分支酶的方法，是將重組大 腸桿菌以TB培養(yǎng)基為發(fā)酵培養(yǎng)基，在30-37 °C、180-200r/min培養(yǎng)，當0D6QQ達到0.5-0.6時， 添加0-0.4mM的IPTG后，在25-37 °C、180-200r/min條件下發(fā)酵產(chǎn)酶。
[0016] 在本發(fā)明的一種實施方式中，以LB培養(yǎng)基活化重組大腸桿菌得到種子液。
[0017]在本發(fā)明的一種實施方式中，將重組大腸桿菌以TB培養(yǎng)基為發(fā)酵培養(yǎng)基，在35-37 °C、180-200r/min培養(yǎng)，當0D6QQ達到0 · 5-0 · 6時，添加0-0 · OlmM的IPTG后，在25-37°C、180-200r/min條件下發(fā)酵產(chǎn)酶。
[0018] 在本發(fā)明的一種實施方式中，將重組大腸桿菌種子液以2%的接種量接種到TB培 養(yǎng)基，在37 °C、200r/min條件下培養(yǎng)，當0D6QQ達到0 · 6時，添加 0 · 0ImM的IPTG，在30 °C、200r/ min條件下發(fā)酵產(chǎn)酶。
[0019] 本發(fā)明的有益效果：
[0020] 本發(fā)明通過構(gòu)建不含有信號肽的重組大腸桿菌，實現(xiàn)了淀粉分支酶的高效胞外分 泌表達，生產(chǎn)強度顯著提高，例如不需要添加誘導(dǎo)劑，不需要超聲破碎，胞外淀粉分支酶表 達量是胞內(nèi)的1.75倍，胞外酶活可達175U/mL，胞外酶活占總酶活的比例達到74.7%。
【附圖說明】
[0021] 圖1:克隆表達載體構(gòu)建圖
[0022] 圖2:發(fā)酵培養(yǎng)基對重組淀粉分支酶胞外生產(chǎn)的影響
[0023] 圖3:誘導(dǎo)劑濃度對重組淀粉分支酶胞外生產(chǎn)的影響
[0024] 圖4:誘導(dǎo)溫度對重組淀粉分支酶胞外生產(chǎn)的影響
【具體實施方式】
[0025]實施例1重組大腸桿菌的構(gòu)建
[0026]熱葡糖苷酶地芽孢桿菌淀粉分支酶基因 （Gene Bank)全長1938bp。按照如圖1所示 的構(gòu)建方法，首先獲取不含信號肽的序列是SEQ ID NO. 1所示序列的基因片段，將目的基因 連接至pffl)18-T simple vector，獲得質(zhì)粒pMD18_T simple/gbe。將質(zhì)粒pMD18_T simple/ gbe和pET-20b( + )進行雙酶切，用連接酶連接得到重組質(zhì)粒pET-20b( + )/gbe。將重組質(zhì)粒 pET-20b( + )/gbe通過熱激法轉(zhuǎn)化BL21(DE3)感受態(tài)細胞。轉(zhuǎn)化液涂布含氨芐青霉素 （100yg/ mL)LB平板，提取質(zhì)粒測序驗證構(gòu)建的重組質(zhì)粒。測序工作由上海生工完成。
[0027]實施例2重組大腸桿菌搖瓶培養(yǎng)
[0028] 挑取含有重組質(zhì)粒的E.coli BL21(DE3)的單克隆于含100yg/mL氨芐青霉素的LB 培養(yǎng)基中，在37°C、200r/min下培養(yǎng)8~12h，以體積比2%的接種量接種到含100yg/mL氨芐 青霉素的TB培養(yǎng)基中，在30°C、200r/min下發(fā)酵48h;將發(fā)酵液于4°C、10000rpm離心15min以 除去菌體，收集上清液。
[0029]實施例3酶活測定分析
[0030] 用0 · 9mL的50mmo 1/L磷酸緩沖液(pH 7 · 5)配制0 · 25 % (w/v)馬鈴薯支鏈淀粉標準 溶液，加入〇. lmL酶液，在50°C下反應(yīng)15min。反應(yīng)結(jié)束后沸水浴滅酶lOmin，并以10000r/min 離心2min待顯色用。顯色體系為0.3mL反應(yīng)上清液與5. OmL顯色液(0.05% (w/v)KI，0.005% (w/v)l2，pH 7.5)于7mL離心管中混合，顯色15min后在530nm處測定吸光值。酶活定義：在 530nm處，吸光值每分鐘降低1 %所需的酶量為一個酶活單位。
[0031]實施例4發(fā)酵培養(yǎng)基的選擇
[0032] 挑取含有重組質(zhì)粒的E.coli BL21(DE3)的單克隆于含100yg/mL氨芐青霉素的LB 培養(yǎng)基中，在37°C、200r/min下培養(yǎng)8~12h，以體積比2%的接種量接種到含100yg/mL氨芐 青霉素的4種典型的大腸桿菌培養(yǎng)基SOB、S0C、LB、TB培養(yǎng)基中，開始培養(yǎng)溫度為37 °C、搖床 轉(zhuǎn)速為200r/min，當菌體濃度培養(yǎng)至0D600至0.6時，加入0.0 lmM的IPTG后迅速轉(zhuǎn)至在30 °C、 200r/min下繼續(xù)誘導(dǎo)48h，將發(fā)酵液于4°C、lOOOOrpm離心15min以除去菌體，收集上清液測 定淀粉分支酶酶活，結(jié)果見圖2。在這些培養(yǎng)基中，TB培養(yǎng)基最有利于重組淀粉分支酶的胞 外生產(chǎn)。E. co 1 i在TB培養(yǎng)基中發(fā)酵48h，胞外酶活達到120. lU/mL，是在LB培養(yǎng)基中的大約15 倍。分析其原因可能是，TB培養(yǎng)基有相對高的pH緩沖能力，有利于菌體的生長和重組酶的穩(wěn) 定;TB培養(yǎng)基中酵母粉含量更高，營養(yǎng)成分更加豐富，適合菌體生長。
[0033] LB 培養(yǎng)基:酵母粉 5g/L，胰蛋白胨 10g/L，NaCl 10g/L，pH7.0
[0034] SOB培養(yǎng)基：酵母粉5g/L，胰蛋白胨20g/L，NaCl 0.5g/L，KCl 2.5mM，MgCl210mM， ρΗ7·0
[0035] S0C培養(yǎng)基:酵母粉5g/L，胰蛋白胨20g/L，NaCl 0.5g/L，KCl 2.5mM，MgCl210mM，葡 萄糖 20mM，pH7.0
[0036] TB培養(yǎng)基：酵母粉24g/L，胰蛋白胨12g/L，甘油5g/L，KH2P〇4l7mM，K2HP〇472mM， ρΗ7·0
[0037] 實施例5誘導(dǎo)劑濃度對重組淀粉分支酶胞外生產(chǎn)的影響
[0038] 挑取含有重組質(zhì)粒的E.coli BL21(DE3)的單克隆于含100yg/mL氨芐青霉素的LB 培養(yǎng)基中，在37°C、200r/min下培養(yǎng)8~12h，以體積比2%的接種量接種到含100yg/mL氨芐 青霉素的TB培養(yǎng)基中，開始培養(yǎng)溫度為37°C、搖床轉(zhuǎn)速為200r/min，當菌體濃度培養(yǎng)至 0D600至0.6時，加入0-0.4mM的IPTG后迅速轉(zhuǎn)至在30°C、200r/min下繼續(xù)誘導(dǎo)48h，將發(fā)酵液 于4°C、1 OOOOrpm離心15min以除去菌體，收集上清液測定淀粉分支酶酶活，結(jié)果見圖3。較低 的IPTG濃度有利于重組酶的胞外生產(chǎn)，以IPTG濃度為0.0 lmM為最佳，培養(yǎng)基中淀粉分支酶 的酶活達到133.8U/mL。
[0039] 實施例6誘導(dǎo)溫度對重組淀粉分支酶胞外生產(chǎn)的影響
[0040] 挑取含有重組質(zhì)粒的E.coli BL21(DE3)的單克隆于含100yg/mL氨芐青霉素的LB 培養(yǎng)基中，在37°C、200r/min下培養(yǎng)8~12h，以體積比2%的接種量接種到含100yg/mL氨芐 青霉素的TB培養(yǎng)基中，開始培養(yǎng)溫度為37°C、搖床轉(zhuǎn)速為200r/min，當菌體濃度培養(yǎng)至 0D600至0 · 6時，加入0 · 0ImM的IPTG后迅速轉(zhuǎn)至在25 °C、30 °C、37 °C、200r/min下繼續(xù)誘導(dǎo)74h 取樣測淀粉分支酶酶活，結(jié)果見圖4。當誘導(dǎo)溫度為30°C最有利于重組淀粉分支酶的胞外生 產(chǎn)，培養(yǎng)基中淀粉分支酶的酶活達到175U/mL。
[0041]雖然本發(fā)明已以較佳實施例公開如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技 術(shù)的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可做各種的改動與修飾，因此本發(fā)明的保護范 圍應(yīng)該以權(quán)利要求書所界定的為準。
【主權(quán)項】
1. 一種產(chǎn)淀粉分支酶的重組大腸桿菌，其特征在于，將在核苷酸序列是SEQ ID NO. 1所 示序列的淀粉分支酶基因插入去除了PelB信號肽的質(zhì)粒pET-20b( + )中，將重組質(zhì)粒在宿主 菌E.coli BL21(DE3)中進行表達得到的重組大腸桿菌。2. 編碼權(quán)利要求1所述重組大腸桿菌的核苷酸序列。3. 含有權(quán)利要求3所述核苷酸序列的載體或細胞。4. 一種獲得權(quán)利要求1所述重組大腸桿菌的方法，其特征在于，所述方法具體是:將SEQ ID N0.1所示序列的淀粉分支酶基因插入質(zhì)粒pET-20b( + )的T7啟動子序列下游，構(gòu)建了不 含PelB信號肽表達載體pET-20b( + )/gbe，并將其轉(zhuǎn)化至宿主E.coli BL21(DE3)中進行表 達。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述方法具體是：（1)獲取不含信號肽的序 列是SEQ ID N0.1所示序列的基因片段，將目的基因連接至pMD18-simple vector，獲得質(zhì) 粒pMD18_T simple/gbe; (2)將質(zhì)粒pMD18_T simple/gbe和pET_20b( + )進行雙酶切，用連接 酶連接得到重組質(zhì)粒pET-20b( + )/gbe;(3)將步驟2得到的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到宿主E.coli BL21(DE3)，即得到重組大腸桿菌。6. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，挑取含有重組質(zhì)粒的E.coli BL21 (DE3)的 單克隆于含lOOyg/mL氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，在37°C、200r/min下培養(yǎng)8~12h，以體積比 2%的接種量接種到含lOOyg/mL氨芐青霉素的TB培養(yǎng)基中，開始培養(yǎng)溫度為37°C、搖床轉(zhuǎn)速 為200r/min，當菌體濃度培養(yǎng)至0D600至O . 6時，加入O . OImM的IPTG后迅速轉(zhuǎn)至在30 °C、 200r/min下繼續(xù)誘導(dǎo)48h;將發(fā)酵液于4°C、1000 Orpm離心15min以除去菌體，收集上清液。7. 根據(jù)權(quán)利要求1-6任一所述方法得到的淀粉分支酶。8. 權(quán)利要求2所述的重組大腸桿菌在淀粉分支酶胞外生產(chǎn)方面的應(yīng)用。
【文檔編號】C12R1/19GK105950579SQ201610345583
【公開日】2016年9月21日
【申請日】2016年5月23日
【發(fā)明人】李兆豐, 顧正彪, 劉藝婷, 李才明, 程力, 洪雁
【申請人】江南大學(xué)