糖基化改造提高脂肪酶表達(dá)的方法、突變酶及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及糖基化改造提高脂肪酶表達(dá)的方法、突變酶及其應(yīng)用，屬于酶工程領(lǐng) 域。
【背景技術(shù)】
[0002] 米根霉脂肪酶具有良好的1，3-位置特異性，優(yōu)先催化中長鏈脂肪酸，在食品、化 工及生物能源等方面都有很重要的應(yīng)用。利用酶的水解、合成及轉(zhuǎn)酯等活性，米根霉脂肪酶 有不同的應(yīng)用。
[0003] 目前，米根霉脂肪酶的全基因序列已經(jīng)在NCBI上公布。該酶包括26個(gè)氨基酸信 號序列（presequsece)、97個(gè)氨基酸前導(dǎo)肽序列（prosequsence)和269個(gè)氨基酸成熟肽序 列（mROL)所組成。已有研宄表明前導(dǎo)肽對米根霉脂肪酶的分泌和折疊起著十分重要的作 用：酶的分泌必需有前序列的20號到37號殘基，而經(jīng)折疊形成活性脂肪酶必需有38號到 57號殘基。米根霉脂肪酶在大腸桿菌中有很好的表達(dá)，但這些脂肪酶只能以無活性的形式 表達(dá)。
[0004] P. pastoris是應(yīng)用廣泛、最高效的外源蛋白表達(dá)工具之一，基因的特性、內(nèi)質(zhì)網(wǎng) 中的蛋白質(zhì)折疊、蛋白從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到高爾基體的轉(zhuǎn)運(yùn)以及蛋白的翻譯等許多因素都能影響 P. pastoris表達(dá)蛋白的水平。P. pastoris表達(dá)蛋白產(chǎn)生N-糖基化是一種常見情況，糖基 化能夠穩(wěn)定蛋白質(zhì)的成熟構(gòu)象，影響蛋白的活性及熱穩(wěn)定性，以及對蛋白質(zhì)的正確折疊、運(yùn) 輸、定位也起著重要作用。其中N-糖基化在許多蛋白質(zhì)研宄報(bào)道中都有著至關(guān)重要的作 用，對蛋白的分泌等作用是必需的，人們對其研宄也相對深入。通常，蛋白質(zhì)的功能發(fā)生改 變往往是由于蛋白的結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化，而蛋白質(zhì)上增加一個(gè)大的糖鏈能極大的改變蛋白質(zhì) 的結(jié)構(gòu)。
[0005] 據(jù)研宄報(bào)道N-糖基化對P. pastoris表達(dá)蛋白的分泌水平與活性等具有重要影 響。Kohno等構(gòu)建表達(dá)Kex2位點(diǎn)突變脂肪酶的P.pastoris基因工程菌，發(fā)現(xiàn)前導(dǎo)肽未被 處理的RNL的熱穩(wěn)定性更高，且結(jié)合到脂肪酶上的糖鏈長度大小對RNL的熱穩(wěn)定性無影響。 Ito等研宄卵清蛋白的N-糖基化對蛋白分泌量的影響，證明292位N-糖基化對該蛋白的分 泌折疊是必須的。Boivin等研宄N-糖基化對P.pastoris表達(dá)的溶栓劑DSPA a 1分泌水平 和活性的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該蛋白的兩個(gè)位點(diǎn)的N-糖鏈（N117和N362)對蛋白的分泌和酶活 性具有重要作用。此外，根毛霉脂肪酶的N-糖基化研宄也證明其對酶的分泌有關(guān)鍵作用， 但N-糖基化對其酶活的獲得卻有消極作用。
[0006] 本發(fā)明通過對米根霉脂肪酶的前導(dǎo)肽進(jìn)行N-糖基化突變，獲得了酶活和表達(dá)量 提高的脂肪酶突變體。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 為了克服現(xiàn)有米根霉脂肪酶表達(dá)量和酶活較低的缺陷，本發(fā)明提供一種基于 N-糖基化改造提高脂肪酶表達(dá)的方法，以及表達(dá)提高的脂肪酶及其應(yīng)用。
[0008] 本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種表達(dá)提高脂肪酶突變體。
[0009] 所述突變體，是在米根霉脂肪酶的基礎(chǔ)上，將其前導(dǎo)肽的SAS和/或NT氨基酸位 點(diǎn)突變?yōu)镹-糖基化位點(diǎn)。
[0010] 所述突變體，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，是將前導(dǎo)肽序列中的SAS氨基酸位點(diǎn) 突變成N-糖基化位點(diǎn)NGT，命名為proROLA，突變體的氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0011] 所述突變體，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，是將前導(dǎo)肽序列中的NT氨基酸位點(diǎn)突 變成N-糖基化位點(diǎn)NLT，命名為proROLB，突變體的氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
[0012] 所述突變體，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，是將前導(dǎo)肽序列中的SAS、NT氨基酸位 點(diǎn)分別突變成N-糖基化位點(diǎn)NGT、NLT，命名為proROLAB，突變體的氨基酸序列如SEQ ID NO. 3所示。
[0013] 所述突變體，還可以是在嚴(yán)格條件下（Tm - 10~15°C )與SEQ ID NO. 1、SEQ ID NO. 2或SEQ ID NO. 3所示氨基酸序列雜交且編碼具有脂肪酶活性的蛋白質(zhì)分子。
[0014] 所述米根霉脂肪酶，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，發(fā)生N-糖基化突變前的氨基酸 序列如SEQ ID NO. 4所示，由于不同米根霉菌株來源的脂肪酶氨基酸序列僅有個(gè)別氨基酸 的差異，因此，該方法不僅適用于SEQ ID NO. 4序列，而且對氨基酸序列相似性達(dá)到80%以 上的脂肪酶序列均適用于本專利。
[0015] 所述米根霉脂肪酶，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，發(fā)生N-糖基化突變前的核苷酸 序列如SEQ ID NO. 9所示。
[0016] 本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供含有所述脂肪酶突變體的表達(dá)載體。
[0017] 所述表達(dá)載體為分泌型載體。
[0018] 所述表達(dá)載體，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，可以是以下任意一種：pGAPZa、 pPIC9、pPIC3K、pPIC9K、PA0815 或pPICZa。
[0019] 本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供含有所述脂肪酶突變體的基因工程菌。
[0020] 所述基因工程菌，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，是以畢赤酵母為宿主構(gòu)建的。
[0021] 所述基因工程菌，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，其構(gòu)建方法是：將編碼所述脂肪 酶突變體的核苷酸序列克隆到表達(dá)質(zhì)粒pGAPZa上，然后線性化質(zhì)粒，并電轉(zhuǎn)入畢赤酵母 GS115的感受態(tài)細(xì)胞中。
[0022] 本發(fā)明的第四個(gè)目的是一種提高米曲霉脂肪酶表達(dá)的方法，是將米曲霉脂肪酶的 前導(dǎo)肽的SAS和/或NT氨基酸位點(diǎn)進(jìn)行N-糖基化突變。
[0023] 所述方法，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，突變后的脂肪酶的氨基酸序列如SEQ ID NO. 1、SEQ ID NO. 2 或 SEQ ID NO. 3 所示。
[0024] 所述方法，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，是將突變后的脂肪酶以pGAPZa為載體， 在畢赤酵母中進(jìn)行表達(dá)。
[0025] 本發(fā)明還要求保護(hù)所述脂肪酶突變體在食品、化工或生物能源等領(lǐng)域的應(yīng)用，以 及所述基因工程菌在酶制劑生產(chǎn)中的應(yīng)用。
[0026] 本發(fā)明的有益效果：
[0027] 本發(fā)明的經(jīng)過N-糖基化突變的米曲霉脂肪酶，在工程菌中進(jìn)步表達(dá)時(shí)，不僅不會 影響菌株的生長，而且具有顯著提高的酶活和分泌量。搖瓶培養(yǎng)96h后，pr 〇R0LA、pr〇R0LB、 proROLAB的胞外蛋白濃度分別比未進(jìn)行糖基化的proROL提高了 211%、188%、233%;突 變體proROLA、proROLB以及proROLAB的搖瓶發(fā)酵酶活分別達(dá)到150U ? mL'175U ? ml/1和 200U ? mL' 30L發(fā)酵罐發(fā)酵酶活分別達(dá)到8210U ? mL'SASTU ? ml/1和9366U ? mL '而未突 變的proROL的胞外酶活幾乎為零。
【附圖說明】
[0028] 圖1:如導(dǎo)狀突變不意圖；
[0029] 圖2:表達(dá)突變前后脂肪酶的基因工程菌的生長曲線；
[0030] 圖3 :基因工程菌株的蛋白分泌情況；
[0031] 圖4 :不同時(shí)間下基因工程菌表達(dá)脂肪酶的SDS-PAGE ;其中，M為蛋白marker，泳 道1-5分別代表培養(yǎng)24h、48h、72h、84h和96h;
[0032] 圖5 :不同發(fā)酵時(shí)間下的突變體酶活。
【具體實(shí)施方式】
[0033] 實(shí)施例1 :引入N-糖基化的突變酶及基因工程的構(gòu)建
[0034] 本發(fā)明在米根霉脂肪酶R0L的前導(dǎo)肽中設(shè)計(jì)3種N-糖基化位點(diǎn)突變體，即將SAS 和NT氨基酸分別改造為N-糖基化位點(diǎn)NGT和NLT，突變酶分別命名為proROLA (氨基酸序 列如SEQ ID NO. 1所示）和proROLB (氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示）；將SAS和NT兩個(gè) 位點(diǎn)同時(shí)改造為N-糖基化位點(diǎn)的突變酶命名為pr〇R0LAB(氨基酸序列如SEQ ID NO. 3所 示）。前導(dǎo)肽具體突變方式如圖1所示。
[0035] 具體構(gòu)建方法如下：
[0036] (1)以含有SEQ ID NO. 4所示氨基酸序列的米曲霉脂肪酶基因proROL的載體 pPIC9K-pr〇R0L、pGAPZ a為模板，同時(shí)用限制性內(nèi)切酶EcoR I、Not I雙酶切，膠回收目的 基因proROL和pGAPZ a載體片段，用T4DNA連接酶連接目的基因和載體，構(gòu)建重組質(zhì)粒 pGAPZ a -proROL〇
[0037] (2)以重組質(zhì)粒pGAPZ a -proR〇L為模板，設(shè)計(jì)引物NGT-A F/NGT-A R和 NLT-BF/NLT-BR分別進(jìn)行全質(zhì)粒PCR，構(gòu)建分別將ROL基因中SAS、LT氨基酸突變成 NGT、NLT的重組質(zhì)粒，命名為pGAPZ a -proROLA和pGAPZ a -proROLB。構(gòu)建完成后， 再以質(zhì)粒pGAPZ a -proR〇LA為模板，用引物NLT-BF/NLT-BR全質(zhì)粒PCR構(gòu)建重組質(zhì)粒 pGAPZa -proROLAB。所用引物如表1所示。
[0038] 表1引物