一種增強腫瘤抗原免疫原性的新策略及其在肺癌免疫治療中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種增強腫瘤抗原免疫原性的新策略及其在肺癌免疫治療中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]肺癌是當(dāng)前世界上最常見的惡性腫瘤之一，其死亡率居世界腫瘤相關(guān)疾病死因的首位。在大多數(shù)的病例當(dāng)中，患者就診時已經(jīng)是不可切除的病變或者無法治愈的疾病狀態(tài)。局部進展期或者一般情況較好的非小細(xì)胞肺癌患者可以接受同步放化療，聯(lián)合或不聯(lián)合手術(shù)治療，這樣可以獲得平均8個月的無疾病進展生存，但是5年總生存率仍小于15%。
[0003]因此迫切需要新的更有效的肺癌治療模式。近年來，在人們不斷探索的腫瘤治療新方法中，免疫治療是一種治療肺癌的有效新方法。肺癌免疫治療是一種極具前景的治療方法。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了一些腫瘤免疫學(xué)治療的靶點:
MUCl是一種跨膜糖蛋白，它在正常的管道上皮中都有表達(dá)，如乳腺、前列腺、肺、胃、膀胱和汗腺等。它的正常功能是與黏蛋白的形成有關(guān)，然而，在腫瘤當(dāng)中它的作用發(fā)生了改變，過量的糖蛋白表達(dá)會導(dǎo)致免疫活性的產(chǎn)生。高度的MUCl表達(dá)可以增加癌癥的侵襲性，導(dǎo)致肺癌患者的不良預(yù)后。不僅如此，MUCl的過度表達(dá)也會激活PI3K和AKT通路，導(dǎo)致腫瘤的增殖。
[0004]MAGE-A3，人類黑色素瘤抗原(MAGE) -A, -B，-C是一個基因家族，它是胚胎來源的正常表達(dá)抗原，也在人類特殊免疫組織部位表達(dá)。諸如黑色素瘤、肉瘤、膀胱癌、肝癌、食管癌以及肺癌的腫瘤細(xì)胞可表達(dá)此類抗原，因而它被認(rèn)為是腫瘤相關(guān)性抗原。MAGE-A3是這個家族基因的一個亞型，在早期(35%)及進展期(55%)肺癌中的表達(dá)存在差異，于是被認(rèn)為是免疫治療的一個非常好的靶點。
[0005]抗原PRAME，它參與維A酸受體抑制，在黑色素瘤及非小細(xì)胞肺癌中高表達(dá)，因此可以作為一個疫苗靶點。
[0006]盡管已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了上述潛在的腫瘤免疫治療靶點，然而腫瘤免疫治療尚面臨諸多問題。例如上述腫瘤抗原由于來自機體自身，因此免疫原性通常都很低。如何提高腫瘤抗原的免疫原性是當(dāng)今腫瘤治療領(lǐng)域的重大科學(xué)難題。
[0007]2014年德國默克公司宣布公司開發(fā)的新型抗癌疫苗藥物Tecemotide (mucl抗原特異性的抗癌疫苗)臨床三期研宄宣告失敗。就在不久之前，葛蘭素史克公司開發(fā)的抗癌疫苗MAGE A-3也在臨床三期研宄中宣告失敗。這些試驗的失敗原因很大程度上是因為腫瘤抗原免疫原性低，疫苗無法誘導(dǎo)出足夠強度的免疫應(yīng)答。
[0008]誘發(fā)機體產(chǎn)生免疫應(yīng)答的關(guān)鍵步驟在于抗原如何有效被抗原提呈細(xì)胞(APC細(xì)胞)提呈到免疫細(xì)胞表面。機體內(nèi)的APC細(xì)胞主要為樹突狀DC細(xì)胞。
[0009]自噬作用最初被認(rèn)為是細(xì)胞在營養(yǎng)缺乏或受到外界應(yīng)急情況下，降解自身細(xì)胞內(nèi)一些成分獲得營養(yǎng)從而能夠存活下來的機制。近來的研宄表明自噬在固有免疫、適應(yīng)性免疫中也發(fā)揮了重要的作用。有研宄數(shù)據(jù)表明機體能通過自噬機制提呈內(nèi)源性蛋白抗原，并激發(fā)相應(yīng)的免疫應(yīng)答。
[0010]只有增強腫瘤抗原的免疫原性，使之能在體內(nèi)引起更有效的腫瘤特異性免疫應(yīng)答，并且觀察到臨床療效，腫瘤的免疫治療才能真正使得人類獲益。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011]本發(fā)明的目的在于提供一種攜帶腫瘤融合抗原的重組腺病毒及其在制備用于預(yù)防或治療癌癥的制劑中的應(yīng)用。
[0012]本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是:
一種重組腺病毒，其攜帶自噬相關(guān)蛋白與腫瘤相關(guān)抗原的融合蛋白的編碼序列。
[0013]作為優(yōu)選的，所述自噬相關(guān)蛋白為LC3b蛋白。
[0014]作為優(yōu)選的，所述腫瘤相關(guān)抗原為黑色素瘤特異性抗原(PRAME)或人類黑色素瘤抗原(MAGE-A3)或 MUC1。
[0015]所述融合蛋白的編碼序列從5’到3’依次具有:腫瘤相關(guān)抗原編碼序列、任選的連接狀編碼序列和自■相關(guān)蛋白編碼序列。
[0016]所述融合蛋白編碼序列的插入位點位于腺病毒的El基因或E3基因區(qū)域。
[0017]所述腺病毒為2型腺病毒或5型腺病毒或55型腺病毒。
[0018]以上所述的重組腺病毒在制備用于預(yù)防或治療癌癥的制劑中的應(yīng)用，所述癌癥是指肺癌。
[0019]一種用于預(yù)防或治療癌癥的組合物，其包括以上所述的重組腺病毒。
[0020]所述藥物組合物中還包括藥學(xué)或免疫學(xué)上可接受的載體、賦形劑或佐劑。
[0021]本發(fā)明的有益效果是:
通過將腫瘤特異抗原與自噬基因融合，并利用腺病毒載體高效率感染機體APC細(xì)胞，二者協(xié)同作用可增強機體對腫瘤靶標(biāo)抗原的免疫應(yīng)答水平，具有明顯的抗腫瘤效果。
【附圖說明】
[0022]圖1:表達(dá)肺癌特異抗原的重組載體的構(gòu)建和鑒定；
圖2:通過ELIS0P0T技術(shù)檢測針對腫瘤特異抗原的細(xì)胞免疫應(yīng)答水平；
圖3:通過流式細(xì)胞技術(shù)檢測針對腫瘤特異抗原的CD4+ T細(xì)胞和CD8+ T細(xì)胞免疫應(yīng)答水平；
圖4:攜帶腫瘤融合抗原的重組腺病毒在小鼠腫瘤模型中起到了良好的殺傷腫瘤細(xì)胞的作用。
【具體實施方式】
[0023]下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步的說明，但并不局限于此。
[0024]以下實施例中所采用的分子生物學(xué)實驗技術(shù)包括PCR擴增、質(zhì)粒提取、質(zhì)粒轉(zhuǎn)化、DNA片段連接、酶切、凝膠電泳等，如無特殊說明，通常按照常規(guī)方法操作，具體可參見《分子克隆實驗指南》(第三版)(Sambrook J, Russell Dff, Janssen K, Argentine J.黃培堂等譯，2002，北京:科學(xué)出版社)，或按照制造廠商所建議的條件。
[0025]實施例1攜帶腫瘤融合抗原的重組腺病毒的構(gòu)建和鑒定
下面以腺病毒中插入肺癌相關(guān)抗原(PRAME、Muc-1、MAGE-A3)與LC3b蛋白的融合蛋白編碼序列制備重組腺病毒為例，對本發(fā)明的增強腫瘤抗原免疫原性策略作進一步的說明。
[0026]從NCBI數(shù)據(jù)庫中得到LC3b基因序列，如SEQ ID N0.1所示，其編碼的氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示，通過全基因合成得到LC3b基因。攜帶有人PRAME全長ORF cDNA序列的PVAX載體由本實驗室保存。PRAME全長ORF cDNA如SEQ ID N0.3所示，其編碼的氨基酸序列如SEQ ID N0.4所示。
[0027]按常規(guī)分子克隆技術(shù)方法將靶標(biāo)基因PRAME全長ORF cDNA與LC3b基因融合，其融合基因序列如SEQ ID N0.5所示。
[0028]Muc-1基因序列如SEQ ID N0.6所示，其與LC3b基因的融合基因序列如SEQ IDN0.7所示。
[0029]MAGE-A3基因序列如SEQ ID N0.8所示，其與LC3b基因的融合基因序列如SEQ IDN0.9所示。
[0030]按照本實驗室常規(guī)的重組腺病毒構(gòu)建方法，將LC3b，PRAME，PRAME_LC3b，MAGE-A3，MAGE-A3-LC3b，Muc-1, Muc-l_LC3b分別構(gòu)建到腺病毒載體中，其中的腺病毒載體為缺失了 El和E3區(qū)域的人2型或5型或55腺病毒，然后拯救得到攜帶目的基因的重組腺病毒，擴增后進行表達(dá)和基因組酶切鑒定，接著在Trex293細(xì)胞中大量擴增，并采用氯化銫梯度密度離心進行純化，對純化的病毒再次鑒定正確后測定其感染滴度TCID50和物理顆粒濃度，然后分裝凍存?zhèn)溆?相關(guān)方法的具體操作步驟可參見本團隊先前的專利，授權(quán)專利號:ZL 2007 I 0026295.X)。圖1 中 A 是腫瘤抗原基因(如 PRAME, MAGE-A3，Muc-1)與LC3b融合的示意圖；圖1中B是攜帶目的基因的重組腺病毒的構(gòu)建鑒定圖；圖1中C是用western-blot方法檢測重組腺病毒蛋白表達(dá)水平的檢測結(jié)果圖，可見純化的重組腺病毒可以高水平的表達(dá)目的蛋白。例如Ad5-PRAME可表達(dá)55KD左右的靶標(biāo)蛋白，并且不能被LC3b抗體認(rèn)別(條帶1)，只能被PRAME抗體認(rèn)識(條帶3) ;Ad5-PRAME-LC3b表達(dá)的條帶大小約為72Ka和55Ka，且該目標(biāo)蛋白既能被LC3b抗體認(rèn)別(條帶2)，也能被PRAME抗體認(rèn)識(條帶4)，這表明融合蛋白表達(dá)正確。
[0031]同樣，實驗結(jié)果表明:Ad5-Muc-l-LC3b和Ad5-MAGE-A3_LC3b融合蛋白表達(dá)正確。
[0032]實施例2、攜帶腫瘤融合抗原的重組腺病毒在小鼠模型中可顯著增強腫瘤抗原的免疫原性
進一步研宄融合了 LC3b的上述基因是否能夠在機體內(nèi)發(fā)揮作用而有效的提高T淋巴細(xì)胞反應(yīng)。
[0033]1.實驗材料
1.1流式抗體
所用單克隆抗體，抗鼠 ant1-CD3-PerCP, ant1-CD4_FITC and ant1-CD8_APC (BDB1sciences) ant1-1FN-γ-PE, ant1-TNF-a-PE-cy7, ant1-1L-2-APC_cy7 (BDPharmingen)購自 BD 公司。
[0034]1.2腫瘤抗原多肽
腫瘤多肽由本實驗室合成，大部分肽由15個氨基酸組成，兩兩之間有11個氨基酸重疊.純度>80%。用二甲基亞砜(DMSO)溶解配制成0.4mg/ml/肽的儲存液，分裝后_70°C保存。
[0035]1.3其他試劑
ELISP0T板(品牌！Millipore ;貨號:MSIPS4510)購自達(dá)科為生物科技有限公司，SIVgag蛋白購自蘇州杰恩生物技術(shù)有限公司，TMB/E底物(貨號:ES001)購自美國Chemicon公司。BCIP/NBT底物(品牌:PierCe ;貨號:34042)購自廣州吉泰生物科技有限公司。鏈霉素偶聯(lián)的堿性磷酸酶(品牌:BD PharMingen，貨號:554065)購自基因有限公司。
[0036]2、實驗方法
2.1實驗動物和免疫策略
每組10只6-8齡雌性C57BL/6小鼠。DNA疫苗免疫劑量為50ug/100ul/只；腺病毒疫苗免疫劑量為I X 19Vp/只/ΙΟΟμ?，分別在小鼠兩側(cè)的股四頭肌各注射50μ?。共免疫4次，間隔2周。免疫2次DNA疫苗后(即4周)，每組隨機取4只，處死，進行免疫檢測。剩余4只繼續(xù)注射重組腺病毒疫苗。
[0037]2.2多色流式技術(shù)檢測多功能T細(xì)胞
I)分離好的PBMC細(xì)胞計數(shù)后調(diào)整至2X 106/ml，加入到96孔培養(yǎng)板，每孔200ul。培養(yǎng)基為R10。
[0038]2)在上述細(xì)胞懸液中加入特異性抗原肽，陰性對照孔加入相應(yīng)濃度的DMS0，陽性對照加入佛波酯(PMA) (20ng/ml) +離子霉素(1000ng/ml)。