金黃色葡萄球菌抗原的穩(wěn)定的免疫原性組合物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及凍干的或重建的多抗原或多成分免疫原性組合物，其包含分離白葡萄球菌的至少一種抗原，本發(fā)明還涉及生產(chǎn)這種組合物的方法。
【專利說(shuō)明】金黃色葡萄球菌抗原的穩(wěn)定的免疫原性組合物
發(fā)明背景
[0001]人類是金黃色葡萄球菌(S.aureus)的天然儲(chǔ)庫(kù)。金黃色葡萄球菌可以永久地(10-35%)、間歇地(20-75%)在健康個(gè)體的皮膚上、鼻孔及咽喉內(nèi)建群，或呈非攜帶(non-carriage)狀態(tài)(5-70% ),而無(wú)相關(guān)疾病。見(jiàn) Vandenbergh et al., J.Clin.Micr0.37 =3133-3140(1999)。當(dāng)個(gè)體由于免疫屏障破壞如手術(shù)期間、放置留置導(dǎo)管或其他裝置、創(chuàng)傷或傷口而變得免疫系統(tǒng)受損時(shí)，隨后會(huì)發(fā)生疾病。所產(chǎn)生的金黃色葡萄球菌感染可導(dǎo)致眾多疾病，從輕度皮膚感染至心內(nèi)膜炎、骨髓炎、菌血癥、膿毒癥，及其它形式疾病，伴隨高死亡率。大的人類儲(chǔ)庫(kù)增加了適應(yīng)的病原性克隆類型的進(jìn)化和傳播的機(jī)會(huì)。
[0002]來(lái)自革蘭氏陽(yáng)性球菌金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌(S^pidermidis)的侵襲性葡萄球菌感染被特別關(guān)注，這是由于其成為世界范圍內(nèi)日益增加的公眾健康問(wèn)題。特別地，金黃色葡萄球菌與大多數(shù)醫(yī)院獲得性(醫(yī)院內(nèi))感染相關(guān)，其在群體性發(fā)作的感染中的流行性漸增。例如，據(jù)估計(jì)美國(guó)在2005年侵襲性耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)的發(fā)生率為 31.8/100，000 人，包括 18，650 人死亡。見(jiàn) Klevens R.M.et al.，JAMA，298:1763-71 (2007)所述。
[0003]葡萄球菌疾病在近20年來(lái)已經(jīng)示出是引人注目的疾??；其隨著血管內(nèi)裝置和介入術(shù)的使用而增加。由于平行的抗生素抗性的增加使得疾病發(fā)生率的上升更麻煩；因此，迫切需要免疫原性組合物，以用于疫苗或者激發(fā)多克隆或單克隆抗體以賦予被動(dòng)免疫性，從而作為預(yù)防或治療葡萄球菌感染及相關(guān)疾病的手段。
[0004]聚集因子A (Clumping factorA, ClfA)是金黃色葡萄球菌細(xì)胞壁相關(guān)的粘附素，其介導(dǎo)葡萄球菌結(jié)合血纖蛋白原和血小板。在細(xì)菌細(xì)胞表面上表達(dá)，認(rèn)為其在此通過(guò)結(jié)合沉積在組織損傷部位的血纖蛋白原和纖維蛋白而促進(jìn)發(fā)病。ClfA是非常保守的，甚至最多樣性形式(~85%相同性)也呈現(xiàn)出對(duì)于單克隆和多克隆抗體的廣泛交叉反應(yīng)性。因此，ClfA是抗金黃色葡萄球菌的疫苗的成分的一種適當(dāng)?shù)暮蜻x物。然而，鑒于ClfA的結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定性，由于其在貯存時(shí)易于隨時(shí)間降解因此ClfA的配制是一個(gè)問(wèn)題。
[0005]全長(zhǎng)ClfA包含一些區(qū)域和結(jié)構(gòu)域:N-末端分泌結(jié)構(gòu)域(“S”結(jié)構(gòu)域);隨后是配體結(jié)合A區(qū)，其含有三個(gè)結(jié)構(gòu)域(NI，含有EF-手性基序的N2，以及N3);隨后是R區(qū)，其含有絲氨酸-天冬氨酸二肽重復(fù)；隨后是細(xì)胞壁結(jié)合區(qū)(“W”區(qū))，其含有LPXTG基序；疏水性跨膜結(jié)構(gòu)域(“M”區(qū))；及帶電荷的C-末端(“C”區(qū))，其含有帶正電荷的氨基酸。所述NI區(qū)含有蛋白酶敏感性位點(diǎn)。ClfA的不穩(wěn)定性很大程度上歸因于ClfA在NI的剪切，產(chǎn)生含有NI和N2N3的片段。ClfA的結(jié)構(gòu)和功能在美國(guó)專利申請(qǐng)出版物20070087014A1 (Pavliaket al.，2007年4月19日)中公開(kāi)，所述專利以其全部?jī)?nèi)容援引加入本文。
[0006]能導(dǎo)致侵襲性疾病的葡萄球菌屬微生物通常也能產(chǎn)生莢膜多糖(CP)，其包囊細(xì)菌并增強(qiáng)其對(duì)宿主天然免疫系統(tǒng)清除的抗性。所述CP將細(xì)菌細(xì)胞掩蓋在保護(hù)性莢膜中，導(dǎo)致細(xì)菌對(duì)于吞噬作用及細(xì)胞內(nèi)殺滅的抗性。缺少莢膜的細(xì)菌更易于被吞噬。莢膜多糖通常是包括流感嗜血桿菌(Haemophilus influenzae)、肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)和B族鏈球菌在內(nèi)的許多細(xì)菌病原體的重要毒力因子。[0007]金黃色葡萄球菌的大部分臨床分離株被血清型5或8包囊。5型(CP5)和8型(CP8)莢膜多糖具有相似的三糖重復(fù)單位，包含N-乙酰氨基甘露醇醒酸(mannosaminuronicacid)、N-乙酰-L-巖藻糖胺及 N-乙酰-D-巖藻糖胺。見(jiàn) Fournier, J.M.et al., Infect.Tmmun.45:97-93(1984)和 Moreau, Μ.，et al.，Carbohydrate Res.201:285-297(1990)所述。這兩個(gè)CP具有相同的糖，但是糖鏈接和O-乙?；恢貌煌髯援a(chǎn)生血清學(xué)不同的免疫反應(yīng)性模式。
[0008]金黃色葡萄球菌MntC蛋白(也稱作蛋白305、P305、P305A，及0RF305)是錳ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的一種成分。這種蛋白在體內(nèi)表達(dá)。金黃色葡萄球菌使用錳作為增強(qiáng)金黃色葡萄球菌在中性粒細(xì)胞中存活的酶的輔因子。因此，MntC對(duì)于在感染期間金黃色葡萄球菌的體內(nèi)存活是重要的。與ClfA相同，這種蛋白在溶液中也是不穩(wěn)定的。然而，與可以聚集或者通過(guò)水解剪切的ClfA不同，MntC降解的主要機(jī)制是在堿性pH和/或室溫(大約25°C )或更高溫度條件下的脫酰胺作用。
[0009]因此，不僅急切地需要抗金黃色葡萄球菌感染的疫苗，而且還特別需要具有增強(qiáng)的抗原穩(wěn)定性的疫苗。
[0010]發(fā)明概沭
[0011]本發(fā)明涉及凍干的或重建的(reconstituted)多抗原或多成分免疫原性組合物，其包含至少一種分離自葡萄球菌的抗原。所述抗原是多肽和多糖，可以通過(guò)使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的分離方法直接得自細(xì)菌，或者可以使用合成方案產(chǎn)生，或者可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的遺傳工程 方法重組產(chǎn)生，或者通過(guò)組合前述這些方式產(chǎn)生。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的凍干的或重建的免疫原性組合物包含分離的金黃色葡萄球菌聚集因子A(ClfA)。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的凍干的或重建的免疫原性組合物包含選自如下的三種或更多種抗原:分離的金黃色葡萄球菌聚集因子A(ClfA)多肽、分離的金黃色葡萄球菌聚集因子B(ClfB)多肽、與載體蛋白綴合的分離的金黃色葡萄球菌5型莢膜多糖(CP5)、與載體蛋白綴合的分離的金黃色葡萄球菌8型莢膜多糖(CP8)以及分離的金黃色葡萄球菌MntC蛋白。此外，本發(fā)明提供了誘導(dǎo)針對(duì)葡萄球菌的免疫應(yīng)答的方法；預(yù)防由葡萄球菌所致疾病、降低這種疾病的嚴(yán)重性或者延遲疾病發(fā)生的方法；以及預(yù)防由葡萄球菌感染所致疾病的至少一個(gè)癥狀、降低這種疾病的至少一個(gè)癥狀的嚴(yán)重性或者延遲這種疾病的至少一個(gè)癥狀發(fā)生的方法。
[0012]因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了凍干的或重建的免疫原性組合物，其包含:分離的金黃色葡萄球菌聚集因子A(ClfA)多肽、與載體蛋白綴合的分離的金黃色葡萄球菌5型莢膜多糖(CP5)及與載體蛋白綴合的分離的金黃色葡萄球菌8型莢膜多糖(CP8)。
[0013]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了凍干的或重建的免疫原性組合物，其包含:分離的金黃色葡萄球菌聚集因子A (ClfA)多肽、分離的金黃色葡萄球菌聚集因子B (ClfB)多肽、與載體蛋白綴合的分離的金黃色葡萄球菌5型莢膜多糖(CP5)及與載體蛋白綴合的分離的金黃色葡萄球菌8型莢膜多糖(CP8)。
[0014]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了凍干的或重建的免疫原性組合物，其包含:分離的金黃色葡萄球菌聚集因子A (ClfA)多肽、分離的金黃色葡萄球菌聚集因子B (ClfB)多肽、分離的金黃色葡萄球菌MntC蛋白、與載體蛋白綴合的分離的金黃色葡萄球菌5型莢膜多糖(CP5)及與載體蛋白綴合的分離的金黃色葡萄球菌8型莢膜多糖(CP8)。[0015]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了凍干的或重建的免疫原性組合物，其包含:分離的金黃色葡萄球菌聚集因子A(CIfA)多肽、分離的金黃色葡萄球菌MntC蛋白、與載體蛋白綴合的分離的金黃色葡萄球菌5型莢膜多糖(CP5)以及與載體蛋白綴合的分離的金黃色葡萄球菌8型莢膜多糖(CP8)。
[0016]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了凍干的或重建的免疫原性組合物，其包含:分離的金黃色葡萄球菌聚集因子B(ClfB)多肽、與載體蛋白綴合的分離的金黃色葡萄球菌5型莢膜多糖(CP5)以及與載體蛋白綴合的分離的金黃色葡萄球菌8型莢膜多糖(CP8)。
[0017]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了凍干的免疫原性組合物，其包含:(a)選自如下的至少三種成分:分離的金黃色葡萄球菌聚集因子A( “ClfA”)多肽、分離的金黃色葡萄球菌聚集因子B ( “ClfB”)多肽、5型莢膜多糖(CP5)-蛋白綴合物、8型莢膜多糖8(CP8)_蛋白綴合物及分離的金黃色葡萄球菌MntC多肽；(b)緩沖劑，其pKa為6.0±0.6 ;及(c)填充劑(bulking agent)。在某些實(shí)施方案中，所述ClfA多肽在37°C下保持至少一個(gè)月基本不降解。
[0018]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了凍干的免疫原性組合物，其包含:(a)分離的金黃色葡萄球菌聚集因子A ( “ClfA”)多肽；(b) 5型莢膜多糖(CP5)-蛋白綴合物；(c) 8型莢膜多糖8(CP8)_蛋白綴合物；(d)緩沖劑，其pKa為6.0±0.6 ;以及(e)填充劑。在某些實(shí)施方案中，所述ClfA多肽在37°C下保持至少一個(gè)月基本不降解。
[0019]在一個(gè)實(shí)施方案中，凍干的免疫原性組合物包含占所述免疫原性組合物總重量小于 3%重量的水(％ w/w)，其中 ClfA 多肽在 0.09% ±0.027%和 0.85% ±0.26% w/w 之間，CP5-蛋白綴合物在0.04% ±0.013%和0.42±0.13% w/w之間，CP8-蛋白綴合物在0.04% ±0.013%和 0.42±0.13% w/w 之間，所述緩沖劑為 2.54% ±0.76% w/w。
[0020]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了凍干的免疫原性組合物，其包含:(a) ClfA多肽；(b)CP5-蛋白綴合物；(c)CP8-蛋白綴合物；(d)組氨酸緩沖劑，ρΗ6.0±0.5 ; (e)蔗糖;
(f)聚山梨醇酯80;以及(g)水。在某些實(shí)施方案中，所述ClfA多肽在37°C下保持至少3個(gè)月基本不降解。
[0021]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了凍干的免疫原性組合物，其包含:(a)ClfA多肽，在 0.09% ±0.027 % 和 0.85% ±0.26% w/w 之間；(b) CP5-蛋白綴合物，在 0.04 %±0.013 % 和 0.42±0.13 % w/w 之間；(c)CP8_ 蛋白綴合物，在 0.04 % ±0.013 % 和0.42±0.13% w/w 之間；(d)組氨酸緩沖劑，ρΗ6.0±0.5，為 2.54% ±0.76% w/w ； (e)蔗糖，97% ±2.0% w/w; (f)聚山梨醇酯 80，0.21% ±0.04% w/w;以及(g)水，2% ±1% w/
Wo
[0022]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了液體免疫原性三抗原組合物，其通過(guò)將本發(fā)明的凍干的免疫原性組合物在水性稀釋劑中重建而產(chǎn)生，所述重建的組合物的最終pH為6.0±0.5。
[0023]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了液體免疫原性組合物，其通過(guò)重建本發(fā)明的凍干的免疫原性組合物而產(chǎn)生，其包含:(a) ClfA多肽，濃度在40 μ g/ml ±4 μ g/ml和 800 μ g/ml ±80 μ g/ml 之間；(b) CP5-蛋白綴合物，濃度在 20 μ g/ml ±2 μ g/ml 和400 μ g/ml ±40 μ g/ml 之間；(c)CP8_ 蛋白綴合物，濃度在 20 μ g/ml ±2 μ g/ml 和 400 μ g/
之間；(d)組氨酸緩沖劑，濃度為10mM±5mM;(e)聚山梨醇酯80，濃度為0.1% ±0.05%重量/體積(w/v);以及(f)蔗糖，濃度為9% ±4.5% w/v。在另一實(shí)施方案中，聚山梨醇酯80的濃度為0.01% ±0.005%重量/體積(w/v)，蔗糖濃度為4.5%± 1.5% w/v。
[0024]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了液體免疫原性組合物，其包含:(a)重建的凍干的ClfA多肽；(b)CP5-蛋白綴合物；(c)CP8-蛋白綴合物；(d)組氨酸緩沖劑，ρΗ6.0±0.5 ;
(e)聚山梨醇酯80 ;(f)蔗糖；及(g)水性稀釋劑。[0025]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了液體免疫原性組合物，其通過(guò)重建本發(fā)明的凍干的免疫原性組合物而產(chǎn)生，其包含:(a)重建的凍干的ClfA多肽，濃度在40 μ g/ml ± 4 μ g/ml 和 800 μ g/ml ±80 μ g/ml 之間；(b) CP5-蛋白綴合物，濃度在 20 μ g/ml ±2 μ g/ml 和 400 μ g/ml ±40 μ g/ml 之間；(c) CP8-蛋白綴合物，濃度在 20 μ g/ml ±2 μ g/ml 和 400 μ g/ml ±40 μ g/ml 之間；(d)組氨酸緩沖劑,濃度為 10mM±5mM ； (e)聚山梨醇酯80，濃度為0.1% ±0.05%重量/體積(w/v) ；(f)蔗糖，濃度為9% ±4.5%w/v ；及(g)水性稀釋劑。在另一實(shí)施方案中，聚山梨醇酯80濃度為0.01% ±0.005%重量/體積(w/v)，蔗糖濃度為 4.5% ±1.5% w/Vo
[0026]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了產(chǎn)生免疫原性組合物的方法，包括如下步驟:
(a)組合水溶液，水溶液包含:(i)ClfA多肽，(ii)CP5-蛋白綴合物，(iii)CP8-蛋白綴合物，(iv)緩沖劑，PKa為6.0±0.6，及(V)填充劑；以及(b)凍干步驟(a)的組合以形成包含重量小于3%水的塊狀物(cake)。在某些實(shí)施方案中，所述方法進(jìn)一步包括在步驟(a)組合(vi)表面活性劑。在某些實(shí)施方案中，所述方法進(jìn)一步包括對(duì)步驟(a)的組合進(jìn)行過(guò)濾滅菌，之后進(jìn)行步驟(b)的凍干。在某些實(shí)施方案中，所述水溶液包含pH6.0±0.5的10mM± ImM組氨酸、9% ±4.5% w/v的蔗糖以及0.1% ±0.05% w/v的聚山梨醇酯80。在另一實(shí)施方案中，所述聚山梨醇酯80的濃度為0.01% ±0.005% w/v，蔗糖濃度為4.5%± 1.5% w/v。
[0027]在某些實(shí)施方案中，凍干步驟(b)包括如下步驟:(i)以0.3°C ±0.03°C/分鐘的速度冷凍步驟(a)的滅菌的組合，直至達(dá)到溫度為-50°C ±5°C，壓力為400毫巴±40毫巴；然后將該組合在_50°C ±5°C保持60分鐘±6分鐘；(ii)復(fù)性所述組合，通過(guò)以0.30C ±0.03°C /分鐘的速度提高溫度至-10°C ±5°C，接著在-10°C ±5°C保持120分鐘±12分鐘，隨后以0.30C ±0.030C /分鐘的速度降低溫度直至達(dá)到_50°C ±5°C溫度，在-50°C ±5°C溫度保持180分鐘±18分鐘；(iii)干燥該組合，通過(guò)使壓力降低至50毫托(mTorr)及保持30分鐘，隨后以0.2°C ±0.02°C /分鐘的速度提高溫度至_30°C ±5°C，接著在-30°C ±5°C溫度保持1,920分鐘±192分鐘；(iv)進(jìn)一步干燥該組合，通過(guò)以0.2 0C ±0.02°C /分鐘的速度提高溫度至30°C ±5°C并增加壓力至200mTorr，隨后在300C ±5°C溫度保持720分鐘±72分鐘；以及(V)以0.5°C ±0.05°C /分鐘的速度降低溫度至5°C ± 5°C。在一些實(shí)施方案中，在小瓶?jī)?nèi)進(jìn)行凍干。在一些實(shí)施方案中，所述小瓶在凍干后用瓶塞塞住。在某些實(shí)施方案中，將小瓶用氮?dú)獬涮钪笥闷咳?。在某些?shí)施方案中，所述方法進(jìn)一步包括如下步驟:(c)將在步驟(b)的凍干的組合在水性介質(zhì)中重建。在某些實(shí)施方案中，步驟(c)的重建的組合的重量摩爾滲透壓濃度在250m0SM±25m0SM和300m0SM±30m0SM之間。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的免疫原性組合物是根據(jù)產(chǎn)生本發(fā)明的免疫原性組合物的任何方法生產(chǎn)的。[0028]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了凍干的免疫原性組合物，其包含:(a)選自如下的至少四種成分:分離的金黃色葡萄球菌聚集因子A(ClfA)多肽、分離的金黃色葡萄球菌聚集因子B(ClfB)多肽、CP5-蛋白綴合物、CP8-蛋白綴合物及分離的金黃色葡萄球菌MntC多肽；(b)緩沖劑，其pKa為6.0±0.6 ;以及(c)填充劑。在某些實(shí)施方案中，所述ClfA多肽在37 °C下保持至少I個(gè)月基本不降解。
[0029]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了凍干的免疫原性組合物，其包含:(a)分離的金黃色葡萄球菌聚集因子A (ClfA)多肽；(b)與CRM197綴合的5型莢膜多糖(CP5-CRM197) ； (c)與CRM197綴合的8型莢膜多糖(CP8-CRM197) ； (d)分離的MntC多肽；(e)緩沖劑，其pKa為6.0 ±0.6;及(f)填充劑。在某些實(shí)施方案中，所述ClfA多肽在37 °C下保持至少I個(gè)月基本不降解。
[0030]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了凍干的免疫原性組合物，其包含:低于所述免疫原性組合物總重量3%重量的水w/w)，其中所述ClfA多肽在0.09% ±0.027%和0.84% ±0.25 % w/w 之間，CP5-CRM197 在 0.04 % ±0.013 % 和 0.42±0.13 % w/w 之間，CP8-CRM197 在 0.04 % ±0.013% 和 0.42±0.13% w/w 之間，MntC 在 0.09 % ±0.027% 和0.84% ±0.25% w/w 之間，緩沖劑為 3.3% ±0.99% w/wD
[0031]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了凍干的免疫原性組合物，其包含:(a)ClfA多肽；(b)CP5-CRM197綴合物；(c)CP8-CRM197綴合物；(d)MntC多肽；(e)組氨酸緩沖劑；(f)蔗糖；(g)聚山梨醇酯80;及(h)水。在某些實(shí)施方案中，所述ClfA多肽在37°C下保持至少3個(gè)月基本不降解。
[0032]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了凍干的免疫原性組合物，其包含:(a) ClfA多肽，在 0.09% ±0.027% 和 0.84% ±0.25% w/w 之間;(b) CP5_CRM197 綴合物，在 0.04 %±0.013 % 和 0.42±0.13 % w/w 之間；(c) CP8_CRM197 綴合物，在 0.04 % ±0.013 % 和0.42±0.13 % w/w 之間；(d)MntC 多肽，在 0.09 % ±0.027 % 和 0.84% ±0.25% w/w 之間；(e)組氨酸緩沖劑，3.3% ±0.99% w/w ； (f)鹿糖,95% ±2% w/w ； (g)聚山梨醇酯80,0.21% ±0.063%w/w;及(h)水，2% ± I % w/w。在某些實(shí)施方案中，所述ClfA多肽在37°C下保持至少3個(gè)月基本不降解。
[0033]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了液體免疫原性四抗原組合物，其通過(guò)將本發(fā)明的凍干的免疫原性組合物在水性稀釋劑中重建而產(chǎn)生，所述重建的組合物的最終pH為6.5 + 0.5。
[0034]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了液體免疫原性組合物，其包含:(a)ClfA多肽，其濃度在 40 μ g/ml ±4 μ g/ml 和 800 μ g/ml ±80 μ g/ml 之間；(b) CP5_cRM197 綴合物，其濃度在 20 μ g/ml ±2 μ g/ml 和 400 μ g/ml ±40 μ g/ml 之間；(c) CP8_CRM197 綴合物，其濃度在20 μ g/ml ±2 μ g/ml 和 400 μ g/ml ±40 μ g/ml 之間；(d)分離的MntC 多肽,其濃度在 40 μ g/ml ±4 μ g/ml 和 800 μ g/ml ±80 μ g/ml 之間；(e`)組氨酸緩沖劑，其濃度為 10mM±5mM ； (f)聚山梨醇酯80，其濃度為0.01% ±0.005%重量/體積(w/v) '及(g)蔗糖，其濃度為4.5%±1.5% w/v。在另一實(shí)施方案中，聚山梨醇酯80的濃度為0.01% ±0.005% w/v，蔗糖濃度為 4.5% ±1.5% w/v ο
[0035]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了液體免疫原性組合物，其包含:(a)重建的凍干的ClfA多肽；(b) CP5-CRM197綴合物；(c) CP8-CRM197綴合物；(d)MntC多肽；(d)組氨酸緩沖劑;(e)聚山梨醇酯80 ； (f)蔗糖；及(g)水性稀釋劑。
[0036]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了液體免疫原性組合物，其包含:(a)重建的凍干的 ClfA 多肽，濃度在 40 μ g/ml ±4 μ g/ml 和 800 μ g/ml ±80 μ g/ml 之間；(b) CP5_CRM197綴合物，濃度在 20 μ g/ml ± 2 μ g/ml 和 400 μ g/ml ±40 μ g/ml 之間；(c) CP8_CRM197 綴合物，濃度在 20 μ g/ml ±20 μ g/ml 和 400 μ g/ml ±40 μ g/ml 之間；(d)分離的 MntC 多肽，濃度在40 μ g/ml±40y g/ml和800 μ g/ml±80y g/ml之間；(e)組氨酸緩沖劑，濃度為10mM±5mM；(f)聚山梨醇酯80，濃度為0.1 % ±0.05%重量/體積(w/v);及(g)蔗糖，濃度為9% ±4.5% w/v;以及(h)水性稀釋劑。在另一實(shí)施方案中，聚山梨醇酯80濃度為0.01 % ±0.005% w/v,鹿糖濃度為 4.5% ±1.5% w/v。
[0037]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了產(chǎn)生免疫原性組合物的方法，包括如下步驟:
(a)在水溶液中組合如下成分:(i) ClfA多肽，(ii)CP5-CRM197綴合物，(iii) CP8_CRM197綴合物，(iv)MntC多肽，(V)緩沖劑，pKa為6.0 + 0.6，及(vi)填充劑；及(b)將步驟(a)的組合凍干以形成包含重量少于3%水的塊狀物。在某些實(shí)施方案中，所述方法在步驟(a)進(jìn)一步包括組合(vi)表面活性劑。在某些實(shí)施方案中，所述方法進(jìn)一步包括對(duì)步驟(a)的組合進(jìn)行過(guò)濾滅菌的步驟，之后進(jìn)行步驟(b)的凍干。在某些實(shí)施方案中，所述水溶液包含pH6.0±0.5 的 10mM±5mM 組氨酸,9 % ± I % w/v 的鹿糖以及 0.1 % ±0.02 % w/v 的聚山梨醇酯80。在其它實(shí)施方案中，聚山梨醇酯80濃度為0.01% ±0.001% w/v，蔗糖濃度為
4.5% ±0.45% w/v.,在某些實(shí)施方案中，凍干步驟(b)包括如下步驟:(i)將步驟(a)的滅菌的組合以0.3°C ±0.03°C /分鐘的速度冷凍直至達(dá)到溫度_50°C ±5°C，壓力為400毫巴±40毫巴；然后將所述組合在溫度_50°C ±5°C保持60分鐘±6分鐘；(ii)復(fù)性該組合,通過(guò)以0.3°C ±0.03°C /分鐘的速度提高溫度至-10°C ±5°C，然后在-10°C ±5°C溫度保持120分鐘±12分鐘，然后以0.30C ±0.030C /分鐘的速度降低溫度直至達(dá)到_50°C ±5°C,然后在-50°C ±5°C溫度保持180分鐘±18分鐘；(iii)使所述組合干燥，通過(guò)將壓力降低至50毫托(mTorr)及保持30分鐘，然后以0.2°C ±0.02°C /分鐘的速度增加溫度至-30°C ±5°C，然后在_30°C ±5°C溫度保持1，920分鐘±192分鐘；(iv)干燥所述組合，通過(guò)以0.2°C ±0.02°C /分鐘的速度提高溫度至30°C ±5°C，然后再加壓力至200mTorr并在30°C ±5°C溫度保持720分鐘±72分鐘；(V)以0.5°C ±0.05°C /分鐘的速度降低溫度至5°C ±5°C。在一些實(shí)施方案中，凍干是在小瓶中進(jìn)行。在一些實(shí)施方案中，在凍干之后將小瓶用瓶塞塞住。在某些實(shí)施方案中，用氮?dú)獬涮钚∑恐笤儆闷咳?。在某些?shí)施方案中，所述方法進(jìn)一步包括如下步驟:(c)在水性介質(zhì)中重建步驟(b)的凍干的組合。在某些實(shí)施方案中，步驟(c)的重建的組合的重量摩爾滲透壓濃度在250m0SM±25m0SM和300m0SM±30m0SM之間。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的免疫原性組合物是根據(jù)產(chǎn)生本發(fā)明的免疫原性組合物的任何方法產(chǎn)生的。
[0038]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了凍干的免疫原性組合物，其包含:(a)分離的金黃色葡萄球菌聚集因子A(ClfA)多肽，其包含血纖蛋白原結(jié)構(gòu)域，(b)緩沖劑，pKa為6.0±0.6，及(c)填充劑。在某些實(shí)施方案中，所述ClfA多肽在37°C下保持至少I個(gè)月基本不降解。在一個(gè)實(shí)施方案中，本 發(fā)明提供了凍干的免疫原性組合物，其包含低于所述免疫原性組合物總重量3%重量的水w/w)，其中ClfA多肽為0.52% ±0.46% w/w，所述緩沖劑為0.28% ±0.065% w/w。在某些實(shí)施方案中，所述填充劑是97% ±2.0% w/w的蔗糖。
[0039]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了凍干的免疫原性組合物，其包含:(a) ClfA多肽，0.52% ±0.46% w/w，(b)琥珀酸鹽緩沖劑，0.28% ±0.065 % w/w，(c)蔗糖，97%±0.57% w/w, (d)聚山梨醇酯 80，0.20% ±0.042% w/w，及(e)水，2.5% ±0.5% w/w。在某些實(shí)施方案中，ClfA多肽在37 °C下保持至少I個(gè)月基本不降解。
[0040]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了液體免疫原性ClfA組合物，其通過(guò)將本發(fā)明的凍干的免疫原性組合物在水性稀釋劑中重建而產(chǎn)生，所述重建的組合物的最終pH為6.0±0-3。
[0041]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了液體免疫原性ClfA組合物，其通過(guò)將本發(fā)明的凍干的免疫原性組合物在水性稀釋劑中重建而產(chǎn)生，所述重建的組合物的最終pH為
6.5±0.3。
[0042]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了液體免疫原性組合物，其包含:(a)ClfA多肽，濃度在 20 μ g/ml ±2 μ g/ml 和 600 μ g/ml ±60 μ g/ml 之間；(b)組氨酸緩沖劑，10mM±5mM ；
(c)聚山梨醇酯80，0.1% ±0.05%重量/體積(w/v);及(d)蔗糖，濃度為9% ±4.5% w/V。在另一實(shí)施方案中，聚山梨醇酯80的濃度為0.01% ±0.005% w/v，蔗糖濃度為4.5%± 1.5% w/v。
[0043]在一個(gè)實(shí)施 方案中，本發(fā)明提供了產(chǎn)生免疫原性組合物的方法，包括如下步驟:
(a)在水溶液中組合:(i)重組聚集因子A(rClfA)多肽，(ii)pKa為6.0±0.6的緩沖劑，及(iii)填充劑 '及(b)將步驟(a)的組合凍干以形成包含低于3%重量的水的塊狀物。在某些實(shí)施方案中，所述方法在步驟(a)中進(jìn)一步包括組合(vi)表面活性劑。在某些實(shí)施方案中，所述方法進(jìn)一步包括對(duì)步驟(a)的組合進(jìn)行過(guò)濾滅菌的步驟，之后進(jìn)行步驟
(b)的凍干。在某些實(shí)施方案中，所述水溶液包含pH6.0±0.5的IOmMilmM組氨酸，9%±1% w/v的蔗糖及0.1% ±0.02% w/v的80。在其它實(shí)施方案中，聚山梨醇酯80濃度為0.01% ±0.001% w/v，蔗糖濃度為4.5% ±0.45% w/v。在某些實(shí)施方案中，凍干步驟
(b)包括如下步驟:(i)將步驟(a)的滅菌的組合以0.30C ±0.030C /分鐘的速度冷凍直至達(dá)到溫度為_(kāi)50°C ±5°C，壓力為400毫巴±40毫巴；然后將該組合在_50°C ±5°C溫度保持60分鐘±6分鐘；(ii)使該組合復(fù)性，通過(guò)以0.30C ±0.030C /分鐘的速度提高溫度至-10°C ±5°C;然后在-10°C ±5°C溫度保持120分鐘±12分鐘；然后以0.3°C ±0.03°C /分鐘的速度降低溫度至_50°C ±5°C ;然后在_50°C ±5°C溫度保持180分鐘±18分鐘；(iii)使所述組合干燥，通過(guò)將壓力降低至50毫托(mTorr)及以0.2V ±0.02°C /分鐘的速度提高溫度至_25°C ±5°C;然后在25°C ±5°C溫度保持1，320分鐘±132分鐘；(iv)干燥該組合，通過(guò)以0.20C ±0.020C /分鐘的速度將溫度提高至30°C ±5°C ;然后將壓力增加至200mTorr并在30°C ±5°C溫度保持720分鐘±72分鐘；(V)以0.5°C ±0.05°C /分鐘的速度降低溫度至5°C ±5°C。在一些實(shí)施方案中，凍干是在小瓶中進(jìn)行。在一些實(shí)施方案中，在凍干后將該小瓶用瓶塞塞住。在某些實(shí)施方案中，用氮?dú)獬涮钤撔∑?，之后再用瓶塞塞住小瓶。在某些?shí)施方案中，所述方法進(jìn)一步包括如下步驟:(c)將步驟(b)的凍干的組合在水性介質(zhì)中重建。在某些實(shí)施方案中，將步驟(b)的干燥的組合在水性介質(zhì)中重建步驟(c)的重建的組合的重量摩爾滲透壓濃度，其中重建的組合的重量摩爾滲透壓濃度為300m0sm±30m0sm。在某些實(shí)施方案中，所述水性介質(zhì)包含選自如下的至少兩種成分:(a)金黃色葡萄球菌聚集因子B (ClfB)多肽，(b) 5型莢膜多糖(CP5)-蛋白綴合物，(c) 8型莢膜多糖(CP8)-蛋白綴合物，及(d)金黃色葡萄球菌MntC多肽。在某些實(shí)施方案中，所述水溶液包含CP5-蛋白綴合物和CP8-蛋白綴合物。在某些實(shí)施方案中，所述水溶液包含CP-5蛋白綴合物，CP8-蛋白綴合物和MntC多肽。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的免疫原性組合物是根據(jù)產(chǎn)生本發(fā)明的免疫原性組合物的任何方法產(chǎn)生的。
[0044]在某些實(shí)施方案中，所述ClfA多肽包含N結(jié)構(gòu)域。在某些實(shí)施方案中，所述ClfA多肽包含N1、N2或N3結(jié)構(gòu)域。在某些實(shí)施方案中，所述ClfA多肽包含N1、N2和N3結(jié)構(gòu)域。在某些實(shí)施方案中，所述ClfA多肽包含血纖蛋白原結(jié)合結(jié)構(gòu)域。在某些實(shí)施方案中，所述血纖蛋白原結(jié)合結(jié)構(gòu)域已經(jīng)被改變以在與觀測(cè)到血纖蛋白原與ClfA的天然血纖蛋白原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的結(jié)合水平相比降低的水平結(jié)合血纖蛋白原。在某些實(shí)施方案中，所述血纖蛋白原結(jié)合結(jié)構(gòu)域通過(guò)在Tyr338、Tyr256、Pro336、Lys389、Ala254和Ile387中的一或多個(gè)具有氨基酸取代而展示出與血纖蛋白原的結(jié)合降低。在某些實(shí)施方案中，在Tyr338、Tyr256、Pro336、Lys389、Ala254和Ile387中一或多個(gè)的氨基酸取代是取代為Ala或Ser。在某些實(shí)施方案中，Tyr338被取代為Ala。
[0045]在某些實(shí)施方案中，所述CP5-蛋白綴合物是CP5_CRM197、CP5-肺炎球菌溶血素或者CP5-鏈球菌C5a肽酶(SCP)。在某些實(shí)施方案中，所述CP8-蛋白綴合物是CP8_CRM197、CP8-肺炎球菌溶血素或者CP8-鏈球菌C5a肽酶(Scp)。
[0046]在某些實(shí)施方案中，凍干的免疫原性組合物的緩沖劑包含pH6.0±0.3的琥珀酸鹽。在某些實(shí)施方案中，所述緩沖劑包含pH6.5±0.5的組氨酸。在某些實(shí)施方案中，所述緩沖劑包含pH6.0±0.3的組氨酸。在某些實(shí)施方案中，填充劑選自蔗糖、海藻糖、甘露醇、甘氨酸和山梨糖醇。在某些實(shí)施方案中，所述填充劑是蔗糖。在某些實(shí)施方案中，所述填充劑是96% ±0.2% w/w的蔗糖。在某些實(shí)施方案中，所述凍干的免疫原性組合物進(jìn)一步包含表面活性劑。在某些實(shí)施方案中,所述表面活性劑選自泊洛沙姆(poloxamer)、聚氧乙烯烷基醚和聚氧乙烯山梨聚糖脂肪酸酯。在某些實(shí)施方案中，所述聚氧乙烯山梨聚糖脂肪酸酯是聚山梨醇酯80。在某些實(shí)施方案中，對(duì)于ClfA和三抗原配制物，所述聚山梨醇酯80為0.20% ±0.041% w/w。在某些實(shí)施方案中，對(duì)于四抗原配制物，所述聚山梨醇酯80為
`0.1% ±0.05% w/w。在其它實(shí)施方案中，所述聚山梨醇酯80濃度為0.01% ±0.005%w/
Vo
[0047]在某些實(shí)施方案中，所述凍干的免疫原性組合物進(jìn)一步包含佐劑。在某些實(shí)施方案中，所述佐劑是ISCOMATRIX?。
[0048]在某些實(shí)施方案中，所述液體組合物的水性稀釋劑是水。在某些實(shí)施方案中，所述水性稀釋劑是低鹽溶液。在某些實(shí)施方案中，所述低鹽溶液包含60mM± IOmM氯化鈉。在某些實(shí)施方案中，所述水性稀釋劑包含聚山梨醇酯80。在某些實(shí)施方案中，所述水性稀釋劑包含佐劑。在某些實(shí)施方案中，所述佐劑是ISCOMATRIX?。
[0049]附圖簡(jiǎn)沭
[0050]圖1示出各種形式重組ClfA多肽的示意圖并公開(kāi)了 SEQ ID NO:125和127-129。
[0051]圖2示出在各種條件下隨著時(shí)間不同批次凍干的ClfA蛋白與其液體對(duì)應(yīng)物相比濃度的改變，以In[C]表示。A組:批號(hào)L36051-37-1和L36051-44。B組:批號(hào)L36051-72。C 組:批號(hào) L36051-81-1。D 組:批號(hào) 36051-81-2。[0052]圖3示出在t = 0的凍干的DS L40184-61與在2_8°C、25°C和37°C貯存3個(gè)月的塊狀物相比的大小排阻層析圖。
[0053]圖4示出對(duì)比凍干的配制物與凍干前的液體ClfA批號(hào)L36051-81-1的大小排阻
層析圖。
[0054]圖5示出凍干的ClfA在不同時(shí)間和溫度條件下的pH(A組)、含水量百分比(B組)和光密度(C組)的柱狀圖，這些是聚集的測(cè)量指標(biāo)。
[0055]圖6示出ClfA的二聚體百分比(A組)、單體百分比(B組)和降解物百分比(裂解)(C組)的柱狀圖，這些是通過(guò)SE-HPLC在室溫?cái)嚢?4小時(shí)后而確定。X-軸示出含有不同濃度聚山梨醇酯80(0.000、0.0100、0.005和0.100% w/w)和蔗糖(3、4.5 和 6% w/w)的配制物。不含有PS80的配制物呈現(xiàn)出在攪拌之后二聚體形成百分比增加(D組)。
[0056]圖7示出ClfA的降解物百分比(裂解)(A組)、二聚體百分比(B組)和單體百分比(C組)的柱狀圖，這些通過(guò)SE-HPLC針對(duì)不同填充劑配制物隨時(shí)間而確定。
[0057]圖8示出在高劑量?jī)龈傻膲K狀物重建之后在不同時(shí)間的ClfA純度(A組)、CP5強(qiáng)度(strength)(抗原性)(B組)和CP8強(qiáng)度(抗原性)。
[0058]圖9示出在低劑量?jī)龈傻膲K狀物重建之后在不同時(shí)間的ClfA純度(A組)，CP5的強(qiáng)度(抗原性)(B組)和CP8的強(qiáng)度(抗原性)。
[0059]圖10示出在室溫重建后0、4和24小時(shí)ClfA的濃度(A組)和純度百分比(B組)及CP5和CP8的濃度(C組)。
[0060]圖11示出在冷凍-解凍循環(huán)1、2和3次后ClfA的濃度(A組)和純度百分比(B組)及CP5和CP8的濃度(C組)。
[0061]圖12示出多個(gè)批次rClfA在ρΗ6.0 (Α組)和7.0 (B組)的圓二色性掃描(CD)。
[0062]圖13示出作為pH函數(shù)的多個(gè)批次rClfA的CD熔解(melts)。
[0063]圖14示出針對(duì)rClfAm和rmClfA的作為pH函數(shù)的固有色氨酸熒光(A組)和ANS熒光(B組)熔解。
[0064]圖15示出針對(duì)rClfAm和rmClfA的作為pH函數(shù)的差示掃描量熱法(DSC)熔解。
[0065]圖16示出作為pH函數(shù)的rmClfA的OD35tl熔解。
[0066]圖17示出針對(duì)在25°C、6周的rmClfA的作為pH函數(shù)的大小排阻-HPLC (A組)及液體rmClfA配制物的pH和OD35tl穩(wěn)定性(B組)
[0067]圖18示出MntC的固有色氨酸熒光熔解(A組)和TmI追蹤(B組)。
[0068]圖19示出作為pH函數(shù)的MntC的DSC熔解的TmI追蹤(A組)以及兩個(gè)主要熱事件的熱分析圖(B和C組)。
[0069]圖20示出作為pH函數(shù)的MntC的OD35tl熔解。
[0070]圖21示出監(jiān)測(cè)穩(wěn)定性的rmClfA(A組)和MntC(B組)的層析圖。
[0071]圖22示出使用RP-HPLC在5°C (A組)和25°C (B組)測(cè)量的rmClfA的穩(wěn)定性結(jié)果及使用IEX-HPLC測(cè)量的在5°C (C組)和25°C (D組)的MntC的穩(wěn)定性結(jié)果。
[0072]圖23示出使用濁度測(cè)定法在不同pH條件下CP5_CRM197在5°C和25 °C (分別為A和C組)及CP8-CRM197在5°C和25 °C (分別為B和D組)的穩(wěn)定性結(jié)果。
[0073]圖24示出使用不同填充劑的搖動(dòng)后的樣品的滲透性(A組)和OD35tl(B組)的測(cè)量。[0074]圖25示出作為填充劑函數(shù)的穩(wěn)定性檢測(cè)，高劑量(A組)和低劑量(B組)凍干的配制物使用RP-HPLC數(shù)據(jù)，MntC質(zhì)量使用IEX-HPLC數(shù)據(jù)(C組)。
[0075]圖26示出所有四種抗原的攪拌后數(shù)據(jù):抗原濃度(A組中rmClfA和MntC ；B組中CP5-CRM197 和 CP8-CRM197)，通過(guò) RP-HPLC 測(cè)量的 rmClfA 和 MntC 純度(B 組)，通過(guò) IEX-HPLC測(cè)量的MntC純度(C組)，pH (D組)和OD350 (E組)。
[0076]圖27示出所有四種抗原的凍干前和凍干后數(shù)據(jù):rmClfA和MntC的RP-HPLC數(shù)據(jù)(A組)，CP5-CRM197 (B組)和CP8-CRM197 (C組)的濁度測(cè)定結(jié)果，使用4.5 %蔗糖(D組)和4%甘露醇/I %蔗糖(E組)的MntC的CEX-HPLC數(shù)據(jù)，DSC數(shù)據(jù)(F組)和rmClfA (G組)及綴合物(H組)的效力百分比。
[0077]圖28示出高劑量和低劑量配制物的重量摩爾滲透壓濃度。
[0078]圖29 示出 MntC (A 組)和 rmClfA (B 組)的 RP-HPLC 純度數(shù)據(jù)，MntC 的 IEX-HPLC純度數(shù)據(jù)(C組)，以及重建后MntC(D組)和rmClfA降解(E組)的動(dòng)力學(xué)。
[0079]圖30示出重建后抗原濃度(A-D組)和pH穩(wěn)定性(E組)。
[0080]圖31示出凍干過(guò)程后抗原濃度(A和B組)和純度(C和D組)的恢復(fù)。
[0081]圖32示出重建后rmClfA (A組)和MntC純度(B組)，rmClfA(C組)和MntC濃度(D組)，CP5-CRM197 (E組)及CP8-CRM197 (F組)濃度以及pH穩(wěn)定性(G組)。
[0082]圖33示出通過(guò)RP-HPLC分析的冷凍-解凍后rmClfA和MntC純度(A組)，通過(guò)IEX-HPLC分析的MntC純度(B組)，抗原濃度(C和D組)及pH穩(wěn)定性(E組)。
[0083]圖34示出通過(guò)RP-HPLC分析的攪拌后rmClfA和MntC純度(A組)，通過(guò)IEX-HPLC分析的MntC純度(B組)，抗原濃度(C和D組)`，pH (E組)和OD350 (F組)。
[0084]圖35示出通過(guò)CEX-HPLC分析的用ISCOMATRIX?重建24小時(shí)后的MntC在2_8°C (A組)和25°C (B組)的降解，通過(guò)CEX-HPLC分析的用ISCOMATRIX?重建的rmClfA的純度(C和D組)，通過(guò)RP-HPLC分析的用ISCOMATRIX?重建的MntC在2_8°C (E組)和25°C (F組)的純度，用 ISCOMATRIX? 重建的在 2-80C (G 組)和 25°C (H 組)的 CP5_CRM197 和 CP8_CRM197綴合物濃度，以及用ISCOMATRIX?重建的在2-8°C (I圖)和25°C (J圖)的rmClfA和MntC濃度。
[0085]圖36示出重建的配制物在2-8 V (A組)和25 V (B組)在24小時(shí)期間的ISCOMATRIX?濃度，ISCOMATRIX?顆粒大小(C組)以及pH穩(wěn)定性(D組)。
[0086]圖37示出通過(guò)RP-HPLC分析的用ISCOMATRIX?重建4小時(shí)后MntC的純度(A組)和脫酰胺化，以及用ISCOMATRIX?重建的抗原濃度(C和D組)。
[0087]圖38示出重建的配制物在4小時(shí)期間ISCOMATRIX?顆粒大小(A組)和pH穩(wěn)定性(B組)。
[0088]圖39A-J示出金黃色葡萄球菌不同菌株之間ClfA的比對(duì)(以出現(xiàn)順序分別為SEQID NO:62、64、68、84、70、104、66、78、86、88、90、72、74、76、80、94、82、92、96、98、100、102、106 和 108)。
[0089]圖40A-1示出金黃色葡萄球菌不同菌株之間的ClfB的比對(duì)(以出現(xiàn)順序分別為SEQ ID NO:26、28、32、18、54、34、36、30、16、20、22、24、38、40、42、44、46、48、50、52、56、58和60)。
[0090]圖41A-C示出金黃色葡萄球菌不同菌株之間的MntC的比對(duì)(以出現(xiàn)順序分別為SEQ ID NO:2、8、10、4、6、14 和 12)。
[0091]圖42示出來(lái)自金黃色葡萄球菌不同菌株的ClfB序列表格。
[0092]圖43示出來(lái)自金黃色葡萄球菌不同菌株的MntC序列表格。
[0093]發(fā)明詳沭
[0094]在描述本發(fā)明的方法和治療方法之前，應(yīng)理解本發(fā)明非限于特定的方法和描述的實(shí)驗(yàn)條件，因?yàn)檫@些方法和條件可以變化。也應(yīng)理解本說(shuō)明書(shū)中使用的術(shù)語(yǔ)只是為了描述特定的實(shí)施方案，無(wú)限制之意。
[0095]盡管在實(shí)施或檢測(cè)本發(fā)明中可使用與本發(fā)明中描述的材料和方法相似或等同的任何方法和材料，但是現(xiàn)在描述優(yōu)選的方法和材料。本文提及的所有出版物均以其全部?jī)?nèi)容援引加入本文。
[0096]本說(shuō)明書(shū)中使用的術(shù)語(yǔ)具有本領(lǐng)域技術(shù)人員認(rèn)可和已知的含義，然而，為方便和完整起見(jiàn)，下文詳細(xì)解釋了特定的術(shù)語(yǔ)及其含義。
[0097]如本說(shuō)明書(shū)和所附權(quán)利要求書(shū)中所用，單數(shù)形式“一個(gè)”和“所述”除非特別指出則還包括其復(fù)數(shù)形式。因此，例如，提及“所述方法”包括一或多種方法，和/或文中描述的類型步驟和/或在本領(lǐng)域技術(shù)人員閱讀本文而顯而易見(jiàn)的等。
[0098]術(shù)語(yǔ)“大約”或者“近似”是指在一個(gè)值的統(tǒng)計(jì)學(xué)有意義的范圍內(nèi)。這個(gè)范圍可以是在給定值或范圍的數(shù) 量級(jí)范圍內(nèi)，典型在20 %以內(nèi)，更典型在10 %以內(nèi)，還更典型在5 %以內(nèi)。術(shù)語(yǔ)“大約”或“近似”涵蓋的容許變化依賴于所研究的特定系統(tǒng)，可易于由本領(lǐng)域技術(shù)人員意識(shí)到。無(wú)論在本說(shuō)明書(shū)中何時(shí)提及范圍時(shí)，所述范圍內(nèi)的每一整數(shù)也涵蓋在本發(fā)明實(shí)施方案中。
[0099]“抗體”是能通過(guò)位于免疫球蛋白分子的可變區(qū)內(nèi)的至少一個(gè)抗原識(shí)別位點(diǎn)特異性結(jié)合靶位如碳水化合物、多核苷酸、脂質(zhì)、多肽等的一種免疫球蛋白分子。如本文所用，除非特別指出，該術(shù)語(yǔ)不僅涵蓋完整的多克隆或單克隆抗體，而且還包含工程化的抗體(如嵌合抗體、人源化抗體和/或?yàn)楦淖冃?yīng)子功能、穩(wěn)定性及其它生物學(xué)活性而衍生化的抗體)及其片段(如Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv)，單鏈抗體(ScFv)及結(jié)構(gòu)域抗體，包括鯊魚(yú)和駱駝源化抗體)，以及包含抗體一部分的融合蛋白，多價(jià)抗體，多特異性抗體(如雙特異性抗體，只要其呈現(xiàn)希望的生物學(xué)活性)以及本文所述的抗體片段，以及免疫球蛋白分子的包含抗原識(shí)別位點(diǎn)的任何其它修飾的構(gòu)型。抗體包括任何類別的抗體，如IgG、IgA或IgM(或其亞類)，所述抗體不需要是任何特定類別。根據(jù)抗體其重鏈恒定結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列，免疫球蛋白可被確定為不同類別。有五種主要類別的免疫球蛋白:IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中一些可進(jìn)一步分為亞類(同種型)，例如在人體中的IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl和IgA2。相應(yīng)于不同類別免疫球蛋白的重鏈恒定結(jié)構(gòu)域分別稱作α、δ、ε、Y和μ。本領(lǐng)域熟知不同類別免疫球蛋白的亞基結(jié)構(gòu)和三維構(gòu)型。
[0100]“抗體片段”僅包含完整抗體的一部分，其中所述部分優(yōu)選保留完整抗體中存在的與該部分正常相關(guān)的至少一種、優(yōu)選大多數(shù)或全部功能。
[0101]術(shù)語(yǔ)“抗原”通常是指生物分子，通常為蛋白、肽、多糖、脂質(zhì)或綴合物，其含有同源抗體可選擇性結(jié)合的至少一個(gè)表位；或者在一些情況中是指免疫原性物質(zhì)，其可刺激動(dòng)物體內(nèi)抗體或T細(xì)胞應(yīng)答或者這二者的產(chǎn)生,包括注射或吸收進(jìn)動(dòng)物體內(nèi)的組合物?？梢葬槍?duì)整個(gè)分子或者針對(duì)分子的一或多個(gè)不同部分(如表位或半抗原)產(chǎn)生免疫應(yīng)答。該術(shù)語(yǔ)可用于指?jìng)€(gè)體分子或者抗原性分子的同質(zhì)或異質(zhì)群?？乖豢贵w、T-細(xì)胞受體或者特異性體液和/或細(xì)胞免疫性的其它元件識(shí)別。術(shù)語(yǔ)“抗原”包括所有相關(guān)的抗原性表位。指定抗原的表位可以使用本領(lǐng)域熟知的任何數(shù)目的表位作圖技術(shù)鑒別。見(jiàn)例如EpitopeMapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol.66(Glenn E.Morris, Ed.,1996) Humana Press, Totowa, N.J.。例如,線性表位可以如下確定:例如在固體支持物上同時(shí)合成大量的相應(yīng)于蛋白分子的一部分的肽，將所述肽與抗體反應(yīng)，而所述肽仍附著在支持物上。這種技術(shù)為本領(lǐng)域已知，在例如美國(guó)專利4，708，871 ；Geysen et al.(1984)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA81:3998-4002 ；Geysen et al.(1986)Molec.Tmmunol.23:709-715 中描述，所有文獻(xiàn)均以其全部?jī)?nèi)容援引加入本文。相似地，構(gòu)象表位可以通過(guò)確定氨基酸的空間構(gòu)象而鑒別，如通過(guò)例如X-線晶體照相術(shù)和二維核磁共振確定。見(jiàn)例如EpitopeMapping Protocols，如上。此外，對(duì)于本發(fā)明目的而言，“抗原”也可以用于是指包括對(duì)天然序列的修飾如缺失、添加和取代(通常性質(zhì)上是保守的，但是其可以是非保守的)的蛋白，只要所述蛋白保留引發(fā)免疫學(xué)應(yīng)答的能力即可。這些修飾可以是有意的，如通過(guò)定向誘變或者通過(guò)特定的合成程序或者通過(guò)遺傳工程方法，或者可以是偶然的，如通過(guò)產(chǎn)生抗原的宿主的突變形成。進(jìn)一步地，抗原可以從微生物如細(xì)菌中衍生、獲得或分離，或者可以是完整生物體。相似地，表達(dá)抗原的寡核苷酸或多核苷酸，如在核酸免疫應(yīng)用中，也包含在這個(gè)定義中。也包括合成的抗原，例如多表位、側(cè)翼表位(flanking epitope)及其它重組或合成衍生的抗原(Bergmann et al.(1993)Eur.J.1mmunol.23:27772781 ；Bergmann etal.(1996)J.1mmunol.157:32423249 ；Suhrbier, A.(1997)Immunol, and Cell Biol.75:402408 ；Gardner et al.(1998)12th World AIDS Conference, Geneva, Switzerland,Jun.28-Jul.3,1998)。
[0102]術(shù)語(yǔ)“佐劑”是指增強(qiáng)對(duì)抗原的免疫應(yīng)答的化合物或混合物，如在本文中進(jìn)一步描述和例證。
[0103]“菌血癥”是細(xì)菌在血液中的短暫存在。菌血癥可以進(jìn)展為敗血病或者膿毒癥，其被認(rèn)為是感染，是細(xì)菌在血液中長(zhǎng)期存在，具有相關(guān)的臨床跡象/癥狀。不是所有細(xì)菌均能在血液中存活。具有特殊遺傳性狀的那些細(xì)菌才具有此能力。此外，宿主因素也發(fā)揮重要作用。
[0104]“莢膜多糖”是指在大多數(shù)葡萄球菌分離株細(xì)胞壁的外面的多糖莢膜。例如，金黃色葡萄球菌包含由肽聚糖復(fù)合物組成的細(xì)胞壁成分，其使得生物體能在不利的滲透條件下存活，其也包含與肽聚糖連接的獨(dú)特的磷壁酸。在細(xì)胞壁的外面，一層薄的多糖莢膜包被大多數(shù)金黃色葡萄球菌分離株。這種血清學(xué)獨(dú)特的莢膜可用于對(duì)各種金黃色葡萄球菌分離株確定血清型。許多臨床有意義的分離株已經(jīng)示出包括兩種莢膜類型:血清型5(CP5)和血清型 8 (CP8)。
[0105]如本文所用，“綴合物”包含通常在希望的分子量范圍的莢膜多糖和載體蛋白，其中所述莢膜多糖與所述載體蛋白綴合。綴合物可包含或不包含一定量的游離莢膜多糖。如本文所用，“游離的莢膜多糖”是指與綴合的莢膜多糖-載體蛋白不共價(jià)關(guān)聯(lián)(即不與其共價(jià)結(jié)合、不附著或不與其包載或包載于其中)的莢膜多糖。術(shù)語(yǔ)“游離莢膜多糖”、“游離多糖”和“游離糖”可互換使用，表達(dá)相同的含義。無(wú)論載體分子的性質(zhì)如何，其可以與莢膜多糖直接綴合或者通過(guò)接頭間接綴合。如本文所用，“綴合”是指細(xì)菌莢膜多糖與載體分子共價(jià)附著的過(guò)程。綴合增強(qiáng)細(xì)菌莢膜多糖的免疫原性。所述綴合可以根據(jù)下文所述方法或者通過(guò)本領(lǐng)域已知的方法進(jìn)行。
[0106]如上文所述，本發(fā)明涉及包含與載體蛋白綴合的金黃色葡萄球菌血清型5莢膜多糖(CP5)的綴合物，以及包含與載體蛋白綴合的金黃色葡萄球菌血清型8莢膜多糖(CP8)的綴合物。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案提供了包含與載體蛋白綴合的金黃色葡萄球菌血清型5莢膜多糖以及與載體蛋白綴合的金黃色葡萄球菌血清型8莢膜多糖的綴合物，其中:5型莢膜多糖的分子量在50kDa-800kDa之間，8型莢膜多糖的分子量在50_700kDa之間；所述免疫原性綴合物的分子量在大約1000kDa-大約5000kDa之間；所述綴合物包含相對(duì)于總多糖低于大約30%的游離多糖。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述綴合物包含相對(duì)于總多糖低于大約25%、大約20%、大約15%、大約10%或者大約5%游離多糖。在一個(gè)實(shí)施方案中，5型或8型多糖的分子量在大約20kDa-大約1000kDa之間，在大約50kDa_大約500kDa之間，在大約50kDa-大約200kDa之間，在大約75kDa_大約150kDa之間。
[0107]在一個(gè)實(shí)施方案中，綴合物的分子量在大約50kDa_大約5000kDa之間。在一個(gè)實(shí)施方案中，綴合物的分子量在大約200kDa-大約5000kDa之間。在一個(gè)實(shí)施方案中，免疫原性綴合物的分子量在大約400kDa-大約2500kDa之間。在一個(gè)實(shí)施方案中，免疫原性綴合物的分子量在大約500kDa-大約2500kDa之間。在一個(gè)實(shí)施方案中，免疫原性綴合物的分子量在大約600kDa-大約2800kDa之間。在一個(gè)實(shí)施方案中，免疫原性綴合物的分子量在大約700kDa-大約2700kDa之間。在一個(gè)實(shí)施方案中，免疫原性綴合物的分子量在大約1000kDa-大約2000kDa之間、大約1800kDa_大約2500kDa之間、大約I IOOkDa-大約2200kDa之間、大約1900kDa_大約2700kDa之間、大約1200kDa_大約2400kDa之間、大約1700kDa-大約2600kDa之間、大約1300kDa_大約2600kDa之間、大約1600kDa_大約3000kDa 之間。
[0108]因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的免疫原性綴合物中的載體蛋白是CRM197,所述CRM197與莢膜多糖通過(guò)氨基甲酸酯鍵、酰胺鍵或者這二者共價(jià)連接。載體蛋白中與莢膜多糖綴合的賴氨酸殘基的數(shù)目可以被描述為`綴合的賴氨酸的范圍。例如在給出的免疫原性組合物中，CRM197可包含在39個(gè)賴氨酸中有5-15個(gè)賴氨酸與莢膜多糖共價(jià)連接。表示這個(gè)參數(shù)的另一方式是12% -40%的CRM197的賴氨酸與莢膜多糖共價(jià)連接。在一些實(shí)施方案中，與CRM197共價(jià)結(jié)合的多糖的CRM197部分包含5-25個(gè)與該多糖共價(jià)連接的賴氨酸。在一些實(shí)施方案中，與CRM197共價(jià)結(jié)合的多糖的CRM197部分包含5-20個(gè)與該多糖共價(jià)連接的賴氨酸。在一些實(shí)施方案中，與載體蛋白共價(jià)結(jié)合的多糖的CRM197部分包含10-25個(gè)與該多糖共價(jià)連接的賴氨酸。在一些實(shí)施方案中，與載體蛋白共價(jià)結(jié)合的多糖的CRM197部分包含8-15個(gè)與該多糖共價(jià)連接的賴氨酸。例如，在給出的免疫原性組合物中，CRM197可包含在39個(gè)賴氨酸中有18-22個(gè)賴氨酸與莢膜多糖共價(jià)連接。表示這個(gè)參數(shù)的另一方式是40% -60%的CRM197賴氨酸與莢膜多糖共價(jià)連接。在一些實(shí)施方案中，所述CRM197包含在39個(gè)賴氨酸中有5-15個(gè)賴氨酸與CP8共價(jià)連接。表示這個(gè)參數(shù)的另一方式是12% -40%的CRM197賴氨酸與CP8共價(jià)連接。在一些實(shí)施方案中，CRM197包含在39個(gè)賴氨酸中有18-22個(gè)賴氨酸與CP5共價(jià)連接。表示這個(gè)參數(shù)的另一方式是40% -60%的CRM197賴氨酸與CP5共價(jià)連接。
[0109]如上所述，與莢膜多糖綴合的載體蛋白中賴氨酸殘基的數(shù)目可以被描述為綴合的賴氨酸的范圍，其可以表示為摩爾比率。例如，在CP8免疫原性綴合物中綴合的賴氨酸與CRM197的摩爾比率可以是在大約18:1-大約22:1之間。在一個(gè)實(shí)施方案中，CP8免疫原性綴合物中綴合的賴氨酸與CRM197的摩爾比率范圍可以在大約15:1-大約25:1之間。在一些實(shí)施方案中，CP8免疫原性綴合物中綴合的賴氨酸與CRM197的摩爾比率范圍可以在大約
14:1_大約20:1之間、大約12:1_大約18:1、大約10:1_大約16:1、大約8:1_大約14:1、大約6:1-大約12:1、大約4:1_大約10:1、大約20:1_大約26:1、大約22:1_大約28:1、大約24:1-大約30:1、大約26:1-大約32:1、大約28:1_大約34:1、大約30:1_大約36:
1、大約5:1-大約10:1、大約5:1-大約20:1、大約10:1_大約20:1，或者大約10:1_大約30:1。CP5免疫原性綴合物中綴合的賴氨酸與CRM197的摩爾比率也可以在大約3:1_25:I之間。在一個(gè)實(shí)施方案中，CP5免疫原性綴合物中綴合的賴氨酸與CRM197的摩爾比率范圍可以在大約5:1-大約20:1之間。在一個(gè)實(shí)施方案中，CP5免疫原性綴合物中綴合的賴氨酸與CRM197的摩爾比率范圍可以在大約4:1-大約20:1之間，大約6:1_大約20:1、大約7:1-大約20:1、大約8:1-大約20:1、大約10:1_大約20:1、大約11:1_大約20:1、大約12:1-大約20:1、大約13:1-大約20:1、大約14:1_大約20:1、大約15:1_大約20:1、大約16:1-大約20:1、大約17:1-大約20:1、大約18:1_大約20:1、大約5:1_大約18:1、大約7:1-大約16:1，或者大約9:1-大約14:1。
[0110]表示與莢膜多糖綴合的載體蛋白中的賴氨酸殘基數(shù)目的另一方式可以是綴合的賴氨酸范圍。例如，在給出的CP8免疫原性綴合物中，CRM197可包含在39個(gè)賴氨酸中有5-15個(gè)賴氨酸與莢膜多糖共價(jià)連接。或者，這個(gè)參數(shù)可以百分?jǐn)?shù)表示。例如，在給定的CP8免疫原性綴合物中，綴合的賴氨酸的百分比可以在10% -50%之間。在一些實(shí)施方案中，20% -50%的賴氨酸可以與CP8共價(jià)連接?；蛘撸?0% -50%的CRM197賴氨酸可以與CP8共價(jià)連接，10% -40%的CRM197賴氨酸、10% -30%的CRM197賴氨酸、20% -40%的CRM197賴氨酸、25% -40% 的 CRM197 賴氨酸、30% -40 % 的 CRM197 賴氨酸、10% -30 % 的 CRM197 賴氨酸、15% -30% 的 CRM197 賴氨酸、20% -30 % 的 CRM197 賴氨酸、25 % -30 % 的 CRM197 賴氨酸、10% -15%的CRM197賴氨酸，或者10% -12%的CRM197賴氨酸與CP8共價(jià)連接。在給定的CP5免疫原性綴合物中，CRM197可包含在39個(gè)賴氨酸中有18-22個(gè)賴氨酸與莢膜多糖共價(jià)連接。或者，這個(gè)參數(shù)可以百分?jǐn)?shù)表示。例如，在給定的CP5免疫原性綴合物中，綴合的賴氨酸的百分比可以在40% -60%之間`。在一些實(shí)施方案中，40% -60%的賴氨酸可以與CP5共價(jià)連接?；蛘?，30 % -50 %的CRM197賴氨酸可以與CP5共價(jià)連接，20 % -40 %的CRM197賴氨酸、10% -30%的CRM197賴氨酸、50% -70%的CRM197賴氨酸、35% -65%的CRM197賴氨酸、30% -60% 的 CRM197 賴氨酸、25% -55 % 的 CRM197 賴氨酸、20 % -50 % 的 CRM197 賴氨酸、
15% -45 %的CRM197賴氨酸、10 % -40 %的CRM197賴氨酸、40 % -70 %的CRM197賴氨酸或者45% -75%的CRM197賴氨酸與CP5共價(jià)連接。
[0111]莢膜多糖鏈與載體分子上賴氨酸的附著頻率是鑒定莢膜多糖綴合物的另一參數(shù)。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，莢膜多糖的至少每5-10個(gè)糖重復(fù)單位存在至少一個(gè)CRM197與多糖之間的共價(jià)連接。在另一實(shí)施方案中，莢膜多糖的每5-10個(gè)糖重復(fù)單位存在至少一個(gè)CRM197與莢膜多糖之間的共價(jià)連接，每2-7個(gè)糖重復(fù)單位、每3-8個(gè)糖重復(fù)單位、每4-9個(gè)糖重復(fù)單位、每6-11個(gè)糖重復(fù)單位、每7-12個(gè)糖重復(fù)單位、每8-13個(gè)糖重復(fù)單位、每9_14個(gè)糖重復(fù)單位、每10-15個(gè)糖重復(fù)單位、每2-6個(gè)糖重復(fù)單位、每3-7個(gè)糖重復(fù)單位、每4-8個(gè)糖重復(fù)單位、每6-10個(gè)糖重復(fù)單位、每7-11個(gè)糖重復(fù)單位、每8-12個(gè)糖重復(fù)單位、每9-13個(gè)糖重復(fù)單位、每10-14個(gè)糖重復(fù)單位、每10-20個(gè)糖重復(fù)單位、每5-10個(gè)糖重復(fù)單位存在至少一個(gè)CRM197與莢膜多糖之間的共價(jià)鍵。在另一實(shí)施方案中，在莢膜多糖的每2、3、4、5、
6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19 或 20 個(gè)糖重復(fù)單位存在至少一個(gè) CRM197 與莢膜多糖之間的連接。
[0112]多糖的化學(xué)激活及隨后與載體蛋白的綴合可以通過(guò)常規(guī)方式實(shí)現(xiàn)。見(jiàn)例如美國(guó)專利4，673，574和4，902，506所述?？闪硗馐褂闷渌せ詈途Y合方法。
[0113]如本文所用，“載體蛋白”或者“蛋白載體”是指可以與針對(duì)其產(chǎn)生希望的免疫應(yīng)答的抗原(如莢膜多糖)綴合的任何蛋白分子?？乖缍嗵桥c載體蛋白的綴合可以使得所述抗原成為免疫原性的。載體蛋白優(yōu)選是無(wú)毒性及無(wú)反應(yīng)原性的，且可以以足夠量和純度獲得。舉例的載體蛋白是來(lái)自破傷風(fēng)、白喉、百日咳、假單胞菌屬、大腸桿菌、葡萄球菌屬和鏈球菌屬的毒素、類毒素或者毒素的任何突變的交叉反應(yīng)性材料(CRM197)。載體蛋白應(yīng)適合標(biāo)準(zhǔn)綴合方法。在本發(fā)明的特定實(shí)施方案中，CRM197用作載體蛋白。
[0114]CRM197(Wyeth/Pfizer, Sanford, NC)是分離自在基于酪蛋白氨基酸和酵母提取物的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的白喉?xiàng)U菌(Corynebacterium diphtheria)菌株C7(@197)的培養(yǎng)物的白喉毒素的一種無(wú)毒性變體(即類毒素)。CRM197通過(guò)超濾、硫酸銨沉淀及離子交換層析而純化。產(chǎn)生CRM197蛋白的白喉?xiàng)U菌菌株C7(197)的培養(yǎng)物保藏在美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type Culture Collection,Rockville,Maryland),保藏號(hào)為 ATCC53281。其它白喉類毒素也適合用作載體蛋白。
[0115]其它合適的載體 蛋白包括失活的細(xì)菌毒素如破傷風(fēng)類毒素、百日咳類毒素、霍亂類毒素(如國(guó)際專利申請(qǐng)W02004/083251所述)、大腸桿菌LT、大腸桿菌ST以及來(lái)自的綠膿假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的外毒素A。也可以使用細(xì)菌外膜蛋白如外膜蛋白復(fù)合物c (OMPC)、孔蛋白、運(yùn)鐵蛋白結(jié)合蛋白、肺炎球菌溶血素、肺炎球菌表面蛋白A (PspA)、肺炎球菌粘附蛋白(PsaA)、艱難梭菌(C.difficile)腸毒素(毒素A)和細(xì)胞毒素(毒素B)或者流感嗜血桿菌蛋白D。其它蛋白如鏈球菌C5a肽酶(SCP)、卵清蛋白、鑰孔嘁血藍(lán)蛋白(KLH)、牛血清白蛋白(BSA)或者結(jié)核菌素純蛋白衍生物(PPD)也可以用作載體蛋白。
[0116]在莢膜多糖與載體蛋白綴合后，所述多糖-蛋白綴合物通過(guò)各種技術(shù)而純化(關(guān)于多糖-蛋白綴合物的量的富集)。這些技術(shù)包括例如濃縮/滲濾、沉淀/洗脫、柱層析及深度過(guò)濾。見(jiàn)下文實(shí)施例所述。
[0117]在純化各個(gè)綴合物之后，可以將其組合以配制本發(fā)明的免疫原性組合物，其可用于例如疫苗中。本發(fā)明的免疫原性組合物的配制可以使用本領(lǐng)域認(rèn)可的方法完成。
[0118]注意在本說(shuō)明書(shū)中，如“包含”、“含有”等術(shù)語(yǔ)可具有美國(guó)專利法中認(rèn)可的含義；如其可意味著“包括”等。這種術(shù)語(yǔ)是指包含一特定成分或一系列成分，但不排除任何其它成分。術(shù)語(yǔ)“基本上由…組成”具有美國(guó)專利法認(rèn)為屬于其的含義，如其允許包含未損害本發(fā)明的新的或基本特征的其它成分或步驟，即其排除損害本發(fā)明的新的或基本特征的其它未列舉的成分或步驟，以及其排除現(xiàn)有技術(shù)如本文提及的或者援引加入本文的文獻(xiàn)中的成分或步驟，特別其是這個(gè)文獻(xiàn)的目的以限定可專利的實(shí)施方案，如相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)如本文提及的或援引加入本文的文獻(xiàn)是新的、非顯而易見(jiàn)的、有創(chuàng)造性的。術(shù)語(yǔ)“由…組成”具有美國(guó)專利法認(rèn)為屬于其的含義，即這些術(shù)語(yǔ)是封閉式的。因此，這些術(shù)語(yǔ)是指包含一個(gè)特定成分或者一系列成分，及排除所有其它成分。[0119]“保守氨基酸取代”是指蛋白的一或多個(gè)氨基酸殘基用具有相似物理和/或化學(xué)性質(zhì)的其它氨基酸殘基取代。序列內(nèi)的氨基酸取代可以選自所述氨基酸所屬類別的其它成員。例如，非極性(疏水性)氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸。含有芳環(huán)結(jié)構(gòu)的氨基酸是苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸。極性中性氨基酸包括甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺。正電荷的(堿性)氨基酸包括精氨酸、賴氨酸和組氨酸。負(fù)電荷的(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。這種改變預(yù)期不影響如通過(guò)聚丙烯酰胺凝膠電泳或者等電點(diǎn)確定的表觀分子量。特別優(yōu)選的取代是:Lys取代Arg,反之亦然，由此可以保持正電荷；Glu取代Asp,反之亦然，由此可以保持負(fù)電荷；Ser取代Thr，由此可以保持游離_0H ;Gin取代Asn，由此可以保持游離NH2。
[0120]“片段”是指僅包含較大蛋白的特異性結(jié)構(gòu)域的蛋白。例如，如果包括信號(hào)序列，ClfA和ClfB蛋白各含有多如8個(gè)結(jié)構(gòu)域。相應(yīng)于N1N2N3、N2N3、N1N2、N1、N2或N3結(jié)構(gòu)域的多肽均被認(rèn)為是ClfA或ClfB的片段。“片段”也是指包含這樣的氨基酸序列的蛋白或多肽，所述氨基酸序列具有親代蛋白或多肽的氨基酸序列的至少4個(gè)氨基酸殘基(優(yōu)選至少10個(gè)氨基酸殘基、至少15個(gè)氨基酸殘基、至少20個(gè)氨基酸殘基、至少25個(gè)氨基酸殘基、至少40個(gè)氨基酸殘基、至少50個(gè)氨基酸殘基、至少60氨基酸殘基、至少70個(gè)氨基酸殘基、至少80個(gè)氨基酸殘基、至少90個(gè)氨基酸殘基、至少100個(gè)氨基酸殘基、至少125個(gè)氨基酸殘基或者至少150個(gè)氨基酸殘基)，或者是指包含這樣的核苷酸序列的核酸，所述核苷酸序列具有親代核酸的核苷酸序列的至少10個(gè)堿基對(duì)(優(yōu)選至少20個(gè)堿基對(duì)、至少30個(gè)堿基對(duì)、至少40個(gè)堿基對(duì)、至少50個(gè)堿基對(duì)、至少50個(gè)堿基對(duì)、至少100個(gè)堿基對(duì)、至少200個(gè)喊基對(duì))。
[0121 ] 如本文所用，抗體的“功能活性”或者“功能性抗體”是指這樣的抗體，其最低限度能特異性結(jié)合抗原。其它功能為本領(lǐng)域已知，可包括如通過(guò)調(diào)理作用、ADCC或者補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞毒性實(shí)現(xiàn)病原體的清 除或殺滅的免疫性系統(tǒng)的其它成分。在抗原結(jié)合之后，任何隨后的抗體功能均可通過(guò)抗體的Fe區(qū)介導(dǎo)?？贵w調(diào)理吞噬試驗(yàn)(OPA)是一種體外測(cè)定，設(shè)計(jì)為測(cè)量在體外Ig補(bǔ)體輔助的效應(yīng)細(xì)胞(白細(xì)胞)的細(xì)菌殺滅作用，因此模擬生物學(xué)過(guò)程?？贵w結(jié)合也可以直接抑制其結(jié)合的抗原的生物學(xué)功能，如結(jié)合ClfA的抗體可中和其酶功能。在一些實(shí)施方案中，“功能性抗體”是指通過(guò)在動(dòng)物效力模型中或者調(diào)理吞噬殺滅測(cè)定中通過(guò)殺滅細(xì)菌測(cè)量的證實(shí)其殺滅細(xì)菌而發(fā)揮功能的抗體。
[0122]金黃色葡萄球菌莢膜多糖的分子量在用于免疫原性組合物中是一個(gè)考慮因素。例如，高分子量的莢膜多糖由于抗原性表面上存在的表位的較高化合價(jià)而能誘導(dǎo)某些抗體免疫應(yīng)答?！案叻肿恿壳v膜多糖”的分離預(yù)期用于本發(fā)明的組合物和方法中。例如，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，預(yù)期分子量大小在大約50-大約800kDa范圍的5型高分子量多糖的分離。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，預(yù)期分子量大小在大約20-大約1000kDa范圍的5型高分子量多糖的分離。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，預(yù)期分子量大小在大約50-大約300kDa范圍的5型高分子量莢膜多糖的分離和純化。在一個(gè)實(shí)施方案中，預(yù)期分子量在70-300kDa范圍的5型高分子量莢膜多糖的分離和純化。在一個(gè)實(shí)施方案中，預(yù)期分子量在90-250kDa范圍的5型高分子量莢膜多糖的分離和純化。在一個(gè)實(shí)施方案中，預(yù)期分子量在90-150kDa范圍的5型高分子量莢膜多糖的分離和純化。在一個(gè)實(shí)施方案中，預(yù)期分子量在90-140kDa范圍的5型高分子量莢膜多糖的分離和純化。在一個(gè)實(shí)施方案中，預(yù)期分子量在80-120kDa范圍的5型高分子量莢膜多糖的分離和純化。可以通過(guò)本發(fā)明的方法分離和純化的其它范圍的高分子量血清型5莢膜多糖包括分子量大小范圍在大約70kDa-大約 lOOkDa、70kDa-llOkDa、70kDa_120kDa、70kDa_130kDa、70kDa_140kDa、70kDa_150kDa、70kDa-160kDa、80kDa-110kDa、80kDa-120kDa、80kDa-130kDa、80kDa-140kDa、80kDa-150kDa、80kDa-160kDa、90kDa-110kDa、90kDa-120kDa、90kDa-130kDa、90kDa-140kDa>90kDa~l50kDa>90kDa-160kDa>IOOkDa-120kDa>IOOkDa-13OkDa>100kDa-140kDa、100kDa-150kDa、100kDa-160kDa 及相似的希望的分子量范圍。
[0123]如上所述，金黃色葡萄球菌莢膜多糖的分子量是用于免疫原性組合物中的一個(gè)考慮因素。例如，高分子量莢膜多糖由于在抗原性表面上存在的表位的較高化合價(jià)而能誘導(dǎo)某些抗體免疫應(yīng)答。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，預(yù)期分子量范圍在大約20kDa_大約1000kDa的8型高分子量莢膜多糖的分離和純化。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，預(yù)期分子量范圍在大約50kDa-大約700kDa的8型高分子量莢膜多糖的分離和純化。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，預(yù)期分子量范圍在50kDa-300kDa的8型高分子量莢膜多糖的分離和純化。在一個(gè)實(shí)施方案中，預(yù)期分子量范圍在70kDa-300kDa的8型高分子量莢膜多糖的分離和純化。在一個(gè)實(shí)施方案中，預(yù)期分子量范圍在90kDa-250kDa的8型高分子量莢膜多糖的分離和純化。在一個(gè)實(shí)施方案中，預(yù)期分子量范圍在90kDa-150kDa的8型高分子量莢膜多糖的分離和純化。在一個(gè)實(shí)施方案中，預(yù)期分子量范圍在90kDa-120kDa的8型高分子量莢膜多糖的分離和純化。在一個(gè)實(shí)施方案中，預(yù)期分子量范圍在80kDa-120kDa的8型高分子量莢膜多糖的分離和純化?？梢酝ㄟ^(guò)本發(fā)明的方法分離和純化的其它范圍的高分子量血清型8莢膜多糖包括分子量大小范圍在大約70kDa-大約lOOkDa、70kDa-llOkDa、70kDa-120kDa、70kDa-130kDa、70kDa-140kDa、70kDa-150kDa、70kDa-160kDa、80kDa-110kDa、80kDa-120kDa、80kDa-130kDa、80kDa-140kDa、80kDa-150kDa、80kDa-160kDa、90kDa-110kDa、90kDa-120kDa、90kDa-130kDa、90kDa-140kDa、90kDa-150kDa、90kDa_160kDa、100kDa_120kDa、100kDa_130kDa、100kDa_140kDa、100kDa_150kDa、100kDa-160kDa及相似的希望的分子量范圍。
[0124]對(duì)免疫原性組合物的“免疫應(yīng)`答”是對(duì)感興趣的組合物中存在的分子(例如抗原，如蛋白或多糖)在對(duì)象中產(chǎn)生的體液和/或細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。對(duì)于本發(fā)明的目的，“體液免疫應(yīng)答”是抗體介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，包括產(chǎn)生對(duì)本發(fā)明的免疫原性組合物中存在的抗原具有親和性的抗體，而“細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答”是由T淋巴細(xì)胞和/或其它白細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答?！凹?xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答”是由與主要組織相容性復(fù)合物(MHC) I類或II類分子相關(guān)的抗原性表位的呈遞引發(fā)的。這激活了抗原特異性CD4+T輔助細(xì)胞或CDS+細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)。CTL對(duì)于與主要組織相容性復(fù)合物(MHC)或CDl編碼的在細(xì)胞表面表達(dá)的蛋白相關(guān)的呈遞的肽或脂質(zhì)抗原具有特異性。CTL幫助誘導(dǎo)和促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)微生物的細(xì)胞內(nèi)破壞或者這種微生物感染的細(xì)胞的裂解。細(xì)胞免疫性的另一方面包括輔助T細(xì)胞的抗原特異性應(yīng)答。輔助T細(xì)胞幫助刺激非特異性效應(yīng)細(xì)胞針對(duì)在表面上展示與經(jīng)典或非經(jīng)典MHC分子相關(guān)的肽抗原的細(xì)胞的功能并且關(guān)注其活性。“細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答”也是指由激活的T細(xì)胞和/或其它白細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子、趨化因子及其它這種分子的產(chǎn)生，包括衍生自CD4+和CDS+T-細(xì)胞的那些分子。特定抗原或組合物刺激細(xì)胞介導(dǎo)的免疫學(xué)應(yīng)答的能力可以通過(guò)許多測(cè)定法確定，如通過(guò)淋巴增殖(淋巴細(xì)胞激活)測(cè)定，CTL細(xì)胞毒性細(xì)胞測(cè)定，測(cè)定敏化對(duì)象中特異于抗原的T-淋巴細(xì)胞，或者測(cè)量應(yīng)答抗原再刺激的T細(xì)胞的細(xì)胞因子產(chǎn)生。這種測(cè)定為本領(lǐng)域熟知。見(jiàn)例如Erickson et al., J.1mmunol.(1993) 151:4189-4199 ；Doe et al.，Eur.J.TmmunO1.(1994)24:2369_2376。
[0125]術(shù)語(yǔ)“免疫原性”是指抗原或疫苗引發(fā)體液或者細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答或者這兩種免疫應(yīng)答的能力。
[0126]“免疫原性量”或者“免疫學(xué)有效量”或者“劑量”在本文可互換使用，通常是指足以引發(fā)細(xì)胞(T細(xì)胞)或體液(B細(xì)胞或抗體)免疫應(yīng)答或者這兩種應(yīng)答的抗原或免疫原性組合物的量，所述的量通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定法測(cè)量。
[0127]組合物中特定綴合物的量通?；趯?duì)于該綴合物而言是綴合的及非綴合的總多糖計(jì)算。例如，具有20%游離多糖的CP5綴合物是在IOOmcg CP5多糖劑量中具有大約80mcg綴合的CP5多糖和大約20mcg非綴合的CP5多糖。當(dāng)計(jì)算綴合物的劑量時(shí)通常不考慮產(chǎn)生綴合物的蛋白。綴合物的量可以根據(jù)葡萄球菌血清型而變化。通常，每劑量包含0.01-1OOmcg多糖,特別是0.1-1Omcg,更特別是Ι-lOmcg。所述免疫原性組合物中不同多糖成分的“免疫原性量”可以是不同的，每種可包含0.01mcg、0.lmcg、0.25mcg、0.5mcg、lmcg、2mcg、3mcg、4mcg、5mcg、6mcg、7mcg、8mcg、9mcg、lOmcg、15mcg、20mcg、30mcg、40mcg、50mcg、60mcg、70mcg、80mcg、90mcg或者大約IOOmcg任何特定多糖抗原。
[0128]在另一實(shí)施方案中，免疫原性組合物中蛋白成分的“免疫原性量”的范圍可以是大約IOmcg-大約300mcg每種蛋白抗原。在特定的實(shí)施方案中，免疫原性組合物中蛋白成分的“免疫原性量”的范圍可以是大約20mcg-大約200mcg每種蛋白抗原。免疫原性組合物中不同蛋白成分的“免疫原性量”可以不同，每種可包含lOmcg、20mcg、30mcg、40mcg、50mcg、60mcg、70mcg、80mcg、90mcg、lOOmcg、125mcg、150mcg> 175mcg 或大約 200mcg 任何特定蛋白抗原。
[0129]可以通過(guò)測(cè)量血清中特異于抗原的循環(huán)抗體的水平測(cè)量B細(xì)胞活性水平而測(cè)定作為免疫原的抗原的效力進(jìn)行，使用免疫測(cè)定、免疫沉淀測(cè)定、功能性抗體測(cè)定如體外調(diào)理作用測(cè)定及本領(lǐng)域已知的一些其它測(cè)定進(jìn)行。作為T(mén)細(xì)胞免疫原的抗原的效力的另一種測(cè)定法可以通過(guò)增殖測(cè)定、細(xì)胞裂解測(cè)定如鉻釋放測(cè)定以測(cè)量T細(xì)胞裂解其特異性靶細(xì)胞的能力進(jìn)行測(cè)定。此外，在本發(fā)明中，“免疫原性量”也可以通過(guò)測(cè)量施用抗原后誘導(dǎo)的抗原特異性抗體的血清水平或者通過(guò)測(cè)量由此誘導(dǎo)的抗體增強(qiáng)特定白細(xì)胞的調(diào)理吞噬作用能力的能力而定義，如本文所述。免疫應(yīng)答的保護(hù)作用水平可以通過(guò)用已經(jīng)注射的抗原攻擊免疫的宿主進(jìn)行測(cè)量。例如，如果希望對(duì)其產(chǎn)生免疫應(yīng)答的抗原是細(xì)菌，則由所述抗原的“免疫原性量”誘導(dǎo)的保護(hù)作用水平可以通過(guò)檢測(cè)用所述細(xì)菌細(xì)胞攻擊動(dòng)物后的存活率百分比或死亡率百分比而測(cè)量。在一個(gè)實(shí)施方案中，保護(hù)作用的量可以通過(guò)測(cè)量與細(xì)菌感染相關(guān)的至少一個(gè)癥狀而測(cè)定，例如與感染相關(guān)的發(fā)熱癥狀。多抗原或多成分疫苗或免疫原性組合物中每種抗原的量隨著每種其它成分而變化，這可以通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法確定。這種方法包括例如測(cè)量免疫原性和/或體內(nèi)效力的方法。
[0130]術(shù)語(yǔ)“免疫原性組合物”涉及含有抗原如微生物或其成分的任何藥物組合物，所述組合物可用于在對(duì)象體內(nèi)引發(fā)免疫應(yīng)答。本發(fā)明的免疫原性組合物可通過(guò)全身性經(jīng)皮或粘膜途徑施用所述免疫原性組合物而用于治療易患金黃色葡萄球菌感染的人。這些施用可包括通過(guò)肌肉(1.m.)、腹膜內(nèi)(1.p.)、皮內(nèi)(1.d.)或者皮下途徑注射；通過(guò)貼劑或者其它經(jīng)皮輸送裝置應(yīng)用；或者通過(guò)粘膜施用至口腔/食管、呼吸道或泌尿生殖道。在一個(gè)實(shí)施方案中，鼻內(nèi)施用用于治療或預(yù)防金黃色葡萄球菌的鼻咽部運(yùn)送(carriage)，因此減弱在最早期的感染。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述免疫原性組合物可用于準(zhǔn)備用于被動(dòng)保護(hù)或治療動(dòng)物的疫苗或引發(fā)多克隆或單克隆抗體。
[0131]特定免疫原性組合物的成分的最佳量可以通過(guò)包括觀測(cè)對(duì)象體內(nèi)適當(dāng)?shù)拿庖邞?yīng)答的標(biāo)準(zhǔn)研究確定。在最初的免疫接種之后，對(duì)象可接受足夠間隔的一或幾次強(qiáng)化免疫。
[0132]在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，金黃色葡萄球菌凍干的免疫原性組合物包含重組金黃色葡萄球菌聚集因子A(ClfA)片段(N1N2N3或其組合)。在本發(fā)明的進(jìn)一步的實(shí)施方案中，金黃色葡萄球菌凍干的免疫原性組合物包含重組金黃色葡萄球菌聚集因子A(ClfA)片段、與CRM197綴合的分離的5型莢膜多糖及與CRM197綴合的分離的8型莢膜多糖。
[0133]本發(fā)明的免疫原性組合物可進(jìn)一步包含一或多個(gè)另外的“免疫調(diào)節(jié)劑”，其是擾動(dòng)或改變免疫系統(tǒng)的物質(zhì)，由此觀測(cè)到體液和/或細(xì)胞介導(dǎo)的免疫性的上調(diào)或下調(diào)。在一個(gè)特定的實(shí)施方案中，優(yōu)選免疫系統(tǒng)的體液和/或細(xì)胞介導(dǎo)臂(arm)上調(diào)。某些免疫調(diào)節(jié)劑的實(shí)例包括例如佐劑或細(xì)胞因子，或者在美國(guó)專利5，254，339中描述的ISCOMATRIX?(CSLLimited, Parkville, Australia)等?？捎糜诒景l(fā)明疫苗中的佐劑的非限制性實(shí)例包括RIBI佐劑系統(tǒng)(Ribi Inc., Hamilton, Mont.),明帆,礦物質(zhì)凝膠如氫氧化招凝膠，水包油乳狀液，水包油乳狀液如氟氏完全和不完全佐劑，嵌段共聚物(CytRx, Atlanta Ga.),QS-21 (Cambridge Biotech Inc.,Cambridge Mass.),SAF-M(Chiron,EmeryviIIe Calif.),
AMPHIGEN?.佐劑,阜苷,QuiI A或其它皂苷級(jí)分，單磷酸脂質(zhì)A，及Avridine脂質(zhì)-胺佐劑?？捎糜诒景l(fā)明疫苗中的水包油乳狀液的非限制性實(shí)例包括修飾的SEAM62和SEAM1/2配制物。修飾的SEAM62是水包油乳狀液，含有5% (v/v)鯊烯(Sigma)、1% (v/v) SPAN?85 去污劑(ICI Surfactants) >0.7 % (v/v)聚山梨醇酯 80 去污劑(ICI Surfactants) >
2.5 % (v/v)乙醇、200 μ g/ml QuiΙΑ、100 μ g/ml 膽固醇及 0.5 % (v/v)卵磷脂。修飾的SEAM1/2是水包油乳狀液，含有5% (v/v)鯊烯、1% (v/v) SPAN? 85去污劑、0.7% (v/V)聚山梨醇酯80去污劑、2.5% (v/v)乙醇、100 μ g/ml Quil A及50 μ g/ml膽固醇。可包含在本發(fā)明組合物中的其它“免疫調(diào)節(jié)劑”包括例如一或多種白細(xì)胞介素、干擾素或者其它已知的細(xì)胞因子或趨化因子。在一個(gè)實(shí)施方案中，佐劑可以是環(huán)糊精衍生物或者聚陰離子聚合物，如美國(guó)專利6，165，995和6，610，310中分別描述的那些。應(yīng)理解使用的免疫調(diào)節(jié)劑和/或佐劑依賴于要施 用疫苗或免疫原性組合物的對(duì)象、注射途徑和注射次數(shù)。
[0134]在本發(fā)明的進(jìn)一步實(shí)施方案中，金黃色葡萄球菌凍干的免疫原性組合物包含重組金黃色葡萄球菌聚集因子A(ClfA)片段、與CRM197綴合的分離的5型莢膜多糖、與CRM197綴合的分離的8型莢膜多糖及重組MntC蛋白(也稱作rP305A)。在一些實(shí)施方案中，所述MntC蛋白是脂化的。在其它實(shí)施方案中，所述MntC蛋白不是脂化的。在另一實(shí)施方案中，金黃色葡萄球菌免疫原性組合物是重組金黃色葡萄球菌聚集因子(ClfA)片段(N1N2N3或其組合)、重組金黃色葡萄球菌聚集因子B(ClfB)片段(N1N2N3或其組合)、與CRM197綴合的分離的5型莢膜多糖及與CRM197綴合的分離的8型莢膜多糖的無(wú)菌配制物(液體、凍干的、DNA疫苗、皮內(nèi)制備物)。[0135]在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，金黃色葡萄球菌免疫原性組合物包含重組金黃色葡萄球菌聚集因子A(ClfA)片段(N1N2N3或其組合)、金黃色葡萄球菌鐵結(jié)合蛋白MntC、與CRM197綴合的分離的5型莢膜多糖及與CRM197綴合的分離的8型莢膜多糖。在一個(gè)實(shí)施方案中，金黃色葡萄球菌免疫原性組合物是重組金黃色葡萄球菌聚集因子(ClfA)片段(N1N2N3或其組合)、重組金黃色葡萄球菌聚集因子B(ClfB)片段(N1N2N3或其組合)、金黃色葡萄球菌鐵結(jié)合蛋白MntC、與CRM197綴合的分離的5型莢膜多糖及與CRM197綴合的分離的8型莢膜多糖的無(wú)菌配制物(液體、凍干的、DNA疫苗、皮內(nèi)制備物)。
[0136]在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，金黃色葡萄球菌免疫原性組合物包含重組金黃色葡萄球菌聚集因子B (ClfB)片段(N1N2N3或其組合)、與CRM197綴合的分離的5型莢膜多糖及與CRM197綴合的分離的8型莢膜多糖。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，金黃色葡萄球菌免疫原性組合物包含重組金黃色葡萄球菌聚集因子B(ClfB)片段(N1N2N3或其組合)、金黃色葡萄球菌鐵結(jié)合蛋白MntC、與CRM197綴合的分離的5型莢膜多糖以及與CRM197綴合的分離的8型莢膜多糖。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，金黃色葡萄球菌免疫原性組合物包含金黃色葡萄球菌鐵結(jié)合蛋白MntC、與CRM197綴合的分離的5型莢膜多糖以及與CRM197綴合的分離的8型莢膜多糖。
[0137]金黃色葡萄球菌“侵襲性疾病”是從正常無(wú)菌部位分離細(xì)菌，此部位有相關(guān)的臨床跡象/疾病癥狀。正常的無(wú)菌身體部位包括血液、CSF、胸膜液、心包液、腹膜液、關(guān)節(jié)/滑膜液、骨、身體內(nèi)部位(淋巴結(jié)、腦、心臟、肝、脾、玻璃體液、腎、胰腺、卵巢)或者其它正常無(wú)菌部位。鑒定侵襲性疾病的臨床狀況包括菌血癥、肺炎、蜂窩組織炎、骨髓炎、心內(nèi)膜炎、感染性休克等。
[0138]術(shù)語(yǔ)“分離的”是指將材料從其原始環(huán)境中取出(例如如果其是天然發(fā)生的是從其天然環(huán)境中取出，或者如果其是重組實(shí)體則從其宿主生物體中取出，或者從一個(gè)環(huán)境移至不同環(huán)境)。例如，“分離的”莢膜多糖、蛋白或肽基本上不含來(lái)自衍生所述蛋白的細(xì)胞或組織來(lái)源的細(xì)胞材料或其它污染蛋白，或者當(dāng)是化學(xué)合成或者另外作為化學(xué)反應(yīng)的一部分存在于混合物中時(shí)基本上不含化學(xué)前體或其它化合物。在本發(fā)明中，蛋白或多糖可分離自細(xì)菌細(xì)胞或細(xì)胞碎片，由此其以可用于生產(chǎn)免疫原性組合物的形式提供。術(shù)語(yǔ)“分離的”或“分離”可包括純化，包括例如如本文所述的蛋白或莢膜多糖的純化方法。語(yǔ)言“基本上不含細(xì)胞材料”包括多肽/蛋白的制備，其中所述多肽/蛋白與其所分離自其中或重組產(chǎn)生自其中的細(xì)胞的細(xì)胞成分分開(kāi)。因此，基本上不含細(xì)胞材料的莢膜多糖、蛋白或肽包括具有低于大約30%、20%、10%、5%、2.5%或1% (干重)的污染蛋白或多糖或其它細(xì)胞材料的莢膜多糖、蛋白或肽的制備物。當(dāng)所述多肽/蛋白是重組產(chǎn)生的，也優(yōu)選基本上不含培養(yǎng)基，即培養(yǎng)基占所述蛋白制備物體積的低于大約20%、10%或5%。當(dāng)多肽/蛋白或多糖是通過(guò)化學(xué)合成產(chǎn)生的時(shí)，優(yōu)選基本上不含化學(xué)前體或其它化合物，即其與在蛋白或多糖的合成中涉及的化合物前體或其它化合物分開(kāi)。因此，這種多肽/蛋白或多糖的制備物除了感興趣的多肽/蛋白或多糖片段之外具有低于大約(干重)的化合物前體或化合物。
[0139]“非保守氨基酸取代”是指蛋白內(nèi)一或多個(gè)氨基酸殘基用具有不同物理和/或化學(xué)性質(zhì)的其它氨基酸殘基取代，使用上述特性。
[0140]術(shù)語(yǔ)“藥物可接 受的載體”是指由聯(lián)邦監(jiān)管機(jī)構(gòu)、政府或其它監(jiān)管機(jī)構(gòu)許可的或者在美國(guó)藥典或者其它通常被認(rèn)可的藥典中列出的用于動(dòng)物包括人以及非人哺乳動(dòng)物中的載體。術(shù)語(yǔ)“載體”是指用其施用所述藥物組合物的稀釋劑、佐劑、賦形劑或者運(yùn)載體。這種藥物載體可以是無(wú)菌液體，如水和油，包括石油、動(dòng)物油、植物油或合成來(lái)源的油。水、鹽水溶液和水性葡萄糖和甘油溶液可用作液體載體，特別是用于可注射溶液。合適的藥物賦形劑包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、凝膠、麥芽、米、面粉、白堊(chalk)、硅膠、硬脂酸鈉、單硬脂酸甘油酯、滑石、氯化鈉、脫脂奶粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等。如果需要，組合物也可含有少量濕潤(rùn)劑、填充劑、乳化劑或者PH緩沖劑。這些組合物可以是溶液、懸浮液、乳狀液、緩釋配制物等形式。舉例的合適的藥物載體在"Remington' s PharmaceuticalSciences" , E.W.Martin中描述。配制物應(yīng)適合施用模式。
[0141]術(shù)語(yǔ)“蛋白”、“多肽”和“肽”是指氨基酸殘基的聚合物，不限于最小長(zhǎng)度的產(chǎn)物。因此，肽、寡肽、二聚體、多聚體等均包含在這個(gè)定義內(nèi)。該術(shù)語(yǔ)還包括修飾，如對(duì)天然序列的缺失、添加和取代(通常是性質(zhì)保守的，但是可以是非保守的)，優(yōu)選由此蛋白保留在施用所述蛋白的動(dòng)物體內(nèi)引發(fā)免疫學(xué)應(yīng)答的能力。也包括表達(dá)后修飾，如糖基化、乙酰化、月旨
化、磷酸化等。
[0142]“保護(hù)性”免疫應(yīng)答是指免疫原性組合物引發(fā)體液或細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的能力，其保護(hù)對(duì)象免于感染。所提供的保護(hù)不是絕對(duì)的，即如果與對(duì)照的對(duì)象群體(如未給予所述疫苗或免疫原性組合物的感染動(dòng)物)比較存在統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的改善，所述感染也不需要被完全阻止或根除。保護(hù)作用可限于緩和感染癥狀發(fā)作的嚴(yán)重度或速度。通常，“保護(hù)性免疫應(yīng)答”包括在至少50%的對(duì)象中誘導(dǎo)特異于特定抗原的抗體水平的增加，包括對(duì)每種抗原的一些可測(cè)量水平的功能性抗體應(yīng)答。在特定的情況中，“保護(hù)性免疫應(yīng)答”可包括在至少50%的對(duì)象中誘導(dǎo)特異于特定抗原的抗體水平增加兩倍或者增加四倍，包括對(duì)每種抗原的一些可測(cè)量水平的功能性抗體應(yīng)答。在某些實(shí)施方案中，調(diào)理抗體與保護(hù)性免疫應(yīng)答相關(guān)。因此，保護(hù)性免疫應(yīng)答可以通過(guò)在調(diào)理吞噬測(cè)定中測(cè)量細(xì)菌計(jì)數(shù)下降百分比而測(cè)定，例如下文所述那些。優(yōu)選地，細(xì)菌計(jì)數(shù)降低至少10%、25%、50%、65%、75%、80%、85%、90%、95%或更多。
[0143]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“重組”簡(jiǎn)單地是指通過(guò)遺傳工程方法產(chǎn)生的任何蛋白、多肽或者表達(dá)感興趣基因的細(xì)胞。關(guān)于蛋白或多肽使用的術(shù)語(yǔ)“重組”是指通過(guò)重組多核苷酸的表達(dá)產(chǎn)生的多肽。本發(fā)明的免疫原性組合物中使用的蛋白可以分離自天然來(lái)源或者通過(guò)遺傳工程方法產(chǎn)生,例如重組ClfA、重組ClfB或者重組MntC。如本文所用，“重組”進(jìn)一步描述了核酸分子，由于其來(lái)源或操縱，其與其天然關(guān)聯(lián)的多核苷酸的全部或一部分不再關(guān)聯(lián)。關(guān)于宿主細(xì)胞使用的術(shù)語(yǔ)“重組”是指其中已經(jīng)導(dǎo)入了重組多核苷酸的宿主細(xì)胞。
[0144]如本文所用，重組ClfA(rClfA)和重組ClfB(rClfB)是指用于本發(fā)明的免疫原性組合物中的ClfA或ClfB的形式。在某些實(shí)施方案中，rClfA是包含一或多個(gè)N結(jié)構(gòu)域例如N1N2N3、N2N3、N2或N3的ClfA片段，在本文被稱作“重組ClfA”或“rClfA”。在一個(gè)實(shí)施方案中，rClfB是包含一或多個(gè)ClfB的N結(jié)構(gòu)域例如N1N2N3、N2N3、N2或N3的ClfB片段，在本文被稱作“重組ClfB”或“rClfB”。
[0145]術(shù)語(yǔ)“對(duì)象”是指哺乳動(dòng)物、鳥(niǎo)類、魚(yú)類、爬行動(dòng)物或任何其它動(dòng)物。術(shù)語(yǔ)“對(duì)象”也包括人。術(shù)語(yǔ)“對(duì)象”也包括家庭寵物。家庭寵物的非限制性實(shí)例包括:狗、貓、豬、兔、大鼠、小鼠、沙鼠、倉(cāng)鼠、豚鼠、雪貂、鳥(niǎo)類、蛇、蜥蜴、魚(yú)類、龜和青蛙。術(shù)語(yǔ)“對(duì)象”也包括家畜。家畜動(dòng)物的非限制性實(shí)例包括羊駝、野牛、駱駝、牛、鹿、豬、馬、美洲駝、騾子、驢、綿羊、山羊、兔、馴鹿、牦牛、雞、鵝及火雞。
[0146]如本文所用，“治療”(包括其變化用語(yǔ))是指如下任一或多種:(i)預(yù)防感染或再感染，如在傳統(tǒng)的疫苗中，(?)降低癥狀的嚴(yán)重性或者消除癥狀，及(iii)基本或完全消除所考慮的病原體或失調(diào)。因此，治療可以是預(yù)防性(感染前)的或者治療性(感染后)的。在本發(fā)明中，可以使用預(yù)防性或治療性治療。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)特定實(shí)施方案，提供了治療包括預(yù)防性和/或治療性免疫宿主動(dòng)物抗微生物(例如細(xì)菌，如葡萄球菌屬)感染的組合物和方法。本發(fā)明的方法可用于賦予對(duì)象預(yù)防性和/或治療性免疫性。本發(fā)明的方法也可以應(yīng)用于對(duì)象進(jìn)行生物醫(yī)學(xué)研究應(yīng)用。
[0147]術(shù)語(yǔ)“疫苗”或者“疫苗組合物”可互換使用，是指包含至少一種誘導(dǎo)動(dòng)物體內(nèi)免疫應(yīng)答的免疫原性組合物的藥物組合物。
[0148]一般描述
[0149]本發(fā)明涉及凍干的免疫原性組合物，其包含來(lái)自葡萄球菌屬生物體如金黃色葡萄球菌的抗原。在一些實(shí)施方案中，凍干的免疫原性組合物包含ClfA。在一些實(shí)施方案中，凍干的免疫原性組合物包含至少三種抗原。在一些實(shí)施方案中，凍干的免疫原性組合物包含至少四種抗原?？乖墒褂蒙锘瘜W(xué)分離方法分離自生物體，或者其可以合成產(chǎn)生或者通過(guò)重組方式產(chǎn)生。所述抗原可以是多肽或者多糖或者其組合。這些免疫原性組合物可用于生產(chǎn)疫苗以免疫對(duì)象對(duì)抗葡萄球菌`生物體導(dǎo)致的感染。適用于這些組合物中的成分在下文更詳細(xì)描述。
[0150]葡萄球菌免疫原性組合物
[0151]金黃色葡萄球菌是許多人類疾病的致病因素，范圍從表面皮膚感染至危及生命的病癥如肺炎、膿毒癥和心內(nèi)膜炎。見(jiàn)Lowy N.Eng.J.Med.339:580-532(1998)所述。在侵襲性疾病的情況中，金黃色葡萄球菌可以分離自正常無(wú)菌身體部位包括血液、腦脊液CSFJ-膜液、心包液、腹膜液、關(guān)節(jié)/滑膜液、骨、內(nèi)部身體部位(淋巴結(jié)、腦、心臟、肝臟、脾、玻璃體液、腎臟、胰腺、卵巢)，或者其它正常無(wú)菌部位。這可導(dǎo)致危及生命的臨床狀況如菌血癥、肺炎、蜂窩組織炎、骨髓炎、心內(nèi)膜炎和感染性休克。成人、老年人和小兒患者最易處于金黃色葡萄球菌感染危險(xiǎn)中。
[0152]本發(fā)明的實(shí)施方案描述了在凍干的免疫原性組合物中的選擇的抗原，所述組合物包含分離的金黃色葡萄球菌聚集因子A (CIfA)多肽、與載體蛋白綴合的分離的金黃色葡萄球菌5型莢膜多糖、與載體蛋白綴合的分離的金黃色葡萄球菌8型莢膜多糖、分離的金黃色葡萄球菌聚集因子B (ClfB)及分離的金黃色葡萄球菌MntC蛋白。對(duì)一些凍干的免疫原性組合物的配制物進(jìn)行檢測(cè)，以證實(shí)ClfA蛋白增加的穩(wěn)定性。對(duì)一些凍干的免疫原性組合物的配制物進(jìn)行檢測(cè)，以證實(shí)MntC蛋白的穩(wěn)定性。對(duì)一些凍干的組合物的配制物也進(jìn)行檢測(cè)，以確保CP5-蛋白綴合物和CP8-蛋白綴合物在凍干后是穩(wěn)定的。
[0153]因此，一種凍干的免疫原性組合物包含:分離的金黃色葡萄球菌聚集因子A(CIfA)多肽。一種凍干的免疫原性組合物包含:分離的金黃色葡萄球菌聚集因子A(CIfA)多肽、與載體蛋白綴合的分離的金黃色葡萄球菌5型莢膜多糖及與載體蛋白綴合的分離的金黃色葡萄球菌8型莢膜多糖。一種凍干的免疫原性組合物包含:分離的金黃色葡萄球菌聚集因子A(CIfA)多肽、分離的金黃色葡萄球菌聚集因子B(ClfB)、與載體蛋白綴合的分離的金黃色葡萄球菌5型莢膜多糖及與載體蛋白綴合的分離的金黃色葡萄球菌8型莢膜多糖。一種凍干的免疫原性組合物包含:分離的金黃色葡萄球菌聚集因子A(CIfA)多肽、分離的金黃色葡萄球菌聚集因子B (ClfB)多肽、分離的金黃色葡萄球菌MntC蛋白、與載體蛋白綴合的分離的金黃色葡萄球菌5型莢膜多糖及與載體蛋白綴合的分離的金黃色葡萄球菌8型莢膜多糖。一種凍干的免疫原性組合物包含:分離的金黃色葡萄球菌聚集因子A(CIfA)多肽、分離的金黃色葡萄球菌MntC蛋白、與載體蛋白綴合的分離的金黃色葡萄球菌5型莢膜多糖及與載體蛋白綴合的分離的金黃色葡萄球菌8型莢膜多糖。一種凍干的免疫原性組合物包含:分離的金黃色葡萄球菌聚集因子B(ClfB)多肽、與載體蛋白綴合的分離的金黃色葡萄球菌5型莢膜多糖及與載體蛋白綴合的分離的金黃色葡萄球菌8型莢膜多糖。一種凍干的免疫原性組合物包含:分離的金黃色葡萄球菌聚集因子B(ClfB)多肽，分離的金黃色葡萄球菌MntC蛋白、與載體蛋白綴合的分離的金黃色葡萄球菌5型莢膜多糖及與載體蛋白綴合的分離的金黃色葡萄球菌8型莢膜多糖。一種凍干的免疫原性組合物包含:分離的金黃色葡萄球菌MntC蛋白、與載體蛋白綴合的分離的金黃色葡萄球菌5型莢膜多糖及與載體蛋白綴合的分離的金黃色葡萄球菌8型莢膜多糖。一種凍干的免疫原性組合物包含:分離的金黃色葡萄球菌聚集因子A(ClfA)多肽、分離的金黃色葡萄球菌聚集因子B(ClfB)多肽及分離的金黃色葡萄球菌MntC蛋白。
[0154]在一些實(shí)施方案中，上述組合進(jìn)一步包含至少一種如下抗原:EkeS, DsqA, KesK,KrkN, KrkN2, RkaS, RrkN, KnkA, SdrC, SdrD, SdrE, 0pp3a, DltD, HtsA, LtaS, IsdA, IsdB,IsdC, SdrF, SdrG, SdrH, SrtA, SpA, Sbi, α -溶血素(hla), β -溶血素，纖連蛋白-結(jié)合蛋白A(fnbA),纖連蛋白-結(jié)合蛋白B(fnbB),凝固酶，F(xiàn)ig, map, Panton-Valentine殺白細(xì)胞素(ρν?), α-毒素及其變體，Y-毒素(hlg)及變體，ica,免疫顯性ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，Mg2+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，Ni ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，RAP，自溶素，層粘連蛋白受體，IsaA/PisA，IsaB/PisB, SPOIIIE,SsaA, EbpS, SasA, SasF, Sash, EFB(FIB), SBI, Npase, ΕΒΡ，骨唾液結(jié)合蛋白 II，溶金菌素(aureolysin)前體(AUR)/Seppl, Cna,及其片段如 M55, TSST-1, mecA,聚-N-乙酰葡糖胺(PNAG/dPNAG)外泌多糖，GehD, EbhA, EbhB, SSP-1，SSP-2, HBP，玻連蛋白結(jié)合蛋白，HarA,EsxA, EsxB,腸毒素A,腸毒素B,腸毒素Cl,以及新的自溶素。
[0155]
[0156]如本文所述凍干的免疫原性組合物在某些實(shí)施方案中也包含一或多種佐劑。在一些實(shí)施方案中，所述佐劑是干燥的凍干組合物的一種成分。在其它實(shí)施方案中，所述佐劑可以加入至重建的凍干組合物中，之后給患者施用該組合物。佐劑是一種當(dāng)與免疫原或抗原一起施用時(shí)增強(qiáng)免疫應(yīng)答的物質(zhì)。許多細(xì)胞因子或淋巴因子已經(jīng)示出具有免疫調(diào)節(jié)活性，因此可用作佐劑，包括但不限于白細(xì)胞介素1-0，1-0，2，4，5，6，7，8，10，12(見(jiàn)例如美國(guó)專利5，723，127)，13，14，15，16，17和18 (及其突變形式)；干擾素-α、β和y ;粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)(見(jiàn)例如美國(guó)專利5，078, 996和ATCC登錄號(hào)39900)；巨噬細(xì)胞集落刺激因 子(M-CSF);粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF);以及腫瘤壞死因子α和β?？捎糜诒疚拿枋龅拿庖咴越M合物中的其它佐劑包括趨化因子，包括但不限于:MCP-1，MIP-1a，MIP-1 β和RANTES ;粘附分子，如選擇蛋白，如L-選擇蛋白，P-選擇蛋白和E-選擇蛋白；粘蛋白樣分子，如⑶34，GlyCAM-1和MadCAM-1 ;整聯(lián)蛋白家族成員，如LFA-1，VLA-1，Mac-1 和 ρ150.95 ;免疫球蛋白超家族成員，如 PECAM，ICAMs 如 ICAM-1、ICAM-2 和 ICAM-3，⑶2和LFA-3 ;共刺激分子，如B7-1，B7-2,⑶40和⑶40L ;生長(zhǎng)因子，包括血管生長(zhǎng)因子，神經(jīng)生長(zhǎng)因子，成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子，表皮生長(zhǎng)因子，PDGF, BL-1及血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子；受體分子，包括 Fas, TNF 受體，F(xiàn)it, Apo-1，p55，WSL-1，DR3，TRAMP, Apo-3, AIR, LARD, NGRF，DR4,DR5, KILLER, TRAIL-R2, TRICK2 和 DR6 ;以及胱天蛋白酶(ICE)。
[0157]用于增強(qiáng)免疫應(yīng)答的合適佐劑進(jìn)一步包括但不限于MPL?(3-0-脫?；膯瘟柞Ｖ|(zhì)A，Corixa, Hamilton, MT)，其在美國(guó)專利4，912，094中描述。也適合用作佐劑的是合成的脂質(zhì)A類似物或氨基烷基磷酸葡糖胺化合物(AGP)，或者其衍生物或類似物，其可得自Corixa (Hami I ton，MT)，在美國(guó)專利6，113，918中描述。一種這樣的AGP是2-[(R) -3-十四酰氧基十四酰氨基]乙基2-脫氧-4-0-膦酰基-3-0-[ (R) -3-十四酰氧基十四酰]-2-[(R)-3-十四酰氧基十四酰-氨基]-b-D-吡喃葡萄糖苷，其也被稱作529 (先前稱作RC529)。這個(gè)529佐劑是作為水溶液形式(AF)或者穩(wěn)定乳狀液(SE)形式配制的。
[0158]再其它的佐劑包括胞壁肽，如N-乙酰-胞壁酰-L-蘇氨酰-D-異谷氨酰胺(thr-MDP)，N-乙酰-正胞壁酰-L-丙氨酸-2-0- -2' 二棕櫚酰-Sn-甘油-3-羥基磷?；?_乙胺(MTP-PE);水包油乳狀液，如MF59(美國(guó)專利6，299，884)(含有5%鯊烯，0.5%聚山梨醇酯80和0.5% SPAN?85(任選含有不同量的MTP-PE)，使用微流體儀如ModelllOY微流體儀(Microfluidics,Newton,MA)配制為亞微米顆粒)，及SAF(含有10%鯊烯、0.4%聚山梨醇酯80、5% pluronic嵌段聚合物L(fēng)121和thr-MDP，微流體化為亞微米顆粒乳狀液或者渦旋產(chǎn)生較大顆粒大小乳狀液)；不完全氟氏佐劑(IFA);招鹽(明礬)，如氫氧化鋁，磷酸鋁，硫酸鋁；Amphigen ；Avridine ；L121/鯊烯；D_交酯-聚交酯/葡糖苷；pluronic多元醇；滅活的博特氏菌(Bordetella);阜苷類,如在美國(guó)專利5, 057, 540中描述的 STIMUL0N? QS-21 (Antigenics, Framingham, MA.)，在美國(guó)專利 5，254，339 中描述的ISCOMATRIX?(CSL Limited，Parkville，Australia)，以及免疫刺激復(fù)合物(ISCOMATRIX?)；結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium t uberculosis);細(xì)菌脂多糖；合成的多核苷酸如含有CpG基序的寡核苷酸(如美國(guó)專利6，207，646所述);在歐洲專利I, 296，713和I, 326，634中描述的IC-31 (Intercell AG Vienna,Austria);百日咳毒素(PT)或其突變體,霍亂毒素或其突變體(如美國(guó)專利7, 285，281,7, 332，174,7, 361，355和7，384，640所述);或者大腸桿菌不耐熱毒素(LT)或其突變體，特別是LT-K63，LT-R72(如美國(guó)專利6，149，919、7，115，730和 7，291，588 所述)。
[0159]在一些實(shí)施方案中，所述佐劑是ISC0MATRIX?(見(jiàn)例如Davis et al., Proc.Nat，1.Acad.Sc1.，2004，101(29): 10697-10702)。
[0160]候詵杭原:
[0161]ClfA:結(jié)構(gòu)域組構(gòu)
[0162]聚集因子A(ClfA)是金黃色葡萄球菌表面蛋白，與通過(guò)血纖蛋白原結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合宿主基質(zhì)蛋白相關(guān)。ClfA是含有羧基末端LPXTG(SEQ ID NO:125)基序的蛋白家族成員，其使得該蛋白變得與細(xì)胞表面共價(jià)連接。ClfA也屬于另一蛋白家族(微生物表面成分識(shí)別粘附基質(zhì)分子，或者M(jìn)SCRAMMs)，其與結(jié)合宿主蛋白如血纖蛋白原(由ClfA結(jié)合)、纖連蛋白結(jié)合蛋白(FnbA和FnbB)、膠原結(jié)合蛋白(Cna)等相關(guān)。這些蛋白均共有氨基末端信號(hào)序列，其介導(dǎo)轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞表面。MSCRAMMs也包含A-結(jié)構(gòu)域，其是含有配體結(jié)合(如血纖蛋白原、纖連蛋白、彈性蛋白、角蛋白)的活性位點(diǎn)的功能區(qū)。A-結(jié)構(gòu)域隨后是由絲氨酸天冬氨酸重復(fù)(SD重復(fù))組成的區(qū)域，其被認(rèn)為跨越肽聚糖層。所述SD重復(fù)隨后是跨膜區(qū)，其包含LPXTG (SEQ ID NO: 125)基序以使所述蛋白與肽聚糖共價(jià)連接。ClfA在美國(guó)專利6，008，341中描述。
[0163]包含A結(jié)構(gòu)域的N1N2N3的ClfA配體結(jié)合區(qū)(圖1)跨越氨基酸40-559。ClfA的N結(jié)構(gòu)域已經(jīng)如下分配:N1涵蓋殘基45-220，N2涵蓋殘基229-369，N3涵蓋殘基370-559。見(jiàn)Deivanayagam et al.EMBO J.21:6660-6672(2002)所述。簡(jiǎn)便起見(jiàn)，N1N2N3 結(jié)構(gòu)域可以稱作N123，同樣N2N3可以稱作N23。在重組N1N2N3的制備中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)NI結(jié)構(gòu)域是蛋白酶敏感性的，易于被裂解或水解，以使N2N3成為穩(wěn)定的配體結(jié)合重組片段。參見(jiàn)Deivanayagamet al.EMBO J.21:6660-6672 (2002)。結(jié)合ClfA A結(jié)構(gòu)域的N2N3片段的血纖蛋白原的晶體結(jié)構(gòu)揭示N2和N3均主要為反平行β鏈。除了反平行β鏈之外，Ν2結(jié)構(gòu)域還含有一個(gè)單轉(zhuǎn)角(single turn) α螺旋和兩個(gè)31(|螺旋,Ν3結(jié)構(gòu)域含有三個(gè)31(|螺旋。見(jiàn)Deivanayagamet al.EMBO J.21 =6660-6672(2002)所述。N2與N3的序列比對(duì)表明在其全長(zhǎng)僅13%的序列相同性和 36% 的序列相似性。見(jiàn) Deivanayagam et al.EMBO J.21:6660-6672(2002)所述。N2與N3結(jié)構(gòu)域的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)與典型的IgG折疊相似，已經(jīng)提議是IgG折疊新的變體。見(jiàn)Deivanayagam et al.EMBO J.21:6660-6672 (2002)所述。
[0164]本發(fā)明揭示了包含穩(wěn)定的金黃色葡萄球菌聚集因子A(ClfA)多肽的組合物及產(chǎn)生該組合物的方法，其可用作免疫原性組合物或疫苗。本發(fā)明還揭示了包含穩(wěn)定的ClfA多肽、CP5綴合物和CP8綴合物(三抗原)的組合物，及產(chǎn)生這種組合物的方法，其可用作免疫原性組合物或疫苗。本發(fā)明進(jìn)一步揭示了包含穩(wěn)定的ClfA多肽、CP5綴合物、CP8綴合物及MntC多肽(四抗原)的組合物，及產(chǎn)生這種組合物的方法，其可用作免疫原性組合物或疫苗。已知ClfA是不穩(wěn)定的蛋白，其易于在NI和N2結(jié)構(gòu)域之間剪切。本發(fā)明涉及ClfA配制物，其使得ClfA N1N2N3在加速的應(yīng)激條件下基本保持至少三個(gè)月不降解。在一些實(shí)施方案中，所述配制物是凍干的組合物，其包含少于3%的水分。術(shù)語(yǔ)“凍干的組合物”是指這樣的配制物，其包含低于3%的水分，不意味著限制所述組合物為產(chǎn)生所述組合物的方法，如凍干或任何其它干燥混合物的方法或者組合干燥的配料。加速的應(yīng)激條件，是指極端溫度、PH和/或離子強(qiáng)度的條件，通常用于檢測(cè)配制物的穩(wěn)定性，如37°C幾周或更多時(shí)間。
[0165]因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及穩(wěn)定的組合物，其包含基本上不降解的ClfA蛋白和低于3%的水分。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及穩(wěn)定的組合物，其包含基本上不降解的ClfA蛋白、5型莢膜多糖(CP5)綴合物、CP8綴合物及低于3%的水分。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及穩(wěn)定的組合物，其包含基本上不降解的ClfA蛋白、5型莢膜多糖(CP5)綴合物、CP8綴合物、MntC蛋白和低于3%的水分。所述ClfA蛋白可分離自任何葡萄球菌屬菌株，或者其可以是重組多肽。重組ClfA多肽可具有野生型序列，可包含一或多個(gè)突變，或者其氨基酸序列與野生型序列可以是至少90 %相同的。表1描述了一些金黃色葡萄球菌菌株及其各自的ClfA DNA和蛋白序列。
[0166]表1:ClfA菌株和序列表
【權(quán)利要求】
1.凍干的免疫原性組合物，其包含: (a)選自如下的至少三種成分:分離的金黃色葡萄球菌聚集因子A(ClfA)多肽、分離的金黃色葡萄球菌聚集因子B(ClfB)多肽、5型莢膜多糖(CP5)-蛋白綴合物、8型莢膜多糖(CP8)-蛋白綴合物以及分離的金黃色葡萄球菌MntC多肽； (b)pKa為6.0 ± 0.6的緩沖劑；及 (c)填充劑； 其中所述ClfA多肽在37°C下保持至少I個(gè)月基本上不降解。
2.凍干的免疫原性組合物，其包含: (a)分離的金黃色葡萄球菌聚集因子A(ClfA)多肽， (b)5型莢膜多糖(CP5)-蛋白綴合物， (c)8型莢膜多糖8 (CP8)-蛋白綴合物， (d)pKa為6.0 ±0.6的緩沖劑，以及 (e)填充劑； 其中所述ClfA多肽在37°C下保持至少I個(gè)月基本上不降解。
3.權(quán)利要求2的凍干的免疫原性組合物，其中所述組合物進(jìn)一步包含分離的金黃色葡萄球菌MntC多肽。
4.權(quán)利要求2或3的凍干的免疫原性組合物，其中所述組合物進(jìn)一步包含分離的金黃色葡萄球菌聚集因子B (ClfB)。
5.權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)的凍干的免疫原性組合物，其中所述ClfA多肽包含N結(jié)構(gòu)域。
6.權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)的凍干的免疫原性組合物，其中所述ClfA多肽包含血纖蛋白原結(jié)合結(jié)構(gòu)域。
7.權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)的凍干的免疫原性組合物，其中所述血纖蛋白原結(jié)合結(jié)構(gòu)域已經(jīng)被改變從而以與觀測(cè)到的血纖蛋白原與ClfA的天然血纖蛋白原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的結(jié)合相比降低的水平結(jié)合血纖蛋白原。
8.權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)的凍干的免疫原性組合物，其中所述血纖蛋白原結(jié)合結(jié)構(gòu)域通過(guò)具有在Tyr338、Tyr256、Pro336、Lys389、Ala254和Ile387中的一或多個(gè)處的氨基酸取代而展示出與血纖蛋白原降低的結(jié)合。
9.權(quán)利要求8的凍干的免疫原性組合物，其中在Tyr338、Tyr256、Pro336、Lys389、Ala254和Ile387中的一或多個(gè)處的氨基酸取代是取代為Ala或Ser。
10.權(quán)利要求9的凍干的免疫原性組合物，其中Tyr338被取代為Ala。
11.權(quán)利要求1-10任一項(xiàng)的凍干的免疫原性組合物，其中所述CP5-蛋白綴合物是CP5-CRM197、CP5-肺炎球菌溶血素或者CP5-鏈球菌C5a肽酶(SCP)。`
12.權(quán)利要求1-11任一項(xiàng)的凍干的免疫原性組合物，其中所述CP8-蛋白綴合物是CP8-CRM197、CP8-肺炎球菌溶血素或者CP8-鏈球菌C5a肽酶(SCP)。
13.權(quán)利要求1-12任一項(xiàng)的凍干的免疫原性組合物，其包含占所述免疫原性組合物總重量小于3%重量的水w/w)，其中所述ClfA多肽在0.09% ±0.027%至0.85%±0.26% w/w 之間，所述 CP5-蛋白綴合物在 0.04% ±0.013%至 0.42±0.13% w/w 之間，所述CP8-蛋白綴合物在0.04% ±0.013%至0.42±0.13% w/w之間，并且所述緩沖劑為`2.54% ±0.76% w/w ο
14.權(quán)利要求1-13任一項(xiàng)的凍干的免疫原性組合物，其中所述緩沖劑包含pH6.0±0.5的組氨酸。
15.權(quán)利要求1-14任一項(xiàng)的凍干的免疫原性組合物，其中所述填充劑選自蔗糖、海藻糖、甘露醇、甘氨酸和山梨糖醇。
16.權(quán)利要求15的凍干的免疫原性組合物，其中所述填充劑是蔗糖。
17.權(quán)利要求16的凍干的免疫原性組合物，其中所述填充劑是96%±0.060% w/w的蔗糖。
18.權(quán)利要求1-17任一項(xiàng)的凍干的免疫原性組合物，其進(jìn)一步包含表面活性劑。
19.權(quán)利要求18的凍干的免疫原性組合物，其中所述表面活性劑選自泊洛沙姆、聚氧乙烯烷基醚及聚氧乙烯脫水山梨糖醇脂肪酸酯。
20.權(quán)利要求19的凍干的免疫原性組合物，其中所述聚氧乙烯脫水山梨糖醇脂肪酸酯是聚山梨醇酯80。
21.權(quán)利要求20的凍干的免疫原性組合物，其中所述聚山梨醇酯80為0.20%+ 0.041 % w/w。
22.權(quán)利要求1-21任一項(xiàng)的凍干的免疫原性組合物，其中所述組合物進(jìn)一步包含佐劑。
23.權(quán)利要求22的凍干的免疫原性組合物，其中所述佐劑是ISCOMATRIX?。
24.通過(guò)用水性稀釋劑重建權(quán)利要求1-23任一項(xiàng)的凍干的免疫原性組合物制備的液體免疫原性組合物，其中所述液體免疫原性組合物的最終PH為6.0±0.5。
25.權(quán)利要求24的液體免疫原性組合物，其中所述水性稀釋劑是水。
26.權(quán)利要求24或25的液體免疫原性組合物，其中所述液體免疫原性組合物包含:
(a)ClfA 多肽,其濃度在 40 μ g/ml ±4 μ g/ml 至 800 μ g/ml ±80 μ g/ml 之間；(b)CP5-蛋白綴合物,其濃度在 20 μ g/ml ±2 μ g/ml 至 400 μ g/ml ±40 μ g/ml 之間；(c)CP8-蛋白綴合物,其濃度在 20 μ g/ml ±2 μ g/ml 至 400 μ g/ml ±40 μ g/ml 之間； (d)組氨酸緩沖劑，其濃度為10mM±5mM; (e)聚山梨醇酯80，其濃度為0.1%±0.05%重量/體積(w/v);以及 (f)蔗糖，其濃度為9%±4.5%w/v。
27.權(quán)利要求24-26任一項(xiàng)的液體免疫原性組合物，其中所述液體免疫原性組合物進(jìn)一步包含 MntC 多肽,其濃度在 40 μ g/ml ±4 μ g/ml 至 800 μ g/ml ±80 μ g/ml 之間。
28.權(quán)利要求24-27任一項(xiàng)的液體免疫原性組合物，其中所述液體免疫原性組合物進(jìn)一步包含 ClfB 多肽，其濃度在 40 μ g/ml ±4 μ g/ml 至 800 μ g/ml ±80 μ g/ml 之間。
【文檔編號(hào)】C07K16/12GK103826656SQ201180068105
【公開(kāi)日】2014年5月28日 申請(qǐng)日期:2011年12月21日 優(yōu)先權(quán)日:2010年12月22日
【發(fā)明者】L·漢德科, A·諾諾亞馬, T·S·霍奇, S·內(nèi)馬 申請(qǐng)人:惠氏有限責(zé)任公司