一種用于萊姆病鞭毛抗原免疫血清學(xué)診斷的蛋白質(zhì)芯片及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用于萊姆病鞭毛抗原(Flagellin)免疫血清學(xué)診斷的蛋白質(zhì)芯片及其制備方法和應(yīng)用，其特征在于：在固相載體表面點(diǎn)陣固定有伯氏疏螺旋體重組鞭毛抗原探針；固相載體為16-氨基-1-十六烷硫醇修飾的金箔芯片，在16-氨基-1-十六烷硫醇上結(jié)合有4-(N-馬來酰亞胺基甲基)環(huán)己烷-1-羧酸琥珀酰亞胺酯和4-(二甲氨基)吡啶。本發(fā)明的蛋白質(zhì)芯片可以準(zhǔn)確的探測(cè)出萊姆病患者血清中的抗鞭毛抗原IgG抗體和抗鞭毛抗原IgM抗體，操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)結(jié)果穩(wěn)定。
【專利說明】一種用于萊姆病鞭毛抗原免疫血清學(xué)診斷的蛋白質(zhì)芯片及 其制備方法和應(yīng)用 一、

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種蛋白質(zhì)芯片，具體涉及伯氏疏螺旋體感染的萊姆病病人血清中相 關(guān)的抗鞭毛抗原抗體的檢測(cè)蛋白質(zhì)芯片及其制備與使用。 二、 技術(shù)背景
[0002] 萊姆?。↙yme Diseas，LD)是一種由蜱蟲傳播的疏螺旋體感染人體，以多個(gè)器 官損傷為特征的感染性疾病。在世界范圍內(nèi)，萊姆病在美國以及歐洲，尤其是斯堪的納維 亞半島以及中歐地區(qū)為其高發(fā)地區(qū)，在中國，萊姆病的發(fā)病主要分布在大興安嶺地區(qū)以及 大別山地區(qū)。萊姆病的主要病原體為疏螺旋體，分為三個(gè)亞型：伯氏疏螺旋體（Borrelia burgdorferi)，阿弗西尼疏螺旋體（Borrelia afzelii)和伽氏疏螺旋體（Borrelia garinii)。兒童發(fā)病率高于成人。環(huán)形游走性紅斑（Erythema migrans，EM)是伯氏疏螺旋 體感染的臨床特征性表現(xiàn)，未經(jīng)治療的萊姆病病人在病情發(fā)展的數(shù)月到數(shù)年之間會(huì)發(fā)生神 經(jīng)性病變，外周神經(jīng)以及中樞神經(jīng)都將受累。但是由于萊姆病感染初期的臨床表現(xiàn)的非特 異性，即其環(huán)形游走性紅斑的表現(xiàn)與諸多皮膚性疾病有類似及重疊的表現(xiàn)，以及臨床醫(yī)生 對(duì)萊姆病的危害認(rèn)識(shí)不足等原因，導(dǎo)致萊姆病易在臨床上誤診或漏診。
[0003] 目前，在實(shí)驗(yàn)室診斷方面，許多技術(shù)可應(yīng)用于確診伯氏疏螺旋體的感染，其中包括 細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)、免疫組織化學(xué)技術(shù)、聚合酶鏈反應(yīng)以及用全細(xì)胞裂解液、重組蛋白和多肽進(jìn) 行的酶聯(lián)免疫檢測(cè)或者蛋白質(zhì)印跡的血清抗體檢測(cè)等技術(shù)。盡管如此，常規(guī)血清免疫方法 在萊姆病診斷上的價(jià)值仍然存在著諸多問題。美國國家疾控中心推薦萊姆病檢測(cè)的首選方 法是用ELISA或者直接免疫熒光法對(duì)血清中疏螺旋體產(chǎn)生的抗體的檢測(cè)，但是結(jié)果仍需要 免疫印跡方法的確證。
[0004] 目前公認(rèn)的是，伯氏疏螺旋體菌體在感染后，人體免疫反應(yīng)對(duì)其產(chǎn)生抗體主要針 對(duì)于其鞭毛抗原（Flagellin)和外表面蛋白C抗原（Outer space protein C，OspC)。其 中，鞭毛抗原是伯氏疏螺旋體主要的免疫性抗原。在感染伯氏疏螺旋體的早期和晚期都能 夠發(fā)現(xiàn)抗伯氏疏螺旋體鞭毛抗原抗體在血清中的表達(dá)。與其他菌體抗原相比，抗鞭毛抗原 抗體檢測(cè)目前是用于診斷伯氏疏螺旋體感染萊姆病較為理想的血清學(xué)指標(biāo)。其中，血清中 的IgG抗體分子量小，在疾病的發(fā)生中產(chǎn)生晚，維持時(shí)間長(zhǎng)，消失慢，濃度高，可作為疾病既 往感染的指標(biāo)；而血清中的IgM抗體分子量大，在感染的初期就可檢測(cè)到，維持時(shí)間短，消 失快，是作為疾病急性期感染的指標(biāo)。
[0005] 生物芯片是近幾年來迅速發(fā)展起來的集物理學(xué)、化學(xué)、材料科學(xué)和生命科學(xué)于一 體的高新技術(shù)，利用微電子芯片技術(shù)的集成化和平行處理原理，將大量具有生物學(xué)意義的 特殊標(biāo)志物的生物樣品有序地固化在玻璃片、娃片、金屬片和商分子材料等基質(zhì)表面，并 利用微量反應(yīng)提及，一次雜交就可以對(duì)許多血清中的生物標(biāo)志物、突變或多態(tài)性進(jìn)行特異、 快速、精確檢測(cè)。尤其是隨著生物芯片技術(shù)以其高通量、高敏感性和高特異性的優(yōu)勢(shì)，其在 生物學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用以及實(shí)驗(yàn)室技術(shù)方面應(yīng)用已廣泛被接受，在針對(duì)疾病大規(guī)模的人群篩查方 面更是優(yōu)勢(shì)明顯，已經(jīng)在基因篩查、基因診斷、蛋白質(zhì)相互作用以及細(xì)胞功能研究等領(lǐng)域獲 得成功應(yīng)用。蛋白質(zhì)芯片不僅可以研究蛋白間相互作用，并且由于其可以對(duì)痕跡材料進(jìn)行 檢測(cè)，大大增加了檢測(cè)物的敏感性，所以在疾病標(biāo)志物的實(shí)驗(yàn)室診斷方面，其應(yīng)用越來越 廣。
[0006] 為了彌補(bǔ)臨床上診斷伯氏疏螺旋體感染引起的萊姆病中產(chǎn)生的檢測(cè)時(shí)限長(zhǎng)、易誤 診漏診等情況的發(fā)生，因而，研發(fā)一種新型蛋白質(zhì)芯片，對(duì)導(dǎo)致萊姆病的伯氏疏螺旋體鞭毛 抗原產(chǎn)生的血清IgG抗體和IgM抗體進(jìn)行檢測(cè)，將大大提高臨床診斷率以及對(duì)疾病高發(fā)區(qū) 的人群進(jìn)行有效篩查，這無疑具有潛在的臨床價(jià)值和社會(huì)效益。 三、
【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的之一在于提供一種診斷伯氏疏螺旋體感染的萊姆病患者血清中抗 鞭毛抗原IgG抗體和抗鞭毛抗原IgM抗體的蛋白質(zhì)芯片及其制作方法和使用方法。
[0008] 本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種診斷伯氏疏螺旋體感染的萊姆病患者血清中 抗鞭毛抗原IgG抗體和抗鞭毛抗原IgM抗體的蛋白質(zhì)芯片試劑盒。
[0009] 本發(fā)明解決技術(shù)問題采用如下技術(shù)方案：
[0010] 本發(fā)明公開了一種用于萊姆病鞭毛抗原免疫血清學(xué)診斷的蛋白質(zhì)芯片，其特點(diǎn)在 于：在固相載體表面點(diǎn)陣固定有伯氏疏螺旋體重組鞭毛抗原探針；所述固相載體為16-氨 基-1-十六烷硫醇修飾的金箔芯片，在所述16-氨基-1-十六烷硫醇上結(jié)合有4-(N-馬來 酰亞胺基甲基）環(huán)己烷-1-羧酸琥珀酰亞胺酯和4-(二甲氨基）吡啶。
[0011] 本發(fā)明同時(shí)公來了用于萊姆病鞭毛抗原免疫血清學(xué)診斷的蛋白質(zhì)芯片的制備方 法，其特點(diǎn)在于按如下步驟進(jìn)行：
[0012] 步驟1 :對(duì)金箔芯片進(jìn)行表面化學(xué)修飾，獲得固相載體
[0013] 以濃度為0.8mM的16-氨基-1-十六烷硫醇的乙醇溶液為修飾液1，以IOOmg 4-(N-馬來酰亞胺基甲基）環(huán)己烷-1-羧酸琥珀酰亞胺酯與50mg 4-(二甲氨基）吡啶溶于 IOmL N，N-二甲基甲酰胺構(gòu)成的混合液為修飾液2 ;對(duì)金箔芯片進(jìn)行清洗后，浸入所述修飾 液1中，黑暗條件下室溫?fù)u蕩孵育12小時(shí)，取出后用無水乙醇溶液清洗、氮?dú)獯蹈?；然后?浸于所述修飾液2之中，黑暗條件下室溫?fù)u蕩孵育12小時(shí)，取出后依次用N，N-二甲基甲酰 胺和PBST溶液清洗、氮?dú)獯蹈?，獲得固相載體待用；所述PBST溶液是由磷酸緩沖液PBS與 Tween 20混合構(gòu)成，在所述PBST溶液中Tween 20的濃度為0? OlM ;
[0014] 步驟2 :固定伯氏疏螺旋體重組鞭毛抗原探針
[0015] 將伯氏疏螺旋體重組鞭毛抗原溶于PBST-BSA溶液中，配制濃度不低于12. 5 i! g/ mL的蛋白溶液；
[0016] 將固相載體浸于所述蛋白溶液中，在4°C?37°C孵育0.5?12h，取出后用PBST溶 液清洗、氮?dú)獯蹈?，即得用于萊姆病免疫血清學(xué)診斷的蛋白質(zhì)芯片；
[0017] 其中，步驟1對(duì)金箔芯片進(jìn)行清洗的方法優(yōu)選為：將NH3、H20 2 &H20按體積比1 :1 : 5混合構(gòu)成TLl清洗液，將金箔芯片浸入盛有TLl清洗液的不銹鋼清洗盒內(nèi)，82°C水浴6分 鐘，清洗2次，取出之后用超純水沖洗，再用無水乙醇清洗，最后用氮?dú)獯蹈伞?br> [0018] 本發(fā)明上述用于萊姆病鞭毛抗原免疫血清學(xué)診斷的蛋白質(zhì)芯片的使用方法，其特 點(diǎn)在于：
[0019] 將Cy3標(biāo)記驢抗人IgG抗體溶于PBST-BSA溶液中，構(gòu)成濃度不低于4. 9 i! g/mL的 IgG熒光二抗溶液；
[0020] 將Cy3標(biāo)記山羊抗人IgM抗體溶于PBST-BSA溶液中，構(gòu)成濃度不低于4. 9 ii g/mL 的IgM熒光二抗溶液；
[0021] 將待診斷患者血清點(diǎn)樣于所述蛋白質(zhì)芯片的任意兩個(gè)伯氏疏螺旋體重組鞭毛抗 原探針上，常溫條件下孵育抗體1小時(shí)，取出后用PBST溶液清洗、氮?dú)獯蹈桑?br> [0022] 將所述IgG熒光二抗溶液和所述IgM熒光二抗溶液分別點(diǎn)樣于一個(gè)孵育有抗體的 探針之上，然后用PBST溶液清洗、氮?dú)獯蹈桑?br> [0023] 若探針處呈現(xiàn)熒光色，則待診斷患者血清中含有抗鞭毛抗原IgG抗體或抗鞭毛抗 原IgM抗體，若探針處無熒光色，則待診斷患者血清中不含抗鞭毛抗原IgG抗體或抗鞭毛抗 原IgM抗體；
[0024] 在使用時(shí)，還應(yīng)同時(shí)將健康人血清同時(shí)點(diǎn)樣于同一蛋白質(zhì)芯片的其他伯氏疏螺旋 體重組鞭毛抗原探針上，作為陰性對(duì)照。
[0025] 本發(fā)明還公開了基于上述蛋白質(zhì)芯片的用于萊姆病鞭毛抗原免疫血清學(xué)診斷的 試劑盒，其特點(diǎn)在于：包含上述的蛋白質(zhì)芯片、PBST-BSA溶液、將Cy3標(biāo)記驢抗人IgG抗體 溶于PBST-BSA溶液中，構(gòu)成的濃度不低于4. 9 ii g/mL的IgG熒光二抗溶液和將Cy3標(biāo)記山 羊抗人IgM抗體溶于PBST-BSA溶液中，構(gòu)成濃度不低于4. 9 ii g/mL的IgM熒光二抗溶液；
[0026] 所述PBST溶液是由磷酸緩沖液PBS與Tween 20混合構(gòu)成，在所述PBST溶液中 Tween20 的濃度為 0? OlM ;
[0027] 所述的PBST-BSA溶液是由磷酸緩沖液PBS、Tween 20及胎牛血清BSA混合構(gòu)成， 在所述PBST-BSA溶液中Tween 20的濃度為0. 01M，胎牛血清BSA的質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為0. 1 %。 [0028] 與已有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果體現(xiàn)在：
[0029] 本發(fā)明一方面利用金箔作為基質(zhì)。其與傳統(tǒng)玻璃片、硅片以及高分子材料基質(zhì)的 優(yōu)勢(shì)在于，金箔本身為惰性金屬，但其與化學(xué)物質(zhì)的結(jié)合與傳統(tǒng)玻璃片和硅片相比來說更 加牢固。并且金箔的生物親和度較低，不易與基因或者蛋白質(zhì)等物質(zhì)產(chǎn)生非特異性吸附，大 大降低了非特異性，避免了檢測(cè)結(jié)果假陽性的產(chǎn)生。
[0030] 本發(fā)明第二方面，在十六烷基修飾的基礎(chǔ)上，對(duì)傳統(tǒng)方法進(jìn)行改良，進(jìn)行活化的馬 來酸的修飾，利用具有活性的羧基末端與蛋白質(zhì)結(jié)合，與傳統(tǒng)馬來酸修飾相比，這種新型活 化馬來酸修飾金箔芯片能結(jié)合更多蛋白質(zhì)，提高了檢測(cè)敏感性。
[0031] 在用于實(shí)際檢測(cè)臨床萊姆病患者血中抗鞭毛抗原IgG抗體和抗鞭毛抗原IgM抗體 方面，每張芯片可同時(shí)檢測(cè)188例血清，靈敏度、特異性均較高，減少了假陽性和假陰性的 發(fā)生幾率。其次，芯片的穩(wěn)定性和可重復(fù)性較好，增加了實(shí)驗(yàn)室診斷的準(zhǔn)確性。尤其在與傳 統(tǒng)方法相比時(shí)，運(yùn)用其在對(duì)萊姆病高危地區(qū)的人群進(jìn)行大規(guī)模篩查，可提供更為簡(jiǎn)便和可 靠的檢測(cè)方法。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0032] 圖1為金箔芯片點(diǎn)樣布陣圖；
[0033] 圖2為原子力顯微鏡掃描清洗后金箔芯片平面表征；
[0034] 圖3為原子力顯微鏡掃描化學(xué)修飾后金箔芯片平面表征；
[0035] 圖4為伯氏疏螺旋體重組鞭毛抗原濃度梯度質(zhì)控結(jié)果，其中兔抗伯氏疏螺旋體鞭 毛抗原IgG抗體濃度為50 ii g/mL，Cy3標(biāo)記山羊抗兔IgG抗體濃度為2500 ii g/mL ;
[0036] 圖5為兔抗伯氏疏螺旋體鞭毛抗原IgG抗體濃度梯度質(zhì)控結(jié)果，其中伯氏疏螺旋 體鞭毛抗原濃度為50 ii g/mL，Cy3標(biāo)記山羊抗兔IgG抗體濃度為2500 ii g/mL ;
[0037] 圖6為Cy3標(biāo)記山羊抗兔IgG抗體濃度梯度質(zhì)控結(jié)果，其中伯氏疏螺旋體鞭毛抗 原濃度為50 ii g/mL，兔抗伯氏疏螺旋體鞭毛抗原IgG抗體濃度為50 ii g/mL ;
[0038] 圖7為伯氏疏螺旋體重組鞭毛抗原孵育時(shí)間-溫度質(zhì)控結(jié)果；
[0039] 圖8為萊姆病患者抗鞭毛抗原IgG抗體、陰性血清和陰性對(duì)照實(shí)際檢測(cè)圖；
[0040] 圖9為萊姆病患者抗鞭毛抗原IgM抗體、陰性血清和陰性對(duì)照實(shí)際檢測(cè)圖。 具體實(shí)施例
[0041] 本發(fā)明各實(shí)施例原材料的來源與準(zhǔn)備如下：
[0042] 1、金箔芯片來源：本發(fā)明所用金箔芯片來自Interactiva公司（德國，烏爾姆）， 其基底為玻璃片，其上覆蓋一層IOnm厚度的純金（純度99.9% )，金箔之上為一區(qū)域化的 50 ii m的TEFLON膜的陣列（96孔*2,8行*12列），陣列孔徑為I. 25mm，如圖1所示。
[0043] 2、金箔芯片表面化學(xué)修飾試劑：
[0044] 修飾液1 :濃度為0.8mM的16-氨基-1-十六烷硫醇的乙醇溶液。（16-氨 基-1-十六烷硫醇購自日本D0JIND0公司）
[0045] 修飾液2 :100mg 4-(N_馬來酰亞胺基甲基）環(huán)己燒-1-羧酸琥拍酰亞胺酯與50mg 4_(二甲氨基）吡啶溶于IOmL N，N-二甲基甲酰胺。（以上試劑均購自美國SIGMA-ALDRICH 公司）
[0046] 3、抗原、抗體、熒光素類
[0047] 伯氏疏螺旋體重組鞭毛抗原購自MYBI0S0URCE公司；兔抗伯氏疏螺旋體鞭毛抗原 IgG抗體購自ROCKLAND公司；Cy3標(biāo)記山羊抗兔IgG抗體購自Sangon公司；Cy3標(biāo)記驢抗人 IgG抗體購自Sangon公司；Cy3標(biāo)記山羊抗人IgM抗體購自KPL公司；磷酸緩沖液（PBS)、 Tween 20及胎牛血清（BSA)均購自SIGMA-ALDRICH公司。
[0048] 4、PBST溶液是由磷酸緩沖液PBS與0? OlM Tween 20混合構(gòu)成。
[0049] PBST-BSA溶液是由磷酸緩沖液PBS、0. OlM Tween 20及0? 1 %胎牛血清BSA混合 構(gòu)成。
[0050] 實(shí)施例1、金箔芯片表面化學(xué)修飾
[0051] 步驟1、金箔芯片的清洗：由NH3 :H202 :H20 = 1 :1 :5的體積比例混合獲得TLl清洗 液。將金箔芯片置于盛有TLl清洗液的不銹鋼清洗盒內(nèi)，82°C水浴6分鐘，清洗2次，取出 之后用超純水沖洗2分鐘，2次，再用無水乙醇清洗2分鐘，2次，之后用氮?dú)獯蹈?，置于干?S閉芯片盒中，待用。
[0052] 步驟2、對(duì)清洗后金箔芯片進(jìn)行表面化學(xué)修飾，獲得固相載體
[0053] 將清洗后的金箔芯片浸于修飾液1之中，黑暗條件下室溫?fù)u蕩孵育12小時(shí)，取出 后用無水乙醇溶液清洗3次，每次2分鐘，然后氮?dú)獯蹈?；再將此金箔芯片浸于修飾?之 中，黑暗條件下室溫?fù)u蕩孵育12小時(shí)，取出后用N，N-二甲基甲酰胺清洗3次，每次3分鐘， 再用PBST溶液（PH 7. 4)清洗3次，每次2分鐘，用氮?dú)獯蹈?，得固相載體待用。
[0054] 圖2和圖3為利用原子力顯微鏡（AFM)觀察金箔芯片修飾前后表征情況?？梢钥?出，修飾后的平面表面較修飾前的平面表面更為粗糙，表示經(jīng)修飾后，化學(xué)基團(tuán)共價(jià)連接到 金箔芯片表面上。這種修飾是首次在金箔平面上開展，與傳統(tǒng)的馬來酸修飾相比，提高了馬 來酸的活性，使其更容易于與蛋白質(zhì)連接，增加了試劑檢測(cè)的敏感性。
[0055] 實(shí)施例2質(zhì)控實(shí)驗(yàn)
[0056] 制備孵育液1 :將伯氏疏螺旋體重組鞭毛抗原溶于PBST-BSA溶液，配置成蛋白濃 度梯度為 200 u g/mL，100 u g/mL，50 u g/mL，25 u g/mL，12. 5 u g/mL，6. 25 u g/mL，3. 12 u g/ mL，I. 65 ii g/mL，0? 78 ii g/mL，0? 39 ii g/mL，0? 19 ii g/mL 的鞭毛抗原溶液。
[0057] 制備孵育液2 :將兔抗伯氏疏螺旋體鞭毛抗原IgG抗體溶于PBST-BSA溶液，配置 成抗體濃度梯度為 200 y g/mL，100 y g/mL，50 y g/mL，25 y g/mL，12. 5 y g/mL，6. 25 y g/mL， 3. 12 y g/mL，I. 65 y g/mL，0? 78 y g/mL，0? 39 y g/mL，0? 19 y g/mL 的溶液。
[0058] 制備孵育液3 :將Cy3標(biāo)記山羊抗兔IgG抗體溶于PBST-BSA溶液，配置成熒光二抗 濃度梯度為 5000 u g/mL，2500 u g/mL，1250 u g/mL，625 u g/mL，312. 5 u g/mL，156. 2 u g/mL， 78. I y g/mL，39. I y g/mL，19. 5 y g/mL，9. 8 y g/mL，4. 9 y g/mL 的溶液。
[0059] 制備孵育液4 :將Cy3標(biāo)記驢抗人IgG抗體溶于PBST-BSA溶液，配置成熒光二抗 濃度梯度為 5000 u g/mL，2500 u g/mL，1250 u g/mL，625 u g/mL，312. 5 u g/mL，156. 2 u g/mL， 78. I ii g/mL，39. I ii g/mL，19. 5 ii g/mL，9. 8 ii g/mL，4. 9 ii g/mL 的 IgG 突光二抗溶液。
[0060] 制備孵育液5 :將Cy3標(biāo)記山羊抗人IgM抗體溶于PBST-BSA溶液，配置成熒光二抗 濃度梯度為 5000 u g/mL，2500 u g/mL，1250 u g/mL，625 u g/mL，312. 5 u g/mL，156. 2 u g/mL， 78. I ii g/mL，39. I ii g/mL，19. 5 ii g/mL，9. 8 ii g/mL，4. 9 ii g/mL 的 IgM 突光二抗溶液。
[0061] I、鞭毛抗原濃度梯度孵育質(zhì)控實(shí)驗(yàn)。
[0062] 將實(shí)施例1完成表面化學(xué)修飾的金箔芯片作為固相載體浸于孵育液1中，室溫條 件（25°C )下孵育2小時(shí)，取出后用PBST清洗3次，每次2分鐘，氮?dú)獯蹈?，得用于萊姆病免 疫血清學(xué)診斷的蛋白質(zhì)芯片。
[0063] 將濃度為50 g/mL兔抗伯氏疏螺旋體鞭毛抗原抗體溶液點(diǎn)樣于上述孵育有伯氏 疏螺旋體重組鞭毛抗原探針的蛋白質(zhì)芯片之上，室溫（25°C )條件下孵育1小時(shí)。取出用 PBST清洗3次，每次2分鐘，氮?dú)獯蹈?，待用?br> [0064] 將濃度為2500 ii g/mL的Cy3標(biāo)記山羊抗兔IgG抗體溶液點(diǎn)樣與上述孵育有抗體 的芯片之上，室溫（25°C )條件下孵育1小時(shí)。取出用PBST清洗3次，每次2分鐘。氮?dú)獯?干。
[0065] 使用芯片掃描儀（北京博奧公司，型號(hào)：晶芯Luxscan 10K-A)對(duì)以上蛋白質(zhì)芯片 進(jìn)行掃描，結(jié)果顯示于圖4。從圖中可以看出：在兔抗伯氏疏螺旋體鞭毛抗原IgG抗體和Cy3 標(biāo)記山羊抗兔IgG抗體孵育條件不變的情況下，當(dāng)伯氏疏螺旋體重組鞭毛抗原孵育濃度大 于12. 5 y g/mL時(shí)，所產(chǎn)生的熒光信號(hào)強(qiáng)度與陰性對(duì)照組產(chǎn)生的熒光信號(hào)強(qiáng)度有明顯的差 異。故顯示孵育伯氏疏螺旋體重組鞭毛抗原的最優(yōu)濃度應(yīng)在12. g/mL以上。
[0066] 2、抗鞭毛抗原IgG抗體濃度梯度孵育質(zhì)控實(shí)驗(yàn)。
[0067] 將實(shí)施例1完成表面化學(xué)修飾的金箔芯片作為固相載體浸于濃度為50 ii g/mL的 伯氏疏螺旋體重組鞭毛抗原溶液之中，室溫（25°C )條件下孵育2小時(shí)，取出用PBST清洗3 次，每次2分鐘，氮?dú)獯蹈?；再將孵育?的兔抗伯氏疏螺旋體鞭毛抗原IgG抗體溶液點(diǎn)樣 于孵育有伯氏疏螺旋體重組鞭毛抗原探針的芯片之上，室溫（25°C )條件下孵育1小時(shí)，取 出用PBST清洗3次，每次2分鐘，氮?dú)獯蹈?；再?500 ii g/mL的Cy3標(biāo)記山羊抗兔IgG抗 體，室溫（25°C )條件下孵育1小時(shí)，取出用PBST清洗3次，每次2分鐘，氮?dú)獯蹈伞?br> [0068] 使用芯片掃描儀對(duì)芯片進(jìn)行掃描，即為抗鞭毛抗原IgG抗體濃度梯度孵育質(zhì)控實(shí) 驗(yàn)，結(jié)果顯示與圖5。從圖中可以看出：在伯氏疏螺旋體重組鞭毛抗原和Cy3標(biāo)記山羊抗 兔IgG抗體孵育條件不變的情況下，當(dāng)兔抗伯氏疏螺旋體鞭毛抗原IgG抗體孵育濃度大于 6. 25 y g/mL時(shí)，所產(chǎn)生的熒光信號(hào)強(qiáng)度與陰性對(duì)照組產(chǎn)生的熒光信號(hào)強(qiáng)度存在著可辨識(shí)的 差異。說明此修飾芯片可以檢測(cè)到抗伯氏疏螺旋體鞭毛抗原IgG抗體的數(shù)量級(jí)在yg/mL 級(jí)。
[0069] 3、Cy3標(biāo)記山羊抗兔IgG抗體濃度梯度孵育質(zhì)控實(shí)驗(yàn)。
[0070] 將實(shí)施例1完成表面化學(xué)修飾的金箔芯片作為固相載體浸于濃度為50 ii g/mL的 伯氏疏螺旋體重組鞭毛抗原溶液之中，室溫（25°C )條件下孵育2小時(shí)，取出用PBST清洗 3次，每次2分鐘，氮?dú)獯蹈桑辉賹舛葹?0 ii g/mL的兔抗伯氏疏螺旋體鞭毛抗原IgG抗 體溶液點(diǎn)樣于孵育有伯氏疏螺旋體重組鞭毛抗原探針的芯片之上，室溫（25°C)條件下孵 育1小時(shí)，取出用PBST清洗3次，每次2分鐘，氮?dú)獯蹈?。再將稀釋濃度?000ii g/mL， 2500 u g/mL,1250 u g/mL,625 u g/mL,312. 5 u g/mL,156. 2 u g/mL,78. Iu g/mL,39. I U g/ mL，19. 5 ii g/mL，9. 8 ii g/mL，4. 9 ii g/mL的孵育液3點(diǎn)樣于孵育有抗體的芯片之上，取出用 PBST清洗3次，每次2分鐘，氮?dú)獯蹈伞?br> [0071] 使用芯片掃描儀對(duì)芯片進(jìn)行掃描，即為熒光素抗IgG抗體的質(zhì)控實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示 于圖6。從圖中可以看出：在兔抗伯氏疏螺旋體鞭毛抗原IgG抗體和伯氏疏螺旋體重組鞭 毛抗原孵育條件不變的情況下，當(dāng)Cy3標(biāo)記山羊抗兔IgG抗體孵育濃度大于4. 9 ii g/mL時(shí)， 所產(chǎn)生的熒光信號(hào)強(qiáng)度與陰性對(duì)照組產(chǎn)生的熒光信號(hào)強(qiáng)度有明顯的差異。故顯示孵育Cy3 標(biāo)記山羊抗兔IgG抗體的最優(yōu)濃度應(yīng)在4. 9 ii g/mL以上。
[0072] 4、濃度-溫度質(zhì)控實(shí)驗(yàn)。
[0073] 將實(shí)施例1完成表面化學(xué)修飾的金箔芯片作為固相載體浸于濃度為50 ii g/mL的 伯氏疏螺旋體重組鞭毛抗原溶液，分別在37°C，室溫（25°C )和4°C條件下孵育12小時(shí)、6 小時(shí)、3小時(shí)、1小時(shí)和0. 5小時(shí)，取出用PBST清洗3次，每次2分鐘，氮?dú)獯蹈?；再將濃度?50 y g/mL的兔抗伯氏疏螺旋體鞭毛抗原IgG抗體溶液點(diǎn)樣于孵育有伯氏疏螺旋體重組鞭 毛抗原探針的芯片之上，室溫（25°C )條件下孵育1小時(shí)，取出用PBST清洗3次，每次2分 鐘，氮?dú)獯蹈?。再將稀釋濃度?500 ii g/mL的Cy3標(biāo)記山羊抗兔抗IgG抗體溶于PBST-BSA 溶液點(diǎn)樣于孵育有抗體的芯片之上，取出用PBST-BSA清洗3次，每次2分鐘，氮?dú)獯蹈伞?br> [0074] 芯片掃描儀對(duì)芯片進(jìn)行掃描，即為Cy3標(biāo)記山羊抗兔IgG抗體的質(zhì)控實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯 示于圖7。從圖中可以看出：
[0075] 1、熒光強(qiáng)度隨著孵育時(shí)間的延長(zhǎng)而延長(zhǎng)，當(dāng)孵育時(shí)間大于1小時(shí)，熒光強(qiáng)度隨著 孵育時(shí)間的延長(zhǎng)變化不是很明顯。故在實(shí)際檢測(cè)中，為了縮短孵育時(shí)間，建議探針制作的孵 育時(shí)間大于1小時(shí)即可滿足需求。
[0076] 2、在孵育溫度的選擇上，熒光強(qiáng)度在室溫（24°C )條件下強(qiáng)于37°C和4°C條件下的 熒光強(qiáng)度。故在實(shí)際檢測(cè)中，建議在室溫（24°C )條件下進(jìn)行孵育實(shí)驗(yàn)。
[0077] 實(shí)施例3萊姆病患者血清樣本檢測(cè)
[0078] 將88例臨床確診為伯氏疏螺旋體感染的萊姆病患者血清分別點(diǎn)樣于含有孵育濃 度為50 y g/mL的伯氏疏螺旋體重組鞭毛抗原的探針的芯片的88個(gè)孔上，另外4個(gè)孔點(diǎn)樣 液為臨床確診未感染伯氏疏螺旋體的健康人血清，其余4個(gè)孔點(diǎn)樣液為PBST-BSA溶液，常 溫條件下孵育1小時(shí)，取出后用PBST清洗3次，每次2分鐘，氮?dú)獯蹈?。在另一相同芯片?做相同操作。再分別將1:2500稀釋的Cy3標(biāo)記驢抗人IgG抗體和1:2500稀釋的Cy3標(biāo)記 山羊抗人IgM抗體溶于PBST-BSA溶液后點(diǎn)樣于兩個(gè)孵育有抗體的芯片之上，取出用PBST 清洗3次，每次2分鐘，氮?dú)獯蹈?。使用芯片掃描儀對(duì)芯片進(jìn)行掃描。結(jié)果分別顯示為圖8 和圖9。從圖中可以看出：在實(shí)際檢測(cè)臨床已診斷為萊姆病患者的血清中，陽性患者的血清 的熒光強(qiáng)度與健康人群的血清以及PBST-BSA點(diǎn)樣的熒光強(qiáng)度之間存在著明顯的差異性。 說明該芯片在實(shí)際診斷伯氏疏螺旋體感染的抗鞭毛抗體的血清學(xué)檢測(cè)中有著良好的應(yīng)用。
[0079] 實(shí)施例4可重復(fù)性實(shí)驗(yàn)
[0080] 表1為組內(nèi)可重復(fù)性實(shí)驗(yàn)，每32個(gè)孔作為一組，共三組，按照步驟孵育濃度為 50 y g/mL的伯氏疏螺旋體重組鞭毛抗原、濃度為50 ii g/mL的兔抗伯氏疏螺旋體鞭毛抗原 IgG抗體和濃度為2500 ii g/mL的Cy3標(biāo)記山羊抗兔IgG抗體。
[0081] 表 1
[0082]

【權(quán)利要求】
1. 一種用于萊姆病鞭毛抗原免疫血清學(xué)診斷的蛋白質(zhì)芯片，其特征在于：在固相載體 表面點(diǎn)陣固定有伯氏疏螺旋體重組鞭毛抗原探針；所述固相載體為16-氨基-1-十六烷硫 醇修飾的金箔芯片，在所述16-氨基-1-十六烷硫醇上結(jié)合有4-(N-馬來酰亞胺基甲基） 環(huán)己烷-1-羧酸琥珀酰亞胺酯和4-(二甲氨基）吡啶。
2. -種權(quán)利要求1所述的用于萊姆病鞭毛抗原免疫血清學(xué)診斷的蛋白質(zhì)芯片的制備 方法，其特征在于按如下步驟進(jìn)行： 步驟1 :對(duì)金箔芯片進(jìn)行表面化學(xué)修飾，獲得固相載體 以濃度為〇. 8mM的16-氨基-1-十六烷硫醇的乙醇溶液為修飾液1，以lOOmg 4-(N-馬 來酰亞胺基甲基）環(huán)己烷-1-羧酸琥珀酰亞胺酯與50mg 4-(二甲氨基）吡啶溶于10mL N，N-二甲基甲酰胺構(gòu)成的混合液為修飾液2 ;對(duì)金箔芯片進(jìn)行清洗后，浸入所述修飾液1 中，黑暗條件下室溫?fù)u蕩孵育12小時(shí)，取出后用無水乙醇溶液清洗、氮?dú)獯蹈?；然后再浸?所述修飾液2之中，黑暗條件下室溫?fù)u蕩孵育12小時(shí)，取出后依次用N，N-二甲基甲酰胺和 PBST溶液清洗、氮?dú)獯蹈桑@得固相載體待用；所述PBST溶液是由磷酸緩沖液PBS與Tween 20混合構(gòu)成，在所述PBST溶液中Tween 20的濃度為0. 01M ; 步驟2 :固定伯氏疏螺旋體重組鞭毛抗原探針 將伯氏疏螺旋體重組鞭毛抗原溶于PBST-BSA溶液中，配制濃度不低于12. 5 y g/mL的 蛋白溶液； 將固相載體浸于所述蛋白溶液中，在4°C?37°C孵育0. 5?12h，取出后用PBST溶液清 洗、氮?dú)獯蹈?，即得用于萊姆病免疫血清學(xué)診斷的蛋白質(zhì)芯片； 所述PBST-BSA溶液是由磷酸緩沖液PBS、Tween 20及胎牛血清BSA混合構(gòu)成，在所述 PBST-BSA溶液中Tween 20的濃度為0. 01M，胎牛血清BSA的質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為0. 1%。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于：步驟1對(duì)金箔芯片進(jìn)行清洗的方法 為：將NH3、H202及H20按體積比1 :1 :5混合構(gòu)成TL1清洗液，將金箔芯片浸入盛有TL1清洗 液的不銹鋼清洗盒內(nèi)，82°C水浴6分鐘，清洗2次，取出之后用超純水沖洗，再用無水乙醇清 洗，最后用氮?dú)獯蹈伞?br> 4. 權(quán)利要求1所述用于萊姆病鞭毛抗原免疫血清學(xué)診斷的蛋白質(zhì)芯片的使用方法，其 特征在于： 將Cy3標(biāo)記驢抗人IgG抗體溶于PBST-BSA溶液中，構(gòu)成濃度不低于4. 9 y g/mL的IgG 熒光二抗溶液； 將Cy3標(biāo)記山羊抗人IgM抗體溶于PBST-BSA溶液中，構(gòu)成濃度不低于4. 9 y g/mL的 IgM熒光二抗溶液； 將待診斷患者血清點(diǎn)樣于所述蛋白質(zhì)芯片的任意兩個(gè)伯氏疏螺旋體重組鞭毛抗原探 針上，常溫條件下孵育抗體1小時(shí)，取出后用PBST溶液清洗、氮?dú)獯蹈桑? 將所述IgG熒光二抗溶液和所述IgM熒光二抗溶液分別點(diǎn)樣于一個(gè)孵育有抗體的探針 之上，然后用PBST溶液清洗、氮?dú)獯蹈桑? 若探針處呈現(xiàn)熒光色，則待診斷患者血清中含有抗鞭毛抗原IgG抗體或抗鞭毛抗原 IgM抗體，若探針處無熒光色，則待診斷患者血清中不含抗鞭毛抗原IgG抗體或抗鞭毛抗原 IgM抗體； 所述PBST溶液是由磷酸緩沖液PBS與Tween 20混合構(gòu)成，在所述PBST溶液中TWeen20 的濃度為0. 01M ; 所述PBST-BSA溶液是由磷酸緩沖液PBS、Tween 20及胎牛血清BSA混合構(gòu)成，在所述 PBST-BSA溶液中Tween 20的濃度為0. 01M，胎牛血清BSA的質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為0. 1%。
5. -種用于萊姆病鞭毛抗原免疫血清學(xué)診斷的試劑盒，其特征在于：包含權(quán)利要求 1所述的蛋白質(zhì)芯片、PBST-BSA溶液、將Cy3標(biāo)記驢抗人IgG抗體溶于PBST-BSA溶液中， 構(gòu)成的濃度不低于4. 9 y g/mL的IgG熒光二抗溶液和將Cy3標(biāo)記山羊抗人IgM抗體溶于 PBST-BSA溶液中，構(gòu)成濃度不低于4. 9 y g/mL的IgM熒光二抗溶液； 所述PBST-BSA溶液是由磷酸緩沖液PBS、Tween 20及胎牛血清BSA混合構(gòu)成，在所述 PBST-BSA溶液中Tween 20的濃度為0. 01M，胎牛血清BSA的質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為0. 1%。
【文檔編號(hào)】G01N33/68GK104374921SQ201410676478
【公開日】2015年2月25日 申請(qǐng)日期:2014年11月21日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月21日
【發(fā)明者】杜衛(wèi)東, 葉雷 申請(qǐng)人:安徽醫(yī)科大學(xué)